摘要:从棒状杆菌(Corynebacterium sp.SCB3058)初步纯化得到两个2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(2,5 DKG)还原酶,在此基础上利用PCR技术,以基因组DNA为模板,扩增得到含有2,5-DKG还原酶Ⅰ基因的片段,定向连接到PGEM3Zf(+)并转化大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性克隆pGEM813.序列分析表明,片段全长1107bp,含有一个834bp的开放阅读框架,编码产生由278个氨基酸组成的分子量为34kD的蛋白.将目的基因的调控序列进行缺失突变后,克隆到原核表达载体pBL上获得表达质粒pBL4.通过温度诱导,经SDS-PAGE分析有明显的表达条带,约占菌体总蛋白的20%,并且表达的蛋白具有较高的酶活力.构建的优良基因工程菌为最终实现从葡萄糖一步发酵产生维生素C前体2-酮基-L-古龙酸打下了基础.
