真养产碱杆菌112R4酰亚胺酶基因的克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达

摘要:

筛选到一株具海因水解活力的微生物，经鉴定后命名为真养产碱杆菌112R4。该菌能水解海因、二氢尿嘧啶和琥珀酰亚胺，且对琥珀酰亚胺活力最高，但不水解5单取代海因和5，5’双取代海因，因而被确定为含有酰亚胺酶。真养产碱杆菌112R4能在以琥珀酰亚胺为唯一碳、氮源的培养基上生长，表明该菌中存在琥珀酰亚胺完整的转化途径。从112R4基因组DNA出发，用鸟枪法克隆了一个6kb的与环酰亚胺水解相关的DNA片段；进一步亚克隆得到了带酰亚胺酶基因的2kb的DNA片段，并进行了序列测定。缺失分析确定了一个876bp的ORF为真养产碱杆菌112R4的酰亚胺酶基因，推测编码一个291个氨基酸的多肽，这是第一次报道微生物酰亚胺酶的核酸和蛋白序列。推测的氨基酸序列在蛋白数据库中进行了比较，结果表明，酰亚胺酶与已知的环酰胺酶没有明显的同源性，也不属于氨酰水解酶蛋白超家族，因而被分类为一种新的环酰胺酶。真养产碱杆菌112R4的酰亚胺酶与芽生杆菌A17p4的酰亚胺酶N端的20个氨基酸有较高的同源性，一致性为60%，与多糖脱乙酰酶保守序列也部分同源，一致性为14%。带有酰亚胺酶基因的重组质粒在大肠杆菌中得到表达，在lac启动子控制下，使用1mmol/L IPTG诱导5h，酰亚胺酶活力达到3200U/L,为供体菌真养产碱杆菌112R４的7倍。

Abstract: