细菌警报素<bold>(p)ppGpp</bold>代谢的关键调控者：<bold>RSH</bold>蛋白的功能多样性

王淼，项雨霏，贺龙龙，周秦，许丹; WANG Miao; XIANG Yufei; HE Longlong; ZHOU Qin; XU Dan

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细菌警报素(p)ppGpp代谢的关键调控者：RSH蛋白的功能多样性 PDF

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王淼 ^1,2
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项雨霏 ^1,2
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贺龙龙 ^1,2
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周秦 ^1,2
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许丹 ^1,3
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1. 西安交通大学口腔医院，陕西省颅颌面精准医学研究重点实验室, 陕西西安； 2. 西安交通大学口腔医院，口腔种植科，陕西西安； 3. 西安交通大学生命科学与技术学院，教育部生物医学信息工程重点实验室，线粒体生物医学研究所，陕西西安

最近更新：2025-04-30

DOI： 10.13343/j.cnki.wsxb.20240729

CSTR： 32112.14.j.AMS.20240729

摘要

细菌的严紧反应(stringent response)是细菌在面临恶劣生存环境时，通过改变新陈代谢并降低生长速度，以增强存活和适应环境能力的一种适应性反应。此反应由鸟苷四磷酸(guanosine tetraphosphate, ppGpp)和鸟苷五磷酸(guanosine pentaphosphate, pppGpp) (合称(p)ppGpp)的快速积累所介导，在微生物应对环境变化中发挥关键作用。细菌内的(p)ppGpp水平由RelA/SpoT同源蛋白(RelA/SpoT homologues, RSH)调控，包括小警报素合成酶(small alarmone synthetases, SAS)、小警报素水解酶(small alarmone hydrolases, SAH)以及双功能蛋白Rel。此外，近期研究发现了一种新的细菌警报素腺苷四磷酸(adenosine tetraphosphate, ppApp)和腺苷五磷酸(adenosine pentaphosphate, pppApp) (合称(p)ppApp)，它能调控细菌的多种生物过程。鉴于不同细菌中涉及(p)ppGpp代谢的酶有所不同，本文对已知的RSH蛋白的结构及其生化特性进行系统的分类与综述，并总结其生物学功能，以促进未来在这一领域的深入研究与发展。

关键词

(p)ppGpp; 细菌严紧反应; (p)ppApp; RelA/SpoT同源蛋白; 核苷酸代谢

当细菌感知到环境中存在酸碱变化、温度变化、营养不足和抗生素等不良因素时，细菌会通过严紧反应(stringent response)调整自身的生理状态，以节省资源，改变新陈代谢，降低生长速度，从而提高在不同环境中的适应能力和在恶劣环境中的存活率^[

1-2] (图1)。严紧反应主要通过(p)ppGpp这2种线性核苷酸的快速积累来介导，因其强大的全局调控能力，(p)ppGpp也被称为“魔点核苷酸(magic spot nucleotide)”^{[参考文献 3

百度学术}3]。通过正构或变构的方式，(p)ppGpp与下游各种酶靶点结合，全局调控细菌的多种生物过程，包括DNA复制、转录、翻译、核苷酸代谢、毒力、抗生素耐受性、持留性、生物被膜形成、产孢甚至肠道定殖等^{[参考文献 3-5}3-5]。研究表明，(p)ppGpp的信号通路在不同细菌中存在差异，革兰氏阴性菌主要通过直接结合RNA聚合酶调控基因转录，而革兰氏阳性菌则主要通过间接方式影响GTP水平^{[参考文献 6

百度学术}6]，进而影响基因表达、细胞周期等过程，调控核糖体和代谢类蛋白等资源的分配，帮助细菌提高抗生素耐受性、适应营养缺乏等不利环境^{[参考文献 7

百度学术}7]。因此，细菌内部的(p)ppGpp水平在维持细胞稳态及适应性变化中发挥重要作用^{[参考文献 8

百度学术}8]。

图1 (p)ppGpp代谢在细菌严紧反应中对细菌毒力、抗生素耐药等细菌活动的影响

Figure 1 The effects of (p)ppGpp metabolism on bacterial virulence, antibiotic resistance, and other bacterial activities during the stringent response.

细菌内的(p)ppGpp水平由RelA/SpoT同源蛋白(RelA/SpoT homologues, RSH)家族蛋白生成及调节，包括小警报素合成酶(small alarmone synthetases, SAS)、小警报素水解酶(small alarmone hydrolases, SAH)以及含有合成酶/水解酶结构域的双功能(多结构域)蛋白Rel^[

9]。目前，对RSH家族蛋白的理解主要基于对大肠杆菌(Escherichia coli)中2个RSH蛋白的广泛实验研究。RSH蛋白的分布呈现出显著的多样性，这与其在不同细菌中的生物学功能密切相关。大多数γ-变形菌门(Gammaproteobacteria)和许多β-变形菌纲(Betaproteobacteria)编码2个Rel蛋白(如大肠杆菌中的RelA和SpoT)，这可能是因为rel基因经历了基因复制(图2)。相比之下，其他大部分细菌只编码1个具有合成/水解双向功能的Rel蛋白。大多数革兰氏阳性菌，如厚壁菌门(Firmicutes)和放线杆菌纲(Actinobacteria)，能够编码1个双功能的Rel蛋白和1个或2个单功能SAS和/或SAH。值得注意的是，SAS和SAH在革兰氏阴性菌中较为罕见，仅存在于少数特定菌种中，如霍乱弧菌(Vibrio cholerae)中的RelV^{[参考文献 10

百度学术}10]。

图2 细菌中RSH的结构域结构图

Figure 2 Domain structure of the RSHs in bacteria. SYN: Synthetase domain; HD: Hydrolase domain; TGS: TGS domain (Threonyl-tRNA synthetase-GTPase-SpoT); Helical: α-helical domain; ZFD: Putative zinc finger domain; ACT: Acetolactate synthetase-chorismate mutase-tyrR domains.

RSH蛋白对(p)ppGpp的代谢主要依靠保守的合成功能域(synthetase domain, Syn)和水解功能域(hydrolase domain, HD)来完成。Rel和SAS蛋白的合成功能域主要负责 (p)ppGpp的合成，由ATP向底物GDP/GTP贡献双磷酸盐(PPi)生成ppGpp/pppGpp和副产物AMP。相比之下，(p)ppGpp的水解则通过Rel和SAH的水解功能域完成，将(p)ppGpp水解为GDP/GTP和PPi^[

11] (图3)。除了(p)ppGpp，在细菌中也发现了鸟苷三磷酸(guanosine triphosphate, pGpp) (由GMP和ATP生成)，且已经证实pGpp能够与(p)ppGpp一样感知细菌外部环境的变化^{[参考文献 12

百度学术}12]。最新研究发现，RSH家族蛋白及其类似同源蛋白还可以合成(p)ppApp，细菌内部(p)ppApp的快速积累会导致ATP的消耗和细菌基本代谢途径的广泛失调，从而导致细菌死亡^{[参考文献 9

百度学术}9,13-14]，因此(p)ppApp有望成为继(p)ppGpp之后下一个备受关注的细菌全局调控因子。因此，pGpp和(p)ppApp这2种新核苷酸类似物信号分子也是研究RSH家族蛋白功能时必须考虑的因素。

图3 (p)ppGpp在细菌中的代谢

Figure 3 Metabolism of (p)ppGpp in bacteria. The synthetase domain (SYN, grey) of RSH enzymes facilitates the transfer of a pyrophosphate group from ATP to the ribose portion of GTP, GDP or GMP, creating pppGpp, ppGpp or pGpp, respectively. This reaction also results in the production of an AMP molecule. The hydrolase domain (HD, yellow) is accountable for reforming GTP, GDP or GMP by removing the pyrophosphate group (PPi). The metabolism of (pp)pGpp also involves enzymes beyond the RSH superfamily. GppA (pink) hydrolyzes pppGpp to ppGpp, while Nudix (blue) hydrolyzes pppGpp/ppGpp to pGpp.

Jimmy等^[

9]对来自不同生命形式的24 072个基因组中的RSH同源蛋白进行了系统发育分析及分类，定义了SAS的30个亚类、SAH的11个亚类和Rel的13个亚类。目前，有关(p)ppGpp的研究大多聚焦于生物学功能层面^{[参考文献 6-7}6-7]，对其内部生化功能的探索尚处于初步阶段。本文旨在对已报道细菌中合成和水解(p)ppGpp的RSH家族蛋白进行系统分类并予以综述，同时全面归纳各类的生化功能，以期为该领域的深入研究提供重要的参考依据。

1 (p)ppGpp的合成

1.1 (p)ppGpp合成酶概述

细菌、藻类和植物均能合成RSH家族蛋白^[

15]。RSH蛋白结构中包含(p)ppGpp合成结构域(Syn)，该结构域中有5个高度保守的氨基酸序列，命名为Syn1-Syn5 (图4)。其中，Syn1负责ATP底物的协调；Syn2含有协调镁离子(Mg²⁺)和ATP的Asp和Arg残基；Syn3含有协调GDP/GTP鸟苷部分的Tyr和His残基；Syn4含有协调Mg²⁺的Glu残基和有助于ATP结合的Gln残基；Syn5中的His残基与ATP的核糖部分相互作用。目前，大量的结构和生化研究已经证实，Syn1-Syn5在RSH合成(p)ppGpp的活性中发挥着重要作用^{[参考文献 16-19}16-19]。

图4 代表性长RSH合成酶和小警报素合成酶(SAS)的晶体结构

Figure 4 Crystal structure of representative long RSH and small alarmone synthetase. A: Bifunctional SeRel (Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis Rel) containing the hydrolase and synthetase domains bound to GPX and GDP, respectively (PDB: 1VJ7 chain B)^[

16]; B: Synthetase domain of BsRelQ (Bacillus subtilis RelQ, PDB: 5DEC)^{[参考文献 17

百度学术}17]. HD1-HD6 motifs are shown in purple; Syn1-Syn5 are shown in orange. Figures were generated with PyMOL.

目前，RSH家族蛋白中负责(p)ppGpp合成的蛋白质主要分为2类：长RSH蛋白和SAS蛋白。长RSH蛋白除了具备功能域外，通常还包含额外的调控结构域，这些结构域已被证实参与了更复杂的细菌生存调控过程。相比之下，SAS蛋白结构较为简单，仅含有负责(p)ppGpp合成的功能域，而不具备其他调控结构域。本研究总结了几种已报道的典型SAS蛋白(包括RelQ、RelP、ActRel、RelV)的生化功能及活性特点(表1)。这些研究不仅深化了目前对RSH蛋白结构与功能的理解，还揭示了不同RSH蛋白在合成pGpp、ppGpp和pppGpp方面的倾向性差异，暗示它们可能在细菌中承担着不同的响应机制。这些发现将增进对(p)ppGpp在细菌严紧反应中的作用及其内在关系的认识，同时也为后续探究其在细菌应对不同压力条件时的作用机制提供了线索。未来深入的研究将逐步揭开RSH家族蛋白及(p)ppGpp在不同微生物中调控细菌响应环境变化所涉及的复杂机制。

表1 细菌中的小警报素合成酶

Table 1 Small alarmone synthetases in bacteria

Bacteria	SAS type	Biochemical function	Other references
Staphylococcus aureus	RelP (tetramer)	Substrates: GMP, GDP, GTP, IDP, ITP Prefers: GDP>GTP>GMP^[ 20] Stronger (pp)pGpp-synthesis activity than RelQ^[ 20] Activated by Zn^2+[ 21]	[22-25]
Staphylococcus aureus	RelQ (tetramer)	Substrates: GMP, GDP, GTP, IDP, ITP Prefers: GDP>GTP>GMP^[ 20] (pp)pGpp allosterically regulates^[ 20]	[22-25]
Streptococcus mutans	RelP	Substrates: GMP, GDP, GTP Prefers: GTP>GDP>GMP^[ 20,26] Weakly synthesize pGpp^[ 20,26] Stronger (pp)pGpp-synthesis activity than RelQ^[ 20,27]	[28-32]
Streptococcus mutans	RelQ	Substrates: GMP, GDP, GTP Prefers: GTP>GDP>GMP^[ 20] Weakly synthesize pGpp^[ 20,26] (pp)pGpp allosterically regulates^[ 20]	[28-32]
Bacillus subtilis	RelP (tetramer)	Substrates: GMP, GDP, GTP, ADP, ATP Synthesize of (pp)pGpp, ppApp and AppppA^[ 33]	[17,33-34]
Bacillus subtilis	RelQ (tetramer)	Substrates: GMP, GDP, GTP Prefers: GDP>GTP^[ 17] pppGpp allosterically regulates^[ 17]	[17,33-34]
Enterococcus faecalis	RelQ (tetramer)	Substrates: GMP, GDP, GTP, IDP, ITP Synthesize pGpp^[ 26,35] Prefers: GDP>GMP≥GTP^[ 26] (pp)pGpp allosterically regulates^[ 20] Negative allosteric regulation by ssRNA^[ 35]	[8,26,35-36]
Streptococcus pneumoniae	RelQ	Substrates: GDP, GTP^{[参考文献 37 百度学术}37]	[37]
Mycolicibacterium (Mycobacterium) smegmatis	ActRel (RelZ)	Substrates: GMP, GDP, GTP Synthesize pGpp^[ 39] Prefers: GMP>GDP>GTP^[ 39] 64.5 kDa protein with RNase HII domain Bifunctional protein with (p)ppGpp synthetase and RNase HII activity^[ 40] ssRNA inhibits pGpp synthesis^[ 39]	[41]
Corynebacterium glutamicum	RelP	No activity^{[参考文献 42 百度学术}42]
Corynebacterium glutamicum	ActRel (RelS)	Substrates: GMP, GDP, GTP Prefers: GDP>GTP>GMP^[ 42] 39.8 kDa longer than representative SAS Most active at neutral pH conditions and at low temperatures^[ 42]
Clostridioides (Clostridium) difficile	RelQ	Substrates: GMP, GDP, GTP Utilize GMP, GDP and GTP form pGpp^[ 43]	[44]
Vibrio cholerae		Substrates: GDP, GTP 259 aa (minimal activity length is 189 aa)	[10,45-46]

1.2 长RSH合成酶[long RSH synthetases (Rel/RelA/SpoT)]

长RSH合成酶是多功能域蛋白，主要包括N端(p)ppGpp合成水解催化结构域(N-terminal domain, NTD)和C端调控结构域(carboxy-terminal domain, CTD)。其中NTD的典型结构包含水解酶结构域(HD)和合成酶结构域(Syn)，而CTD则由多个具有特定调控或配体结合功能的结构域组成，如TGS结构域(threonyl-tRNA synthetase-GTPase-SpoT)、α-螺旋结构域(α-helical domain)、锌指结构域(putative zinc finger domain)和ACT结构域(acetolactate synthetase-chorismate mutase-tyrR) (图2)。研究表明，RSH的C端结构域能够整合环境信号并调节酶活性，确保细菌在动态变化的环境中维持适宜的代谢状态，然而其更多功能尚待进一步探索。

在不同环境条件下，细菌会启动不同的(p)ppGpp合成机制。在氨基酸饥饿条件下，脱酰化的tRNA作为关键的激活信号，会激发RelA和Rel合成酶的活性。具体而言，当这些脱酰化的tRNA占据核糖体上空的A位点时，会激活RelA/Rel，进而触发(p)ppGpp的合成(图5A)。相反，当RelA处于核糖体外，或者与未充载的tRNA形成复合结构时，其自身会呈现出“闭合”或“半开”的构象状态，在这种状态下，RelA无法有效激活(p)ppGpp的合成反应^[

1,47]。

图5 长RSH蛋白调节的(p)ppGpp水平受未充载的tRNA和ACP调控

Figure 5 (p)ppGpp levels from long RSH proteins are regulated by uncharged tRNA and ACP. A: Under conditions of amino acid starvation, ribosome-bound RelA detects uncharged tRNA leading to (p)ppGpp accumulation; B: Under conditions of fatty acid starvation, TGS domain within SpoT interacts with ACP, enhancing the activity of (p)ppGpp synthesis and inhibiting (p)ppGpp hydrolysis.

然而在脂肪酸饥饿条件下，大肠杆菌中(p)ppGpp的合成由SpoT负责，这与氨基酸缺乏时RelA单独发挥作用的模式不同。细胞内的酰基载体蛋白(acyl carrier protein, ACP)是脂肪酸代谢通路中的关键成分，其具备激活SpoT的合成酶活性的能力^[

48-49] (图5B)。脂肪酸饥饿促使SpoT的TGS结构域与ACP发生相互作用，进而引发SpoT构象变化，促进(p)ppGpp的合成^{[参考文献 49

百度学术}49]。因此，ACP可能充当着代谢传感器的角色，感知细胞脂肪酸状态并向SpoT传递信息。值得注意的是，ACP对SpoT的调控作用似乎仅存在于同时拥有RelA和SpoT蛋白的细菌中，如大肠杆菌和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。然而，SpoT与ACP之间相互作用以及二者结合过程的中间环节仍需进一步研究^{[参考文献 37

百度学术}37]。

1.3 小警报素合成酶(SAS)

1.3.1 RelP和RelQ

RelP (也称YwaC和SAS2)和RelQ (也称YjbM和SAS1)是目前研究最深入的SAS蛋白，主要存在于厚壁菌门的细菌中，例如变异链球菌(Streptococcus mutans)^[

27]、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)^{[参考文献 34

百度学术}34]、单核增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)^{[参考文献 50

百度学术}50]、粪肠球菌(Enterococcus faecalis) (仅RelQ)^{[参考文献 26

百度学术}26,35-36]和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)^{[参考文献 20

百度学术}20,22]。RelQ具有与长RSH蛋白类似的合成结构域(Syn)^{[参考文献 17

百度学术}17]，并通过α1和α5螺旋的延伸形成一个具有中央裂隙的对称四聚体，其中4个活性位点紧密协作(图4B)。RelP和RelQ的主要区别在于G-Loop区域的灵活性，这影响了它们对GDP和GTP底物的协调能力，进而导致它们在合成(p)ppGpp的能力上有所不同。具体而言，RelQ的G-Loop呈无序状态，而RelP的G-Loop则呈有序结构(图6)。因此，RelP的(p)ppGpp合成活性高于RelQ，并且其活性不依赖外部信号的触发^{[参考文献 20

百度学术}20,22,26-27]。尽管存在这些差异，RelP和RelQ也有相似之处：两者都更倾向于选择GDP而非GTP作为底物，且在合成效率上，ppGpp的生成速率约为pppGpp的4倍^{[参考文献 20

百度学术}20,51]。这种偏好性和合成效率揭示了它们在不同环境条件下调节细菌内(p)ppGpp水平的独特机制。

图6 G-Loop对RelP和RelQ活性的影响

Figure 6 The role of G-Loop in RelP and RelQ activity. A-B: Crystal structures of Staphylococcus aureus RelP in the apo- and AMPCPP-bound states (PDB: 6FGJ and 6FGX) show an ordered G-Loop (purple color)^[

21]; C-D: Crystal structures of Bacillus subtilis RelQ in the apo- and AMPCPP-bound states (PDB: 5DEC and 5DED) show a disordered (dashed line) and ordered G-Loop (purple color)^{[参考文献 17

百度学术}17]. Figures were generated with PyMOL.

RelQ蛋白的活性受(p)ppGpp和单链RNA (ssRNA)双重调控。一方面，(p)ppGpp能够正向调控RelQ合成(p)ppGpp的活性^[

17,20,26]。以枯草芽孢杆菌RelQ (Bs-RelQ)为例，其四聚体结构中的中央裂隙可以结合2个别构(p)ppGpp分子，使(p)ppGpp合成活性提高约10倍，其中pppGpp的正向调节效果优于ppGpp^{[参考文献 17

百度学术}17,35]。另一方面，研究发现ssRNA也能结合至同一裂隙位置，从而抑制粪肠球菌RelQ (Ef-RelQ)的活性^{[参考文献 35

百度学术}35]，并且这一作用需要特定的GGAGG氨基酸序列存在。当(p)ppGpp和ssRNA竞争结合同一结合位点时，(p)ppGpp可以逆转ssRNA的抑制作用。然而，RelP缺乏像RelQ那样的别构调控位点，因此不受(p)ppGpp和ssRNA的调控^{[参考文献 51

百度学术}51]。

RelP包含Zn²⁺结合位点。金黄色葡萄球菌中的RelP蛋白(Sa-RelP)的晶体结构中，发现了一个由His-73和His-74组成的潜在金属离子结合位点^[

21]。研究表明，低浓度Zn²⁺能够激活Sa-RelP的pppGpp合成活性，而高浓度Zn²⁺则表现出抑制作用。对His-73和His-74进行点突变会导致酶活性的完全丧失，这充分凸显了“His-His”对于维持蛋白活性的重要性^{[参考文献 21

百度学术}21]。综上所述，RelP和RelQ中发现的这些重要特征，包括ssRNA、(p)ppGpp别构刺激以及Zn²⁺作为潜在激活剂等方面，有助于理解细菌在恶劣环境中的适应性反应。

1.3.2 ActRel：RelS和RelZ (MS_RHII-RSD)

ActRel亚类^[

9]蛋白以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的RelS和耻垢分枝菌酸小杆菌(Mycolicibacterium smegmatis)的RelZ为典型代表^{[参考文献 40

百度学术}40]。RelS与RelZ的合成酶结构域有较高的相似性，但RelZ存在2个特殊的结构域：N端的核糖核酸酶HII (ribonuclease HII, RNase HII)结构域和C端的催化结构域，使其既能够行使RNA酶活性，又能合成pGpp^{[参考文献 40

百度学术}40]。活性位点突变研究表明，RelZ一个结构域的失活并不影响另一个结构域的正常功能。耻垢分枝菌酸小杆菌中的RelZ在合成警报素时优先使用GMP生成pGpp，表明pGpp在环境响应中可能具有特殊的生物学功能；谷氨酸棒杆菌中的RelS具有温度依赖性，在低温下活性最高，表明pGpp的合成可能参与细菌对低温环境的响应^{[参考文献 42

百度学术}42]。

1.3.3 RelV

RelV亚类以霍乱弧菌编码的蛋白为代表^[

46,52]，由259个氨基酸组成，略长于大多数已知的SAS蛋白(如RelQ和RelP，约220个氨基酸)。RelV的(p)ppGpp合成酶活性依赖于合成酶结构域中的5个特定氨基酸残基：K107、D129、R132、L150和E188^{[参考文献 10

百度学术}10]。进一步研究其结构与活性之间的关系，发现维持RelV活性所需的最小序列长度为189个氨基酸，其中包含由94个氨基酸构成的合成酶结构域。这一发现表明，除了核心合成结构域外，RelV中围绕该合成结构域的侧翼结构在保持(p)ppGpp合成酶活性时起着至关重要的作用^{[参考文献 10

百度学术}10]。

1.3.4 ToxSAS

ToxSAS是近期发现的编码于毒素-抗毒素(toxin-antitoxin, TA)操纵子中的SAS蛋白(ToxSAS)。这些TA操纵子在多种细菌物种中普遍存在^[

9]。已确认属于TA系统的SAS酶包括：枯草芽孢杆菌的PhRel2、粪杆菌属(Coprobacillus sp.)的FaRel2、分枝杆菌属噬菌体(Mycobacterium phage)的PhRel、海纤维单胞菌(Cellulomonas marina)的FaRel和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的CapRel^{[参考文献 9

百度学术}9,53]。ToxSAS毒性的中和可以通过2种方式实现：(1) 相邻的抗毒素蛋白直接与ToxSAS毒素结合并使其失活，类似于II型毒素-抗毒素系统，即通过蛋白-蛋白结合直接抑制；(2) ToxSAS的毒性也可以通过具有水解酶活性的SAH蛋白间接消除，即替代抗毒素降解(p)ppGpp，类似于IV型毒素-抗毒素系统^{[参考文献 54

百度学术}54]。

1.3.5 pGpp的合成

研究发现，除ppGpp和pppGpp外，鸟苷单磷酸(guanosine monophosphate, GMP)也可作为SAS蛋白的底物，用于合成第3种警报素——pGpp。这一发现扩展了细菌警报素的种类，从原先的2种[(p)ppGpp，即pppGpp和ppGpp]增加到了3种[(pp)pGpp，包括pppGpp、ppGpp以及新发现的pGpp]。研究表明，pGpp在功能上与pppGpp和ppGpp类似，但也可能具备独特的生物学功能^[

26,55]。目前已经证实，枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、谷氨酸棒杆菌、艰难拟梭菌(Clostridioides difficile)、金黄色葡萄球菌和变异链球菌等细菌的SAS蛋白能够利用GMP作为底物来合成pGpp (目前RSH蛋白合成pGpp的能力总结于表1)。然而，这些酶合成pGpp的效率通常低于合成ppGpp和pppGpp的效率^{[参考文献 12

百度学术}12,26,42-43,56-57]。在已知的SAS蛋白中，只有耻垢分枝菌酸小杆菌的RelZ表现出对GMP的亲和力高于GDP或GTP^{[参考文献 39

百度学术}39]。更特殊的是，艰难拟梭菌中的RSH蛋白(Cdi-RSH和Cdi-RelQ)能够使用GDP和GTP作为底物合成pGpp。这种功能在其他生物体编码的RSH酶中极为罕见，因为它们通常不会催化ATP的磷酸转移至GDP或GTP以产生pGpp，而是生成ppGpp或pppGpp。

总之，pGpp的合成增加了细菌警报素系统的复杂性，但目前关于pGpp具体生物学功能的探索仍处于初步阶段。未来的研究将致力于阐明不同警报素之间的功能差异，深入剖析pGpp的具体作用机制，探讨其在不同细菌中的分布规律及其所承载的重要生物学意义。

2 (p)ppGpp水解

2.1 (p)ppGpp水解酶结构域概述

(p)ppGpp的降解关键在于从核糖部分的3′位置移除焦磷酸基团，过程需要锰离子(Mn²⁺)的参与以协助底物结合并促进催化反应(图3)。水解酶结构域中包含6个保守的催化基序(HD1-HD6)，这些基序中的特定氨基酸残基确保了底物的正确排列与酶活性中心的有效催化。例如，HD2、HD3和HD5中的氨基酸通过协调Mn²⁺来稳定底物的位置，而HD1和HD6则确保了鸟嘌呤碱基的精确识别。此外，HD4中的氨基酸残基对于实际的水解步骤是必不可少的^[

16,58]。以下是已知具有警报素水解活性的各个蛋白家族的特性总结。

2.2 长RSH水解酶[long RSH hydrolases (Rel/SpoT)]

长RSH水解酶(Rel/SpoT，不包括RelA)能够将pppGpp、ppGpp、pGpp水解为GTP、GDP、GMP。目前，已经对来自多种生物体的Rel/SpoT蛋白的水解酶结构域进行了结构特性表征研究，包括嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、枯草芽孢杆菌、结核分枝杆菌、大肠杆菌和停乳链球菌马样亚种(Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis)等^[

1,16,59-61]。这些蛋白的N端含有编码6个保守催化基序(HD1-HD6)的水解酶结构域，该结构域由10个α-螺旋和2个β-折叠组成，形成一个包含Mn²⁺结合位点的活性中心，这对于发挥水解功能至关重要。

在大肠杆菌中，Rsd蛋白被鉴定为SpoT的直接调节因子，它与TGS结构域相互作用，激活SpoT水解酶活性^[

62]。Rsd蛋白还可能与增强SpoT合成酶活性的酰基载体蛋白(ACP) (图5B)存在竞争关系，细菌可根据碳水化合物的可用性和代谢状态，选择性地触发SpoT的水解酶或合成酶活性。此外，CgtA (一种与大肠杆菌核糖体相关的关键GTP酶)可以结合GDP、GTP或ppGpp，并作为磷酸化鸟苷的感应器，调节SpoT的水解酶活性，从而调控细菌内(p)ppGpp的水平^{[参考文献 63

百度学术}63]。在荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)中，双功能Rel酶(Rc-Rel)可以结合支链氨基酸(BCAA)，当BCAA浓度较高时，这种活性能够防止(p)ppGpp在体内过度积累^{[参考文献 64

百度学术}64]。这些调控机制展示了(p)ppGpp水解酶在不同细菌中的多样性和复杂性，有助于更好地理解细菌如何在不同环境条件下维持代谢平衡。

2.3 小警报素水解酶(SAH)

SAH同源物通常由约200个氨基酸组成，相较于长RSH水解酶，SAH拥有高度保守的水解酶活性中心，但缺乏调控结构域。尽管SAH酶在多种生物中广泛存在，但其确切的催化机制和调控方式至今仍未完全明了。截至目前，已有3种细菌来源的SAH酶的晶体结构被解析，分别是铜绿假单胞菌SAH^[

65]、谷氨酸棒杆菌SAH和钩端螺旋体属(Leptospira) SAH^{[参考文献 66

百度学术}66]。

SAH酶在体外条件下以Mn²⁺依赖的形式催化(pp)pGpp的水解，而谷氨酸棒杆菌的SAH酶则表现出pH依赖性的(pp)pGpp水解特性^[

67]。值得注意的是，细菌的SAH以二聚体形式发挥催化活性，且不同物种之间的二聚体构象存在差异，这可能会影响酶的调控机制、稳定状态或对二者同时产生影响。

以谷氨酸棒杆菌SAH为例，该蛋白的HD1和HD6基序负责协调位于活性位点中心的底物(p)ppGpp的鸟嘌呤碱基，而HD2、HD3和HD5基序中的特定氨基酸残基则参与Mn²⁺离子的协调(图7)。研究发现，对谷氨酸棒杆菌SAH中这些关键位点进行突变(如HD1中的R24Q、HD4中的E62N/D63N和HD6中的N126D/N126L)会导致酶活性丧失^[

66]。此外，底物依赖的竞争机制也在一定程度上调控了SAH的活性。研究发现，在50 μmol/L (p)ppGpp存在时，(p)ppGpp的水解活性会受到抑制；并且随着产物浓度的增加，水解活性也会受到抑制，其中GTP的抑制作用比GDP更为明显。然而，在钩端螺旋体SAH中并未发现两者的抑制效应存在显著差异^{[参考文献 66

百度学术}66]。这些发现为进一步理解SAH酶的功能机制及其在微生物生理过程中的作用提供了参考。

图7 谷氨酸棒杆菌SAH的晶体结构和水解酶结构域HD基序

Figure 7 Crystal structures and HD motifs in Corynebacterium glutamicum SAH. A: Crystal structure of the Corynebacterium glutamicum SAH dimer, with a single monomer colored in pink and yellow, respectively (PDB: 7QOD)^[

66]; B: The Mn²⁺ ion in the active site is represented as a purple sphere and the coordinating residues are illustrated as sticks (H34, H58, D59, D122 shown in red, purple, green, and blue, respectively); C: The closer view highlights the position of 6 HD motifs. Figures were generated with PyMOL.

3 (p)ppGpp代谢

(p)ppGpp的内部代谢过程，主要涉及pppGpp、ppGpp和pGpp之间通过在5′-或3′-位置添加或移除磷酸基团实现相互转换。这也表明这3种不同形式的(p)ppGpp在细胞内的生理调控活性存在差异。已有研究表明，相较于pppGpp，ppGpp在细胞生长速度、RNA/DNA比例、核糖体RNA合成以及转录起始等方面的调控效果更为显著^[

5,68-69]。因此，(p)ppGpp的新陈代谢对于微生物应对外界压力或适应环境变化显得尤为重要。

目前已知参与(p)ppGpp内部代谢的蛋白，除了RSH家族蛋白之外，还包括GPPA、Nudix和ApaH家族的成员(图3)。RSH家族蛋白主要负责(p)ppGpp的合成与降解，而GPPA、Nudix和ApaH家族则通过特异性地识别(p)ppGpp的不同形式，并对其进行针对性处理，参与了警报素的互变过程。这种复杂的代谢网络不仅反映了(p)ppGpp在微生物生理学中的核心地位，也展示了微生物利用pGpp、ppGpp、pppGpp优化自身适应性生存的策略。

4 (p)ppApp的新陈代谢

4.1 (p)ppApp的合成

磷酸化的嘌呤分子并非仅限于鸟苷衍生物。已有研究表明，在放线菌中发现了能够产生(p)ppApp的蛋白^[

70]，并且在芽孢杆菌进行孢子形成的过程中，观察到了核糖体依赖的高水平(p)ppApp积累^{[参考文献 71

百度学术}71]。近期，大肠杆菌RNA聚合酶结合ppApp的晶体结构被成功解析，使(p)ppApp受到了广泛关注^{[参考文献 72

百度学术}72]。解析结果表明，ppApp结合于一个独特的位点，该位点位于靠近催化中心的2个(p)ppGpp结合位点之外。与(p)ppGpp不同，(p)ppApp在特定启动子处能够促进转录，而DksA (DnaK抑制因子A，一种RNA聚合酶结合蛋白)则抑制这一效应。目前，细菌内(p)ppApp的合成主要由2个蛋白家族参与：RSH蛋白和Tas1蛋白(表2)。

表2 催化(pp)App合成的酶

Table 2 Enzymes catalyzing (pp)App-synthesis

Bacteria/Phage host	SAS type	Biochemical function	References
Methylorubrum (Methylobacterium) extorquens	Rel	Synthesize pppApp and (p)ppGpp	[73]
Pseudomonas aeruginosa PA14	Tas1	Synthesize pppApp, ppApp, and pApp	[13]
Bacillus subtilis	RelP	Synthesize ppApp, AppppA, and (pp)pGpp	[33]
Treponema denticola	SAS	Synthesize pppApp, ppApp, and pApp	[74]
Bacillus subtilis la1a	PhRel2	Toxin SAS Synthesize (p)ppGpp and ppApp	[9]
Coprobacillus sp. D7	FaRel2
Mycobacterium phage Phrann	PhRel
Cellulomonas marina	FaRel
Mycobacterium tuberculosis AB308	CapRel

在负责合成(p)ppApp的RSH蛋白中，部分属于毒素-抗毒素(TA)系统中的ToxSAS亚类^[

9]。然而，也有不属于TA系统的RSH蛋白显示出合成(p)ppApp的能力，例如在扭托甲基红杆菌(Methylorubrum extorquens)中发现的长RSH蛋白^{[参考文献 73

百度学术}73]，以及在枯草芽孢杆菌^{[参考文献 33

百度学术}33]和齿垢密螺旋体(Treponema denticola)中发现的SAS蛋白也具备合成(p)ppApp的能力^{[参考文献 74

百度学术}74]。

近期，在铜绿假单胞菌PA14株中发现了一种新型VI型分泌系统的效应蛋白，命名为Tas1 (PA14_01140)，其结构与RSH酶家族中的(p)ppGpp合成酶类似^[

13]，但它并不合成(p)ppGpp。相反，Tas1能够将ATP的焦磷酸基团转移到ADP和ATP的3′-OH基团上，分别合成ppApp和pppApp。VI型分泌系统帮助细菌能够直接向邻近细菌注射抗菌毒素。Tas1作为一种细菌间毒素，其生成(p)ppApp的效率非常高，每分钟可生成近180 000个分子的pApp、ppApp和pppApp，可导致目标细菌内的ATP快速消耗，干扰多个关键代谢途径，最终导致其他细菌死亡。同时，Tas1毒素的效果可以通过相应的免疫蛋白Tis1 (PA14_01130)来中和，Tis1直接与Tas1的活性中心结合，阻止其毒性作用。此外，SAH酶可通过降解(p)ppApp为宿主提供保护^{[参考文献 13

百度学术}13]，表明SAH酶在细菌间的竞争中也扮演着防御者的角色^{[参考文献 65

百度学术}65]。这些发现不仅加深了对(p)ppApp生物合成和功能的认识，还揭示了细菌间相互作用的新机制。

4.2 (p)ppApp的降解

现已证实SAH对(p)ppApp具有显著的水解活性。铜绿假单胞菌和齿垢密螺旋体中的SAH研究揭示了这些酶以Mn²⁺依赖的方式，非专一性地水解(p)ppGpp和(p)ppApp^[

65]。类似地，在野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)和人类(Homo sapiens)中，均发现了另一种具有双重活性的SAH也能水解(p)ppGpp和ppApp^{[参考文献 75-76}75-76]。此外，TA系统中FaRel (ToxSAS)的抗毒素ATFaRel (属于SAH家族)也能降解(p)ppGpp和ppApp，以防止FaRel介导的警报素中毒^{[参考文献 9

百度学术}9]。同时，也有SAH被发现仅水解(p)ppApp，而对(p)ppGpp无水解活性，比如扭托甲基红杆菌中的SAH^{[参考文献 75

百度学术}75]。然而，该酶的分布及其对(p)ppApp表现出特异性的分子基础，仍有待进一步研究。

最近，一种专门针对(p)ppApp的高效水解酶被发现并命名为Aph1 (adenosine 3′-pyrophosphohydrolase 1)。该蛋白首先在粪拟杆菌(Bacteroides caccae)中被发现，并在不同物种中呈现出保守性，表明Aph1在自然界中广泛分布^[

14]。粪拟杆菌Aph1 (BACCAC_01146)的晶体结构和活性分析揭示了其与其他(p)ppGpp水解酶之间具有显著区别，Aph1缺乏(p)ppGpp的结合位点，因此只水解(p)ppApp，且Aph1水解(p)ppApp的效率远高于其他已知的SAH蛋白。

Aph1位于一个包含MuF (protein F of temperate phage Mu)毒素Apk2的基因簇中，后者通过生成(p)ppApp来抑制大肠杆菌的生长。因此，Aph1是一种能够中和Apk2毒素效应的免疫蛋白。此外，Aph1与粪拟杆菌中另一种非酶性质的免疫蛋白Tis1协同作用，共同抵御毒素的影响。进一步的研究显示，aph基因的变异情况与Apk2同源物的多样性相匹配，这揭示了非酶类免疫蛋白在对抗毒素的过程中可能存在功能差异。综上所述，这些发现不仅增加了对(p)ppApp代谢调控网络的理解，也为开发全新的抗菌策略提供了思路。

5 总结与展望

(p)ppGpp作为微生物中的一种重要信号分子，参与多种生命过程的调控，包括细胞生长速率、RNA/DNA比率、核糖体RNA合成、转录起始，并能够助力宿主响应环境不良因素、适应不同生存环境。RSH (RelA/SpoT homologues)家族蛋白在细菌中广泛存在，是(p)ppGpp合成与降解的主要执行者，对于维持细胞内(p)ppGpp的动态平衡至关重要。由以上文献回顾发现，RSH家族包含多种亚类蛋白，且各亚类具有独特的结构组成和生化特性，这些特性可能在细菌适应特定环境、进行生存竞争中发挥着核心作用，并为其特异性生物学功能提供了理论基础。

(p)ppGpp的具体分子机制，特别是它如何精准调控细胞内的各种代谢活动，依然是一个需要深入探索的课题。当前的研究多集中于少数几种典型细菌(如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)，对于(p)ppGpp在不同微生物种类间所展现的作用差异及其背后的调控机制的认识仍有不足，特别是在病原菌中，它与毒力因子的表达、抗生素抗性等现象紧密相连，这些功能的具体机制仍有待进一步阐明。未来的研究应当更加关注非模式生物和致病菌株，以揭示更多的调控模式。

(p)ppGpp不仅作为独立的调控分子，还与其他重要的信号分子(如cAMP、c-di-GMP等)之间存在复杂的交互作用。这些交互作用在细菌的代谢调节、群体感应、生物膜形成等方面发挥着重要作用。未来的研究应深入探讨(p)ppGpp与其他信号分子之间的相互作用，揭示其在复杂生物网络中的调控机制。例如，(p)ppGpp可能通过调控转录因子DksA，影响RNA聚合酶的活性，进而调控基因表达；同时，它也可能与其他第二信使分子协同作用，共同调节细菌的生理状态。

深入理解(p)ppGpp在宿主-病原体互作中的具体功能，对于开发新型抗菌疗法具有重要意义。研究表明，(p)ppGpp不仅影响病原菌的毒力，还可能调控宿主的免疫反应。例如，(p)ppGpp的积累可能导致细菌进入持久态(persister cells)，这些持久态细菌对传统抗生素具有极高的耐药性，会导致慢性感染。此外，(p)ppGpp还可能通过调控细菌的代谢途径，影响宿主的免疫识别和炎症反应。因此，未来的研究应重点探讨(p)ppGpp在宿主-病原体互作中的具体功能，揭示其如何影响病原菌的毒力和宿主的免疫反应，为开发新型抗菌疗法提供理论依据。

鉴于(p)ppGpp在细菌生理和病理过程中的重要作用，深入研究RSH家族蛋白的结构及生化特性，并开发针对这些蛋白的(p)ppGpp合成或降解结构域的小分子抑制剂，可能为对抗细菌感染提供新的策略^[

77]。具体而言，未来的研究可以从以下几个方面展开：(1) 抑制(p)ppGpp合成：开发能够阻断RSH家族蛋白中GTP结合位点或转移焦磷酸基团催化中心的小分子药物，以干扰(p)ppGpp的合成途径。例如，设计针对RelA蛋白或SpoT蛋白GTP结合位点的抑制剂，阻止(p)ppGpp的生成，从而削弱细菌的严紧反应和生存能力。(2) 促进(p)ppGpp降解：设计能够增强RSH家族蛋白降解结构域活性的小分子，或者研发模拟天然(p)ppGpp水解酶的人工酶，以加速(p)ppGpp的降解。这将有助于恢复细菌正常的代谢状态，减少其对抗生素的耐药性。(3) 联合治疗策略：将上述小分子药物与其他抗生素或抗菌剂联合使用，以期产生协同效应，从而更有效地对抗细菌感染。例如，通过抑制(p)ppGpp的合成或促进其降解，可以降低细菌的耐药性，从而使传统抗生素重新发挥作用。

总之，(p)ppGpp作为细菌严紧反应的关键调控分子，其研究不仅有助于揭示微生物的基本生物学过程，还为开发新型抗菌药物提供了新的思路和方向。未来的研究将继续推动这一领域的进展，带来更多创新性的发现和应用。

作者贡献声明

王淼：论文撰写、绘图和修改；项雨霏：论文撰写和修改；贺龙龙：文献收集和论文指导；周秦：论文指导和审阅；许丹：论文构思、指导和审阅。

利益冲突

作者声明不存在任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。

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