力复霉素产生菌地中海拟无枝菌酸菌U32丙氨酸脱氢酶基因克隆及表达

摘要:

丙氨酸脱氢酶(EC1411)可逆催化丙氨酸脱氨生成丙酮酸和NADH。它是生物体内的氨基酸代谢和氨同化途径的关键酶。在地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)U32中，丙氨酸脱氢酶的活力与力复霉素的生物合成有负相关现象，其活力受KNO3全局效应的调控。根据结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)的丙氨酸脱氢酶氨基酸的保守序列和地中海拟无枝菌酸菌U32对氨基酸密码子的使用偏好，设计一对简并PCR引物。以此引物从地中海拟无枝菌酸菌U32中扩增到一555bp的片段，并以此片段为探针从地中海拟无枝菌酸菌U32 基因组cosmid文库中成功的克隆到了丙氨酸脱氢酶结构基因(ald)。它编码了一个371个氨基酸的蛋白质，基因的GC含量为72.5％，符合链霉菌的基因结构特征。在起始密码子的上游6个碱基处，有一典型的链霉菌核糖体结合位点(RBS)：AGGAGG，第75位的氨基酸为赖氨酸，是丙酮酸结合位点。以pET28b为载体，在E.coli BL21(DE3)中高效表达了ald基因。用IPTG在22℃时诱导得到的丙氨酸脱氢酶活力最高。用HisTag柱纯化了表达的丙氨酸脱氢酶。酶学性质研究表明该酶专一性以LAla和NAD(H)为底物。

Abstract: