摘要:从土壤中分离睾酮丛毛单胞菌，提取其基因组DNA，PCR扩增3α-羟类固醇脱氢酶（3α-HSD）基因。以质粒pET15b为载体，构建3α-HSD的原核表达系统。经IPTG诱导后，得到了具有酶活性的融合蛋白，细菌总蛋白的表达量为0.73g/L，其中融合酶蛋白占16.4%，活性达1.38×10.5U/L。利用融合蛋白N末端的Histag，经金属螯合亲和层析纯化后，得到了纯度较高的融合酶蛋白，酶蛋白的得率为68%，比活性为194.7U/mg。凝血酶切除Histag后，经质谱鉴定，重组蛋白的分子量为26.5kD，与理论推测值基本相同。25℃以雄酮为底物，以NAD+和thioNAD+为辅因子时，融合蛋白参与酶促反应的最适pH分别为10.5和9.4。37℃条件下酶促反应较快，25℃时的反应速度只有37℃时的52％，Q10（25℃～35℃）为1.7。25℃、pH105、以雄酮和各级胆汁酸为底物、NAD+为辅因子时，融合酶蛋白的动力学常数Km位于4.2～51.1μmol/L范围内。融合酶蛋白发挥催化作用并不需要金属离子的参与，而Fe3+、Fe2+、Zn2+则抑制酶活性，反应体系中加入EDTA也并不影响酶的活性。活性和纯度均较高的融合蛋白3α-HSD的获得及其生物学性质的研究，为血清总胆汁酸酶循环法测定的建立奠定了基础。
