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微生物学报

  • 2023年第9期文章目次
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      2023, 63(9):0-0.

      摘要 (65) HTML (143) PDF 33.37 M (176) 评论 (0) 收藏

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      2023, 63(9):0-0.

      摘要 (75) HTML (153) PDF 182.17 K (243) 评论 (0) 收藏

      摘要:

    • >综述
    • 好氧氨氧化过程中的关键酶及N2O排放研究进展

      2023, 63(9):3321-3334. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20220933

      摘要 (229) HTML (596) PDF 540.30 K (525) 评论 (0) 收藏

      摘要:氧化亚氮(nitrous oxide, N2O)排放量的持续增加对全球生态平衡造成了严重的威胁。微生物N2O排放占主要来源。其中,好氧氨氧化过程是氨在有氧的条件下氧化为亚硝酸盐,其直接或间接地影响着全球产生N2O与释放量。氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)、氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)、全程氨氧化菌(complete ammonia oxidization, Comammox)和异养氨氧化菌(heterotrophic ammonium oxidizing bacteria, HAOB)是氨氧化过程中主要的参与者,明确这四类微生物N2O产生的机制对缓解全球N2O排放是必要的。本文综述了AOA、AOB、Comammox和HAOB在好氧氨氧化过程中驱动的N2O产生途径,并结合酶学分析了一些关键酶在N2O产生途径中的作用。本文旨在为调控生物N2O排放提供理论基础。

    • 丝状真菌杀松材线虫代谢产物研究进展

      2023, 63(9):3335-3349. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20220940

      摘要 (163) HTML (526) PDF 1.06 M (387) 评论 (0) 收藏

      摘要:松材线虫病是破坏我国森林生态系统最为严重的病害,具有极强的传播性和破坏性,防治此种病害迫在眉睫。基于对物理和化学方式防治松材线虫的研究,对环境友好度最高的生物防治具有更广的研究前景。丝状真菌及其次级代谢产物,来源于自然,与传统的化学杀线虫药剂相比,对环境影响较小,针对松材线虫的致死作用更为专一,因此,从丝状真菌的次级代谢产物中分离获得杀松材线虫活性产物并测定其结构和活性,对于松材线虫病的防治具有重要意义。本文对丝状真菌产生的具有杀松材线虫活性产物的结构、活性展开综述,发现近二十年共有57个活性产物被发现,且结构多种多样,活性差别较大,为了更好地开展此领域的研究,本文对所有产物的结构和活性进行了系统总结,最后又对该领域的研究进行了总结和展望,以期对松材线虫病的生物防治和丝状真菌杀松材线虫次级代谢产物的深入研究提供参考。

    • 人源札幌病毒抗原多样性及遗传进化研究进展

      2023, 63(9):3350-3359. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230007

      摘要 (157) HTML (375) PDF 870.79 K (339) 评论 (0) 收藏

      摘要:人源札幌病毒(human sapovirus, HuSaV)是全球范围内引起散发性急性胃肠炎和相关疫情的重要病原,尤其对婴幼儿及免疫缺陷患者等高危人群存有致死的危险,人源札幌病毒具有丰富的抗原和遗传多样性,其抗原多样性及免疫原性主要位于P2亚结构域,并且衣壳蛋白免疫原性是人源札幌病毒疫苗研发的理论基础。由于人源札幌病毒可以耐受高衣壳突变而不失去病毒功能使它得以迅速进化,其在宿主体内进化过程中存在连续的氨基酸突变,且突变主要在VP1的P结构域内积累,少见于非结构蛋白和VP2中。序列和结构的改变使得人源札幌病毒逃脱先前存在的群体免疫,有必要进一步探索人源札幌病毒的免疫逃逸机制及其拮抗宿主的免疫应答。因此,本文针对人源札幌病毒在基因组特征、抗原多样性特点、遗传进化机制等领域的研究进展进行了系统综述,并对未来研究中亟待解决的科学问题进行了展望。

    • 嗜黏蛋白阿克曼氏菌治疗疾病的潜力与作用机制研究进展

      2023, 63(9):3360-3373. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230011

      摘要 (174) HTML (726) PDF 577.29 K (438) 评论 (0) 收藏

      摘要:嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila, AKK)可促进肠道黏液分泌,维持肠道黏液动态平衡,调节肠黏膜屏障功能,在机体代谢调节、免疫应答中发挥重要作用。AKK对肠道炎症、神经炎症、机体代谢紊乱和癌症等疾病具有显著改善作用,被视为极具潜力的下一代益生菌。本文分别从消化系统、神经系统、代谢性紊乱和癌症等角度入手,系统概述AKK在疾病治疗中的潜力及作用分子机制。

    • 细菌感染与胸腺结构和功能变化的研究进展

      2023, 63(9):3374-3385. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230016

      摘要 (118) HTML (588) PDF 554.90 K (256) 评论 (0) 收藏

      摘要:胸腺是负责T细胞发育分化成熟的中枢免疫器官,除了增龄性胸腺衰退,临床放疗及化疗、感染及肿瘤等因素也是导致胸腺变化的重要原因,胸腺变化包括胸腺结构,胸腺细胞数量与组成以及胸腺功能的变化。本文着重对细菌感染导致的胸腺变化及其相应机制进行综述,并对减轻感染引起的胸腺损伤的策略进行小结,以期为预防或逆转感染引起的胸腺损伤提供一定的临床参考。

    • 微生物有机酸转运蛋白的研究进展

      2023, 63(9):3386-3408. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230034

      摘要 (221) HTML (406) PDF 751.42 K (436) 评论 (0) 收藏

      摘要:转运蛋白是一类膜蛋白,可介导生物膜内外化学物质的跨膜转运及信号交换。有机酸转运蛋白在微生物有机酸代谢的跨膜转运过程中发挥重要作用,根据转运蛋白有机酸转运的方向不同可以分为摄取转运蛋白和外排转运蛋白。在微生物代谢中,有些有机酸可以作为能源直接参与体内代谢,有些是能量转换过程中的重要中间产物;摄取转运蛋白的过表达,可以促进微生物细胞获取能源物质,高效的生产目标产物;有机酸摄取转运蛋白敲除或外排转运蛋白表达,有利于底盘细胞外排更多目标产物,进而促进有机酸的生物合成。研究有机酸转运蛋白的结构和功能,有助于解析微生物细胞有机酸生物合成及利用的机制,对于提高工业微生物对有机酸的利用及生物合成具有重要作用。本文综述了微生物有机酸转运蛋白分类和结构、转运方式和转运功能等方面,重点综述了转运蛋白在有机酸生产中的应用,为工业微生物有机酸的高效生物合成及未来发展提供参考。

    • 酵母中葡萄糖阻遏作用机制研究进展

      2023, 63(9):3409-3427. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230042

      摘要 (155) HTML (401) PDF 561.46 K (414) 评论 (0) 收藏

      摘要:大多数微生物通过一种复杂的机制来感知和传递环境中的葡萄糖变化并对其做出适当的反应。酵母细胞中,葡萄糖主要通过Snf1/Mig1信号通路来阻遏三羧酸循环、糖异生、乙醛酸循环和替代碳源代谢等相关基因的转录表达。木糖、半乳糖、蔗糖、乙醇和有机酸等替代碳源只有当环境中的葡萄糖消耗殆尽后才能重启代谢编程,进行替代碳源的利用。而葡萄糖去抑制对于提高现代微生物工业生产效率、解决环境与能源问题具有重要意义。本文综述了Snf1/Mig1信号通路阻遏机制以及相关转录因子的活性位点,具体介绍了多种替代碳源的应用以及其受葡萄糖阻遏的具体机制,总结提出了根据不同背景缓解或解除碳代谢阻遏的策略,以期为酵母菌现代化生产应用范围的扩大和效率的提高提供新思路。

    • 细菌VI型分泌系统效应蛋白的装配及功能的研究进展

      2023, 63(9):3428-3440. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230055

      摘要 (126) HTML (325) PDF 5.81 M (374) 评论 (0) 收藏

      摘要:蛋白分泌作为细胞之间传递信号的途径之一,在微生物生存竞争中也扮演着重要的角色。革兰氏阴性菌可以通过VI型分泌系统(type VI secretion system, T6SS)将效应蛋白传递至胞外或原核和真核微生物中,从而介导微生物间的竞争或宿主-细菌的相互作用,最终建立竞争优势。本文主要总结了T6SS的结构与组成,并重点对效应蛋白的装配以及其与免疫蛋白的作用机制的研究进展进行阐述,为以后靶向T6SS抗菌药物的研制提供新思路。

    • 蜱传脑炎病毒非结构蛋白NS2B-NS3与NS5的研究进展

      2023, 63(9):3441-3454. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230056

      摘要 (61) HTML (757) PDF 6.16 M (368) 评论 (0) 收藏

      摘要:蜱传脑炎病毒是引起严重的中枢神经系统疾病蜱传脑炎的病原体,每年在欧洲、俄罗斯远东地区、日本和中国北部报道的蜱传脑炎病例数约为10 000‒12 000例,且在我国和多个欧洲国家的发病率逐渐增高,正成为人类健康的潜在危害。主动免疫是预防蜱传脑炎的有效措施,包括我国在内的多个国家已研制出安全性较高的疫苗,但在我国流行省份的疫苗接种较为有限,特异性抗病毒药物的研发或许是治疗蜱传脑炎病毒感染的研究方向之一。蜱传脑炎病毒非结构蛋白NS2B-NS3与NS5因为在病毒基因组复制、加帽和宿主免疫调节中的重要作用,成为关键的抗病毒药物研发靶点。本文综述了蜱传脑炎病毒非结构蛋白NS2B-NS3与NS5的三维结构和抑制剂研发工作,为深入探究该病毒感染的分子机制和抗病毒药物研发提供参考。

    • 基于益生菌治疗帕金森病的研究进展

      2023, 63(9):3455-3463. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230061

      摘要 (189) HTML (591) PDF 494.55 K (423) 评论 (0) 收藏

      摘要:帕金森病是常见的神经退行性疾病,其发病原因至今尚未明确,目前的治疗方法价格昂贵、效果差且副作用大。帕金森病患者常见胃肠道功能障碍,帕金森病和肠道菌群之间的关联已得到实验证实,患者有望通过益生菌改善肠道菌群达到治疗的目的。工程益生菌的出现使得人们可以按照自己的意愿改造益生菌,提高其稳定性和靶向性,展现出其特有的应用潜力。本文将从益生菌治疗帕金森病的研究现状出发,阐述益生菌治疗帕金森病的可能机制,进一步分析工程益生菌治疗帕金森病的可行性,为该疾病的安全治疗提供新的思路。

    • 肠道菌群及其代谢产物对心肌纤维化影响与治疗的研究进展

      2023, 63(9):3464-3481. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230063

      摘要 (140) HTML (632) PDF 633.74 K (378) 评论 (0) 收藏

      摘要:心肌纤维化是多种心血管疾病,如冠心病、心肌梗死和心力衰竭等的终末期表现和主要致病因素。研究发现,免疫和炎症过程在心肌纤维化的发病机制中起决定性作用。近年来,人们发现肠道微生物在心肌纤维化的发病机制和发展中起着至关重要的作用。肠道菌群的失调可导致微生物的代谢产物转移到血液循环中,如短链脂肪酸、脂多糖和氧化三甲胺等。这些代谢物直接或间接地诱导组织损伤免疫和激活全身炎症反应,进而影响心肌纤维化。如何改变肠道菌群来改善心肌纤维化已成为当前的研究重点,包括饮食干预、使用抗生素、补充益生菌和益生元,以及粪便微生物群移植等。本综述旨在回顾肠道菌群及其代谢产物与心肌纤维化的相互作用,介绍通过干预肠道菌群改善心肌纤维化的研究进展,为心肌纤维化的治疗提供新思路。

    • 乳杆菌胞外多糖合成基因簇及构效关系

      2023, 63(9):3482-3499. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230219

      摘要 (132) HTML (485) PDF 1.35 M (359) 评论 (0) 收藏

      摘要:肠道菌群稳态对维护人体的健康具有至关重要的作用。作为肠道天然微生物群"守卫兵",益生菌参与改善体内微生态平衡。乳杆菌(Lactobacillus)是一种肠道益生菌的代表,其合成的胞外多糖(exopolysaccharide, EPS)既可通过增益肠道内其他益生菌的生长来优化肠道微生态,还具有抗肿瘤、抗氧化、降胆固醇、降血压和增强机体免疫力等益生功能。本文对近年来乳杆菌胞外多糖的遗传、生物学活性、构效关系等方面的研究进展,进行综述和展望。

    • 铜绿假单胞菌群体感应信号分子PQS的功能多样性研究进展

      2023, 63(9):3500-3519. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230344

      摘要 (185) HTML (495) PDF 895.65 K (317) 评论 (0) 收藏

      摘要:铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种革兰氏阴性条件致病菌,可对免疫功能低下或损伤的患者造成持续性感染。铜绿假单胞菌能成功感染离不开其自身产生的毒力因子,而这些毒力因子大多数都受群体感应系统(quorum sensing, QS)调控。铜绿假单胞菌有4个QS系统,分别为las系统、rhl系统、pqs系统和iqs系统。2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮(Pseudomonasquinolone signal, PQS)作为铜绿假单胞菌pqs系统的信号分子,不仅能够调控许多毒力因子的表达,也能够影响一些微生物和宿主的多种生理过程。本文总结了PQS多种生物学功能,如介导QS系统、调控生物被膜形成、介导外膜囊泡产生及铁摄取、调节宿主免疫活性、介导细胞毒性作用,以及提供种群保护等。本文旨在突出铜绿假单胞菌PQS的功能多样性,并为PQS新功能研究和抗菌药物的研发提供指导。

    • >研究报告
    • 醌那霉素生物合成中间产物的一锅酶促体系研究

      2023, 63(9):3520-3533. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20220928

      摘要 (139) HTML (445) PDF 1.04 M (348) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】 通过一锅酶法在体外无细胞条件下重构醌那霉素的生物合成途径,实现从原料辅酶A、乙酰-辅酶A和丙二酸到醌那霉素重要中间体的高效转化。【方法】 纯化得到AlpAB、RavC等8个醌那霉素合成相关蛋白和MCAT、MatB等2个辅助蛋白;利用一锅酶法进行体外反应,并用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)检测反应产物;利用该体系探究Ⅱ型硫酯酶AlpS在合成通路中的功能及作用底物;利用单一变量法对体系温度、pH、最小聚酮合酶(minimal polyketide synthase, minimal PKS)浓度和Ⅱ型硫酯酶AlpS浓度等条件进行优化。【结果】 体系所需的聚酮合酶和辅助蛋白均获得可溶性表达;利用一锅酶法成功合成了醌那霉素的早期重要中间体SEK15、UWM6、rabelomycin、prejadomycin和dehydrorabelomycin;加入AlpS蛋白后以上5种产物产量均有不同程度的提高,其中prejadomycin和dehydrorabelomycin提高较为显著;优化后的反应最适条件为:温度30℃、pH 7.0、最小聚酮合酶(AlpA、AlpB和RavC)浓度各2.8 μmol/L、AlpS 7.2 μmol/L;prejadomycin的产量提高到302 mg/L。【结论】 本研究成功利用一锅酶法在无细胞条件下重构了醌那霉素的早期生物合成途径,合成了醌那霉素的重要中间体SEK15、UWM6、rabelomycin、prejadomycin和dehydrorabelomycin。研究进一步验证了硫酯酶AlpS的链释放功能并推测其作用底物。

    • 新生隐球菌半胱氨酸转运蛋白Mup1鉴定及其表达调控研究

      2023, 63(9):3534-3545. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20220934

      摘要 (99) HTML (369) PDF 834.12 K (412) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】 鉴定新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)的半胱氨酸转运蛋白及其对致病性的影响。【方法】 构建候选基因敲除株,检测突变株以半胱氨酸为唯一硫源的生长情况;检测半胱氨酸转运蛋白Mup1对新生隐球菌毒力因子表达和不同胁迫条件下生长的影响;通过新生隐球菌大蜡螟(Galleria mellonella)和小鼠感染模型分析Mup1对致病性的影响;通过转录组分析和酵母单杂交研究硫代谢核心转录因子Cys3与Mup1的调控关系。【结果】 Mup1具有转运半胱氨酸、胱氨酸、胱硫醚和同型半胱氨酸的能力。基因MUP1缺失不影响毒力因子表达和细胞对应激的反应。大蜡螟和小鼠隐球菌感染模型表明Mup1对新生隐球菌的致病性无显著影响。转录组分析和酵母单杂交实验显示Cys3可能间接调控MUP1的转录。【结论】 新生隐球菌Mup1具有转运半胱氨酸、胱氨酸、胱硫醚和同型半胱氨酸的功能,但不影响致病性,基因转录可能受Cys3的间接调控。

    • 撕裂蜡孔菌HG2011对光叶紫花苕结瘤固氮的影响及其潜在机制

      2023, 63(9):3546-3559. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20220942

      摘要 (118) HTML (456) PDF 852.50 K (248) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】 在我国南方尤其是西南地区,光叶紫花苕(Vicia villosa Roth.)作为重要的青饲和绿肥两用豆科作物被广泛种植,有助于提高土壤氮素和后茬作物的产量品质。接种有益微生物是促进豆科作物生物固氮和生长的重要措施之一。为此,本文研究了一株自主分离获得的白腐真菌¾¾撕裂蜡孔菌(Careporia lacerata HG2011)对光叶紫花苕结瘤固氮和生长的影响,并揭示其潜在机制。【方法】 采用微生物培养、植物培养和田间试验,研究C. lacerata磷铁活化能力、代谢产物构成、与根瘤菌Rhizobium sophorae S3的相互作用,及其对光叶紫花苕结瘤、生长、产量、品质和土壤有效磷铁的影响。【结果】 C. lacerata和根瘤菌之间无拮抗作用。液相色谱-质谱(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)分析发现,C. lacerata发酵液含有氨基酸、有机酸和类黄酮等化感物质,能增强根瘤菌的趋化性并促进生物膜形成。此外,C. lacerata还能释放生长素、赤霉素、水杨酸和铁载体,活化难溶性有机和无机磷。在植物培养试验中,单独接种C. lacerata或根瘤菌均能促进光叶紫花苕生长,但以共接种处理效果最佳。C. lacerata定殖于光叶紫花苕根际,导致根长、根系表面积和结瘤数显著增加。田间试验发现,接种C. lacerata显著提高了光叶紫花苕单株根瘤数、根瘤质量和固氮酶活性,以及土壤有效磷铁含量和磷酸酶活性,产量比常规施肥处理增加12.15%且品质无显著变化。【结论】 C. lacerata能够在光叶紫花苕根际定殖,通过分泌化感物质、生长素和活化土壤磷铁等机制促进结瘤固氮和生长发育。C. lacerata易于培养,菌剂制备成本低廉,施用简便,对提高豆科作物产量品质具有一定应用价值。

    • 绿色木霉组蛋白去乙酰化酶编码基因TvRpd3在木霉生物防治作用中的功能分析

      2023, 63(9):3560-3573. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230006

      摘要 (89) HTML (465) PDF 964.65 K (307) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】 本文借助基因编辑技术在具有生物防治潜力的绿色木霉(Trichoderma viride)中敲除组蛋白去乙酰化酶编码基因TvRpd3,来研究TvRpd3基因及其编码蛋白在提高木霉病原菌拮抗能力中的作用。【方法】 利用融合PCR和同源重组策略构建了TvRpd3基因缺失的突变菌株,通过对峙培养、表型观察、免疫组化检测、代谢组学分析等系统比较TvRpd3基因敲除前后菌株的组蛋白乙酰化修饰水平、次级代谢产物合成、病原菌拮抗能力以及田间防治效果等。【结果】 与野生型菌株相比,缺失TvRpd3基因的木霉工程菌(∆TvRpd3)对多种病原菌表现出了更强的对峙抑制效果,其所产的发酵液对小麦白粉病、烟草黑胫病和番茄枯萎病的防治效果分别提高了62.27%、57.45%和70.71%。同时,敲除TvRpd3基因也显著改变了木霉工程菌所产次级代谢产物的种类和产量,抗生性物质的产量大幅提高。【结论】 绿色木霉TvRpd3基因及其介导的组蛋白乙酰化修饰在提高绿色木霉生物防治中起着重要作用。

    • 乙酰基转移酶毒素SsGNAT影响猪链球菌的黏附能力

      2023, 63(9):3574-3590. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230010

      摘要 (113) HTML (274) PDF 853.82 K (226) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】 猪链球菌(Streptococcus suis)是一种重要的人畜共患病病原,本研究旨在鉴定猪链球菌乙酰基转移酶毒素类毒素-抗毒素系统,并对其毒素功能进行分析,探讨猪链球菌毒素-抗毒素系统在细菌感染过程中发挥的作用。【方法】 前期预测猪链球菌血清型5型菌株HN105基因组中假定的Ⅱ型毒素-抗毒素系统。进一步鉴定毒素-抗毒素系统的活性并分析该毒素-抗毒素系统的遗传进化关系;运用Western blotting揭示毒素在猪链球菌内的表达情况。同时以HN105为亲本株,构建毒素缺失株、抗毒素缺失株以及毒素-抗毒素缺失株,研究该系统对猪链球菌黏附能力、生物被膜形成能力、抗吞噬与胞内存活能力的影响。【结果】 预测并鉴定出猪链球菌血清型5型菌株HN105基因组中DF184_RS00980-DF184_RS00985编码的乙酰基转移酶(Gcn5-related N-acetyltransferase, GNAT)毒素类毒素-抗毒素系统,根据保守结构域将该系统命名为SsMarR-SsGNAT。SsGNAT毒素在大肠杆菌(Escherichia coli)的周质间隙发挥毒性作用,且抗毒素可以中和毒素的毒性;猪链球菌SsGNAT毒素与目前已鉴定的乙酰基转移酶毒素氨基酸序列一致性较低且亲缘关系较远;SsGNAT毒素在猪链球菌内存在被切割的现象,且抗毒素表达量降低可上调SsGNAT毒素的表达量;SsGNAT毒素对猪链球菌的生物被膜形成能力、抗吞噬与胞内存活能力无影响,但可影响猪链球菌对人喉癌上皮细胞(human laryngeal cancer epithelial cells, Hep-2)和人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells, HBMEC)的黏附能力。【结论】 发现并鉴定了猪链球菌中新的Ⅱ型毒素-抗毒素系统SsMarR-SsGNAT,SsGNAT毒素在大肠杆菌周质间隙发挥毒性作用,缺失后导致细菌对细胞的黏附水平显著上升,该发现为进一步揭示猪链球菌的致病机制提供参考。

    • 荧光假单胞菌2P24中opgGH基因影响抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚的产生

      2023, 63(9):3591-3601. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230018

      摘要 (138) HTML (380) PDF 980.43 K (506) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】 抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinol, 2,4-DAPG)是生防菌株荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) 2P24防治植物病害的关键因子,然而对2,4-DAPG生物合成的调控通路并未完全解析。【方法】 前期利用Tn5随机突变的方法获得一株对棉花立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)拮抗能力完全丧失的突变菌株W3,本研究利用基因互补等方法研究该突变体中被破坏的基因对菌株2P24分泌2,4-DAPG和其他生防相关性状的影响。【结果】 Tn5插入位点及其序列分析表明突变菌株W3中Tn5破坏了opgG基因。鉴于opgGopgH基因组成操纵子,利用同源重组技术构建了opgGH内缺失突变菌株。与野生菌株2P24相比,opgGH突变菌株中2,4-DAPG的产量显著降低。对其他生防相关性状的检测发现,突变opgGH基因并不影响群体感应系统(quorum sensing, QS)信号分子的产生、氢氰酸的产生以及生物膜的形成,但可抑制菌株2P24的游动性。转录融合实验进一步表明opgGH基因并不调控gacA基因及其调控的小RNA分子编码基因的表达,这些结果表明opgGH基因可能不通过Gac/Rsm信号通路影响2,4-DAPG的产生。另外,高渗透势条件下,菌株2P24可通过opgGH基因调控2,4-DAPG的产生。【结论】 菌株2P24中opgGH基因正调控抗生素2,4-DAPG的产生、游动性以及抑菌能力,是该菌株中一个与生防性状相关的重要调控因子。

    • 双碱性氨基酸内肽酶末端剪切修饰显著提高酶活及其高效水解大豆蛋白

      2023, 63(9):3602-3615. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230019

      摘要 (80) HTML (418) PDF 973.27 K (325) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】 将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤亚库德里亚夫泽维(Pichia kudriavzevii)来源的双碱性氨基酸内肽酶基因sckex2pkkex2克隆到大肠杆菌(Escherichia coli) BL21中,实现双碱性氨基酸内肽酶的异源表达,研究重组酶的酶学性质及其与碱性蛋白酶的协同高效水解大豆蛋白释放出小分子活性肽的作用。【方法】 按照大肠杆菌的密码子偏好性,对S. cerevisiaeP. kudriavzeviikex2基因进行优化,分析KEX2蛋白的非功能区域,对其C-末端、N-末端氨基酸进行剪切修饰获得4种突变酶基因sckex2∆3sckex2∆4pkkex2∆3pkkex2∆4,构建在载体pGEX-6P-1上,转入E. coli BL21感受态细胞中,经DNA测序验证,获得重组菌株E. coli BL21/pGEX-ScKEX2∆3、E. coli BL21/pGEX-ScKEX2∆4、E. coli BL21/pGEX-PkKEX2∆3和E. coli BL21/pGEX-PkKEX2∆4。利用GST亲和层析柱和PreScission蛋白酶对重组酶进行分离纯化,研究纯酶pH和温度稳定性等酶学性质。以碱性蛋白酶单独水解大豆分离蛋白为对照,重组双碱性氨基酸内肽酶与碱性蛋白酶协同水解大豆蛋白,测定水解产物中小分子活性肽组分。【结果】 重组双碱性氨基酸内肽酶野生型和突变酶在E. coli BL21中可溶性表达,SDS-PAGE分析表明纯化的重组酶显示单一条带,在最适条件下,野生型酶几乎没有酶活,突变体最高比酶活达到47.32 U/g,Km值为23.61μmol/L,kcat值为50.18 s−1,kcat/Km值为2 125.06 L/(mmol·s)。当重组酶在pH 5.0孵育2 d后,相对酶活力保留最高为40%以上。在35℃下孵育1 h后酶活力仍能保留60%以上。重组双碱性氨基酸内肽酶与碱性蛋白酶协同水解大豆分离蛋白,水解产物中超过39%为分子量小于500 Da的活性肽,且分子量小于100 Da的活性肽的含量比碱性蛋白酶单独水解时高50%。【结论】 通过末端剪切修饰,获得在大肠杆菌中可溶性表达的双碱性氨基酸内肽酶截短突变体,其重组酶催化效率高,能够高效水解大豆蛋白获得活性小分子肽,该研究为富含蛋白质生物资源的增值及高效水解奠定了坚实的研究基础。

    • 日化产品中洋葱伯克霍尔德氏菌复合群(Bcc)的分类和神秘伯克霍尔德氏菌的耐药性研究

      2023, 63(9):3616-3627. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230022

      摘要 (125) HTML (726) PDF 771.47 K (307) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】 对从2020–2022年不同日化产品中分离的29株洋葱伯克霍尔德氏菌复合群(Burkholderia cepacia complex, Bcc)进行分类和分型,另将2020年前来源于日化产品中6株被鉴定为Burkholderia lata的菌株进行分类更正。探究神秘伯克霍尔德氏菌(Burkholderia aenigmatica)的耐药性。【方法】 本文主要应用多位点分型研究方法(multilocus sequence typing, MLST),PCR扩增atpDgltBgyrBrecAlepAphaCtrp B 7个管家基因片段,将测序结果与MLST数据库中的数据比对分析,获得菌株各管家基因的编号和ST型(sequence type),对本检测中心分离自日化产品的Bcc进行分型;利用多位点序列分析(multilocus sequence analysis, MLSA),结合MLST中等位基因的核苷酸序列构建进化树,从而对Bcc进行系统发育分析和鉴定。利用最小抑菌浓度法(minimum inhibitory concentration, MIC)测定Bcc对常见防腐剂(1,3-二羟甲基-5,5-二甲基乙内酰脲、卡松、苯甲酸钠、山梨酸钾)和抗生素(头孢他啶、卡那霉素、四环素)的耐药性。【结果】 本文29株Bcc菌株共有5个菌种类型(B. cenocepaciaB. contaminansB. aenigmaticaB. vietnamiensisB. stabilis)和15个不同分型,分类过程中发现了7个新等位基因,7个新ST分型(ST2118、ST2120、ST2122、ST2127、ST2128、ST2129和ST2130)并鉴定了其种类。另将2020年前来源于样品中6株被鉴定为Burkholderia lata的菌株用MLST法重新分类鉴定,其鉴定结果均为Burkholderia aenigmatica。11株B. aenigmatica分离株中只有1株对头孢他啶耐药,其他菌均对其不耐药,分别有9株和8株B. aenigmatica对卡那霉素和四环素耐药。卡松和1,3-二羟甲基-5,5-二甲基乙内酰脲(1,3-dimethylmethylol-5,5-dimethylhydantoin, DMDMH)在最大允许量范围内能有效抑制B. aenigmatica的生长,有9株B. aenigmatica表现出苯甲酸钠和山梨酸钾的耐药性。【结论】 Bcc的分类较为复杂且存在许多未知等位基因和分型,Burkholderia aenigmatica已经成为污染日化产品的主要Bcc菌株。大部分B. aenigmatica对氨基糖苷类和四环素类抗生素具有耐药性,大部分来自日化产品中的B. aenigmatica对苯甲钠和山梨酸钾均具有耐药性。

    • 基于CRISPR/Cas13a的金黄色葡萄球菌mecA耐药基因检测方法的建立

      2023, 63(9):3628-3640. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230029

      摘要 (164) HTML (571) PDF 752.08 K (488) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】 针对目前耐药基因检测通常需要依赖专业检测设施和设备,仍缺乏耐药基因快速检测方法这一问题,旨在建立一种基于成簇规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) mecA耐药基因快速检测方法。【方法】 首先在mecA基因序列的保守区中设计筛选出灵敏度较高的重组酶介导链替换核酸扩增(recombinase aided amplification, RAA)引物和CRISPR RNA (CRISPR RNA, crRNA),通过结合消线法核酸检测试纸技术(easy-readout and sensitive enhanced, ERASE)建立针对mecA基因的检测方法,最后利用模拟样本及临床分离样本对建立的新方法与传统方法进行比较。【结果】 成功筛选出了1组针对mecA耐药基因的高效扩增引物和crRNA,并建立了基于CRISPR-ERASE的mecA耐药基因高灵敏核酸检测方法,最低检出限为10 copies/μL,在32株临床分离的金黄色葡萄球菌中,该方法共检出24株mecA耐药基因阳性菌株,与药敏试验及荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qPCR)检测结果符合率为100%。【结论】 建立了一种基于CRISPR-ERASE核酸检测试纸技术的简单、高灵敏的mecA耐药基因检测方法。

    • 人体肠道细菌寡营养培养组条件的优化研究

      2023, 63(9):3641-3652. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230039

      摘要 (160) HTML (436) PDF 1.04 M (334) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】 探讨寡营养对人体肠道细菌培养组的条件。【方法】 通过稀释富集培养基、固体平板和增菌肉汤培养基成分获得寡营养培养基。对健康人粪便样本分别用原液(0)、5、10、20、30和40倍稀释的富集培养基(添加羊血和瘤胃液的血培养瓶)连续增菌,在不同时间点(第0、3、6、9、15、27、30天)吸取增菌液,用YCFA (yeast casitone fatty acid)固体培养平板分离菌落;用YCFA增菌肉汤增菌后再次挑取单菌落,利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF)质谱和16S rRNA基因测序鉴定菌株。通过比较上述6种寡营养条件分离肠道菌群的效果,选取富集培养基原液、稀释10倍和30倍这3种条件下分离效果较好的富集条件,与同样稀释倍数条件的固体平板和增菌肉汤分别组合成9种培养基条件,进一步优化肠道菌群的培养组条件。【结果】 在6种寡营养富集培养基中,未稀释(原液)、10倍和30倍稀释的富集培养基分离细菌的种类比其他稀释倍数多,其中10倍稀释的富集培养基分离细菌种数最多;同时除去原液,仅在寡营养条件中分离细菌为24种。在进一步优化固体培养基平板和增菌肉汤下,发现原液富集培养基-10倍稀释的固体平板和增菌肉汤培养基、10倍稀释的富集培养基-原液或10倍稀释的固体平板和增菌肉汤培养基这3个组合分离的细菌种数较多;除去原液,仅在寡营养条件中分离细菌为20种,其中10倍稀释的富集培养基-原液的固体平板和增菌肉汤培养基分离的菌种数最多。【结论】 通过稀释富集培养基、固体平板和增菌肉汤培养基成分获得的寡营养培养条件,能够分离出约40%的常规培养条件分离不到的细菌,为从人体肠道微生物群分离更多的菌种提供了有效的方法。

    • 六种猪呼吸道RNA病毒MALDI-TOF MS同步检测体系的构建

      2023, 63(9):3653-3666. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230044

      摘要 (83) HTML (459) PDF 930.39 K (639) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】 建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)和猪流感病毒(swine influenza virus, SIV)的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)多目标检测方法,同时对SIV进行通用型、H1型及H3型分型检测。【方法】 本研究根据6种病原体基因的保守序列,设计了6对加标引物及对应的延伸探针并进行单反应试验。通过体系优化引物浓度和反应条件,以及方法特异性、重复性及灵敏度分析,使用MALDI-TOF MS检测方法及荧光定量PCR方法分别对临床样本和猪源产制品进行检测,并对结果进行对比验证。【结果】 质谱结果显示,6种产物峰仅在靶标病毒对应的产物位置出现峰值,其他常见猪病病原在质谱图像中均未出现干扰,表明该体系的特异性良好。体系中每种病毒在高、中、低浓度时的批内阳性符合率均为100%,批间符合率均 ≥ 96.7%,表明该体系的重复性良好。灵敏度分析结果显示,体系中各病毒最低检测限在6.73–21.25拷贝/μL范围。应用MALDI-TOF MS多重检测方法对124份组织、饲料及猪肉样品进行检测,检出PRRSV阳性样本9份,SIV阳性样本3份(其中SIV-H1阳性样本2份,SIV-H3阳性样本1份)。将以上结果与荧光定量PCR方法分析结果进行对比验证,2种方法对各病原体检测结果的总符合率可达到99.2%–100%。【结论】 本研究建立的6种猪呼吸道RNA病毒MALDI-TOF MS同步检测方法为相关疫病监测和快速鉴别,以及便利化进出口动物检疫等提供了一种新的敏感、特异的高通量多目标检测技术。

    • 需钠弧菌WPAGA4菌株3条琼胶酶基因克隆、表达与酶学性质分析

      2023, 63(9):3667-3678. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230052

      摘要 (138) HTML (454) PDF 1.08 M (369) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】 本文拟从西太平洋深海沉积物中分离得到的需钠弧菌(Vibrio natriegens) WPAGA4菌株中克隆并表达3条β-琼胶酶基因agaW3418agaW3419agaW3472,并对其酶学性质进行研究。【方法】 通过克隆表达技术将得到的3条琼胶酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中进行表达,通过二硝基水杨酸(DNS)法测定重组琼胶酶的酶活,并对其中活性最优的一种琼胶酶进行热稳定性和产酶条件优化。【结果】 三种琼脂酶均为属于GH50家族。AgaW3418、AgaW3419和AgaW3472在温度分别为50、60和30℃以及pH值分别为6.0、7.0和7.0条件下,发挥作用的能力最强。其中琼胶酶AgaW3472表现出最优的酶活性质,在20℃下保持良好的稳定性,且在SOB (super optimal broth)培养基条件下以1% (质量体积分数)的乳糖作为碳源,同时添加20 mmol/L MgCl2,并将诱导温度和异丙基-1硫代-β-d-半乳糖苷(isopropyl-1 thio-β-d-galactoside, IPTG)浓度分别设置为37℃和0.1 mmol/L时能够获得最高的表达量。【结论】 三条重组酶具有琼胶酶活性,为WPAGA4菌株代谢琼胶多糖并参与海洋碳循环过程提供物质基础。琼胶酶AgaW3472具有较高的酶活性、低温适应性与稳定性,为琼胶降解相关产业的发展提供了潜在的生物工具酶。

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