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采用高通量测序方法研究强化玉米饮食对小鼠肠道菌群结构的影响以及可提高宿主糖代谢相关菌群功能基因的分析。
分别给予两组小鼠(各10只)常规饮食和强化玉米饮食(1/4的玉米粉加3/4的常规饮食成分),喂养10周,之后采集小鼠粪便样本,提取DNA,使用高通量测序仪进行宏基因组测序分析,比较两组小鼠肠道菌群和功能基因的差异。
两组小鼠的终末体重没有明显差异。各样本DNA的测序有效率足够,肠道菌群的多样性存在一定差异。属放线菌门(
强化玉米饮食可以提高肠道菌群中双歧杆菌等益生菌的丰度,增加宏基因组糖脂代谢相关基因和通路的含量,从而可能促进宿主的糖代谢功能。
To verify if a corn-rich diet could change mice gut microbiota structure and enhance the host carbohydrate metabolism related gut flora genes by using high-throughput sequencing.
We fed mice for 10 weeks with either normal feedstuff or corn-rich feedstuff (containing 1/4 corn and 3/4 normal feedstuff), and compared the gut microbiome changes by high-throughput sequencing of fecal DNA.
Mice in the two diet groups showed similar body weight after 10 weeks feeding. Fecal DNA of all mice generated high efficiency results, and different diet caused diversity difference of gut flora. The abundances of
Corn-rich diet could promote the abundances of probiotics such as
玉米是世界各国的主要粮食产物之一。同时,根据中医“药食同源”观点,玉米是具备药用效果的食物之一。《中药大辞典》对玉米的描述“为健胃剂”,有“调中开胃”的作用,但是对玉米的药用机制目前尚不明确。
肠道菌群是定殖于宿主胃肠道的上千种不同细菌的集合体,近年来的研究证实,肠道菌群相当于人体的一个新的“器官”,参与调节宿主的多方面生理机能,包括消化、营养代谢、天然免疫系统成熟,等等,肠道菌群的失调则会导致多种疾病[
目前关于强化玉米饮食对于肠道菌群的影响尚无详细的报道,部分原因是因为传统的微生物学研究技术存在局限性,无法提供准确而完整的菌群系统的变化信息。因此本研究采用Illumina二代测序技术,通过检测粪便样本宏基因组(元基因组) DNA,获得普通饮食与强化玉米饮食条件下的肠道菌群宏基因组信息,进而比较两组菌群种属丰度及功能基因丰度的差异,从而明确强化玉米饮食是否使肠道菌群结构变得更加有助于宿主代谢。
动物实验方案遵照首都医科大学动物实验伦理委员会的相关规定制定和执行。实验使用普通清洁级8周龄雌性BALB/c背景的NF-κB反应元件-荧光素酶转基因小鼠[BALB/C-Tg (NFκB-RE-luc)-Xen,美国Caliper Life Sciences公司],购自南京模式动物研究所。实验小鼠在动物实验中心饲养,维持12 h明-暗循环饲养条件。
小鼠随机分为普通饮食组(Ctrl)和强化玉米饮食组(Corn),每组10只小鼠。普通饮食组的小鼠给予正常小鼠饲料(北京华阜康生物科技股份有限公司的大小鼠维持饲料,产品编号为1032),强化玉米饮食组给予定制的混合饲料,混合饲料由玉米粉(品系编号:7610)与上述正常小鼠饲料粉按1:3混合后压制成型而制备(也由北京华阜康生物科技股份有限公司提供)。1032型正常小鼠饲料的成分如
正常小鼠饲料成分
The composition of normal feedstuff
Ingredients | Content |
Water | ≤8.0% |
Crude protein | ≥21.0% |
Crude lipids | ≥5.0% |
Crude fiber | ≤5.0% |
Calcium | 1.3%–1.4% |
Phosphorus | 0.9%–1.0% |
Magnesium | ≥0.2% |
Potassium | ≥0.5% |
Sodium | ≥0.2% |
Iron | ≥180.0 mg/kg |
Manganese | ≥80.0 mg/kg |
Copper | ≥15.0 mg/kg |
Zinc | ≥80.0 mg/kg |
Iodine | ≥0.5 mg/kg |
Seledium | 0.1–0.2 mg/kg |
实验小鼠购得后,先使用普通饲料同笼喂养1周,以确保小鼠适应饲养环境,并达到相似的肠道菌群基础水平。之后将小鼠随机分为2组,按上述饲料处理方法分别喂食10周,然后采集每只小鼠的新鲜粪便样本。
对小鼠采用常规抓取、按摩腹部的方法,在洁净台中采集新鲜粪便颗粒到无菌Ep管中,采集后即刻冰浴,直至转入–80 ℃冰箱中待用。每只小鼠至少采集0.3 g粪便颗粒,一次采集不足量者,可以在同一天的多个时间点反复采集。
使用粪便样本DNA提取试剂盒(CW2092,北京康为世纪生物科技有限公司,中国)提取每200 mg粪便样本中的总DNA,提取步骤按照试剂盒的说明书进行。获得的DNA溶液使用NanoDrop2000分光光度计来确定浓度,并用约1–2 μL DNA样本跑1%琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA质量。若DNA样本的浓度大于5 µg/mL (总量至少有0.1 µg),
质量合格的DNA样本使用诺禾致源公司的Illumina Novaseq 6000高通量测序平台进行测序,按照其标准化程序进行。首先对样本DNA用Covaris超声波破碎仪随机打断成长度约为350 bp的片段,经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。然后使用Qubit2.0进行初步定量,将文库稀释至2 ng/µL,随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测,并使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量,最后把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行测序。
首先对下机数据进行质控,去除小于40 bp的reads,去除N碱基含量超过10 bp的reads,去除与测序接头序列overlap超过15 bp的reads,再采用Bowtie2软件比对小鼠数据库、过滤掉源自小鼠(宿主)的reads,得到有效数据(Clean Data)。质控获得的Clean Data,进一步使用SOAP denovo软件进行组装(K-mer设定为55),得到Scaffolds序列,再将Scaffolds序列从N连接处打断,得到不含N的Scaftigs序列(各样本的Clean Data序列用Bowtie2软件比对至该Scaftigs序列,找出未被利用上的reads,将这些reads进行混合组装,然后再进一步获得相应的Scaftigs序列),过滤掉500 bp以下的片段,余下的Scaftigs序列片段进一步用MetaGeneMark软件进行Open Reading Frame预测和过滤,并用CD-HIT软件进行去冗余。以去冗余得到的代表性片段为基准,用Clean Data结果去比对,获得各基因片段在各样本中的reads数,然后过滤掉reads数不超过2个的基因片段,余下的Clean Data片段,组成了Unigenes列表,用于计算基因丰度等信息,并比对KEGG数据库,进行代谢通路的功能注释和丰度分析。进一步采用DIAMOND软件,将Unigenes比对到NCBI的Microbe NR数据库,然后选取evalue≤最小evalue*10的比对结果,应用MEGAN软件的LCA算法,对各序列进行物种注释,结合Unigenes丰度,获得各样本在各种属层级上的丰度信息和基因数目信息,并作进一步统计分析。测序原始数据上传至NCBI的Sequence Read Archive (SRA)数据库,序列号SRP192980。
基于Unigenes列表中各基因在各样品中的丰度信息,进行基本信息统计、基因数目韦恩图分析。基于各样本在各个分类层级上的丰度,进行PCA分析,组间差异物种进行Metastat统计分析(以
两组小鼠的终末体重为:Ctrl组22.9±1.4 g
各样本的测序数据经过过滤拼接之后,具备的Unigene数目如
Unigene数目在样本间和组间的分布
Unigene number distribution among samples and groups. A: Unigene number in each sample; B: Venn graph shows the number of common and unique Unigenes in two groups.
我们首先比较了两组的菌群结构和丰度的差异,以观察不同饮食条件对于肠道菌群的生物多样性有何影响。两组各样本种级水平丰度排在前十的菌种及其丰度如
基于种级水平的相对丰度展示和主成分分析
Top 10 relative abundance and PCA analysis based on Species level. A: the top 10 highest abundant species and their abundances in each sample; B: PCA distribution of each sample.
我们进一步比较普通饮食组和强化玉米饮食组从门级到种级的各类细菌的平均丰度,寻找丰度有显著组间差异的种属,Metastat统计结果中,丰度较大的显著差异菌如
丰度在强化玉米组显著升高的肠道菌群种属
Gut flora strains which had significantly higher abundance in corn-rich diet group. *:
鉴于放线菌门的一些菌种,包括
比对KEGG找出丰度在强化玉米饮食组显著升高的功能模块、功能通路和酶基因
Functional modules, metabolic pathways, and enzyme genes which had significantly higher abundances in corn-rich diet group after annotation to KEGG database. A: Significantly changed modules; B: Significantly changed pathways; C: Significantly changed enzyme gene. *:
根据中医“药食同源”的理论,很多食物都同时具有药用效果,玉米就是其中一种,它被认为有“调中开胃”的作用,但是具体机制目前尚不明确。近年来,随着高通量测序技术的发展,有关肠道菌群的研究也取得了长足的发展,新的观点认为,肠道菌群可以视为人体的一个新的“器官”,其在维持人体健康和介导疾病发生方面发挥着重要的作用[
通过与喂养普通饮食的小鼠的肠道菌群比较,我们发现,强化玉米饮食喂养的小鼠,其宏基因组Unigene的总数与普通饮食对照组相似,同时两组共有的基因类型占各组Unigene总数的绝大部分。具体到各种属细菌的丰度变化,我们发现,强化玉米饮食组的菌群β多样性以及各级丰度最高的菌种含量,都与对照组有较明显的区别,尤其是放线菌门的3个目级分支(包括双歧杆菌)都在强化玉米饮食组显著升高,该显著性变化一直持续到种级的
综上所述,我们的研究使用高通量测序技术,首次鉴定了强化玉米饮食对于肠道菌群的影响,我们的研究结果为从肠道菌群角度解释玉米对健康的促进作用提供了新的依据。
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