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甘青特殊生境作物根腐类病害防病促生复合菌系构建  PDF

  • 李雪萍 1
  • 马佳璇 2
  • 许世洋 3
  • 孟欢 2
  • 李建军 1
  • 漆永红 1
1. 甘肃省农业科学院植物保护研究所 甘肃 兰州; 2. 甘肃农业大学 植物保护学院 甘肃 兰州; 3. 兰州大学 草地农业科技学院 甘肃 兰州

最近更新:2025-04-30

DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240671

CSTR: 32112.14.j.AMS.20240671

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摘要

目的

为甘肃省和青海省特殊生境作物根腐类病害提供绿色安全有效的防治措施。

方法

通过平板对峙法及孟金娜平板法对305株供试细菌进行初筛,对初筛得到的菌株利用发酵液法复筛,然后采用凯氏定氮法、紫外分光光度计法、火焰分光光度计法分别测定复筛后优良菌株的固氮、溶磷、解钾、分泌吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)、分泌铁载体、耐酸、耐碱及耐盐特性。最后针对甘肃省和青海省不同作物根腐类病害病原,将不同功能优良菌株进行复配构建防病促生复合菌系,测定其促生特性及抑菌能力,筛选得到最优复合菌系,分析其所涉及菌株的16S rRNA基因及gyrB基因序列,确定各菌株的分类地位,并通过盆栽法测定其防病促生作用。

结果

共筛选得到拮抗菌86株、溶磷菌134株。复筛得到拮抗菌20株,其中K87、LB17等菌株抑菌效果良好且抑菌谱广。K87对燕麦镰孢、木贼镰孢、尖镰孢、茄镰孢、微座孢的抑菌率分别为87.53%、74.90%、75.15%、79.69%、88.43%;LB17对尖镰孢、茄镰孢、麦根腐平脐蠕孢的抑菌率分别为61.89%、87.52%、87.23%。对8株优良菌促生能力的测定发现:LB17分泌铁载体能力最强,铁载体活性单位(su)值为0.32;K113固氮性能较好,固氮量为0.08 g/L;K87分泌IAA量最高,达9.87 mg/L;MP6溶无机磷量最大,为1 470.69 μg/mL;K85溶有机磷效果最好,溶磷量为1 321.23 μg/mL;MP41解钾性能最好,解钾量为140.33 mg/L。最终构建形成优良复合菌系14组,其中复合菌系T2综合性能最优,固氮量为0.212 g/L,解钾量为86.28 mg/L,分泌IAA量为16.91 mg/L,对6种病原真菌的抑菌率均大于60.00%,对木贼镰孢的抑菌率为87.69%。所涉及菌株LB17、K87、MP6均被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),对青稞根腐类病害的防效均在70.00%以上,且促生效果明显。

结论

本研究构建形成了一种甘青特殊生境作物根腐类病害高效防病促生复合菌系。

甘青(甘肃省、青海省)地区海拔高,光照充足,年均温度低,温差大,适合青稞、百合以及各种高原夏菜的种植及生[

1]。其中,青稞喜凉耐寒,在甘肃省甘南藏族自治州、青海省西宁市周边、海北州、海南州、海西州、黄南州、玉树州和果洛州均有分[2-3]。其营养价值丰富,具有提高人体免疫力预防心脑血管疾病等功效,是当地藏区人民的主要粮饲作[4]。兰州百合喜冷凉湿润,主要分布在兰州市及周边地区,其口感甜美酥脆,具有降低视觉疲劳、抗氧化、调节人体免疫系统、稳定血糖等功效,是著名的保健食[5-8]。辣椒、番茄是甘肃省高原夏菜的主要品类,对菜农增收的贡献率超过60%,是当地农村的支柱产[9-10]。然而,由于甘青地区多山脉,农业区面积占比小,甘肃省和青海省的耕种面积的分别占全省面积12.62%[11]和2.84%[12],连作现象严重,根腐类等土传病害易发。

根腐类病害在青稞上发生普遍。研究发现,镰孢根腐[

13-14]、普通根腐[15]、微座孢根腐[16]、粉红粘帚霉根腐[17]是甘青地区青稞根腐病的4种常见类型。镰孢根腐病分布最广泛且病原种类多样,平均发病率约20%,其优势病原为燕麦镰孢(Fusarium avenaceum)和木贼镰孢(Fusarium equiseti)[13-14]。普通根腐病的平均发生率为5%-15%,优势病原为麦根腐平脐蠕孢(Bipolaris sorokiniana)[15]。微座孢根腐病和粉红粘帚霉根腐病的病原分别为微座孢(Microdochium bolleyi)和粉红粘帚霉(Clonostachys rosea),仅在青海地区零星发病,但危害严重,致死率可达100%[16-17]。百合根腐类病害危害严重且隐蔽,包括枯萎病和根腐病2种常见病害类型。枯萎病分布广泛,发病率较高,部分地区发病率达到70%以[18],尖镰孢(Fusarium oxysporum)常为优势病原类群,致病性较[19]。百合根腐病的发生率多在25%左右,其中茄镰孢百合专化型为百合根腐病的优势病[20]。辣椒、番茄等蔬菜的根腐病发生率普遍在20%-30%之间,辣椒感染根腐病后,严重时产量减少60%以上;番茄感染根腐病后普遍减产60%-90%,甚至造成绝[21],其优势病原均为尖镰孢和茄镰孢。

利用微生物菌剂防治根腐类病害是当前主要的生物防治手段,根据复合方式不同可分为微生物菌剂和复合微生物菌[

22]。微生物菌剂可直接或间接改善土壤营养状况,防治土传性病害,提高根系对养分的吸收利用,从而提高作物品质和产[23-24]。吕亮雨[25]发现,施用微生物菌剂后土壤有机质含量提高,作物吸收利用碱解氮、速效磷、速效钾等元素的能力大幅提高。Tu[26]研究发现,解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌对百合枯萎病的防治效果良好,分别可达58.74%和68.93%。复合微生物菌剂由几种特定功能的有益微生物组成,在维持根际土壤生态环境平衡的同时,提高了微生物多样性和群落稳定性,进一步提高了病害抑制[27-30]。丁钱[31]研究发现,枯草芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌单菌株分别对小麦根腐病的防效为23.7%、39.7%、9.6%,制成复合菌剂后防效可达68.9%,远高于单一菌剂。卯婷婷[32]研究发现,复合菌剂(枯草芽孢杆菌+粉红粘帚霉)对辣椒枯萎病的防效可达60.5%。王子凡[33]研究发现,施用复合微生物菌剂可显著提高土壤中的微生物数量,土壤细菌群落增加136.32%。然而,微生物菌剂多为活菌产品,具有地域性,引进菌剂难以适应且稳定性差,针对甘青特殊区域特色作物的本土复合微生物菌剂研究较少。鉴于此,本研究针对甘青特殊生境作物青稞、兰州百合、辣椒及番茄等筛选防病促生菌株,研究优良菌株的固氮、溶磷、解钾、分泌吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)及铁载体等促生特性,以及耐酸、耐碱和耐盐能力,选取最优菌株明确其互作效应,针对不同作物不同病原构建复合菌系,并测定其防病促生功能,综合评价得到最优复合菌系,为甘青地区特殊生境作物根腐类病害的防控提供有效的菌剂配方及菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病原真菌

燕麦镰孢(Fusarium avenaceum)、木贼镰孢(Fusarium equiseti)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、茄镰孢(Fusarium solani)、麦根腐平脐蠕孢(Bipolaris sorokiniana)、微座孢(Microdochium bolleyi),均来源于甘肃省农业科学院植物保护研究所经济作物病害研究室。

1.1.2 供试菌株

305株供试菌株,均为甘肃省农业科学院植物保护研究所经济作物病害研究室自主分离保藏,分离自青稞、百合、番茄、辣椒根际及根际土壤。

1.1.3 培养基

LB培养基、PDA培养基(potato dextrose agar)、PKO无机磷培养基(Pikovaskaia’s)、蒙金娜有机磷培养基、NFM无氮培养基(nitrogen free medium)和钾长石培养基参考文献[

34]配制;King’s B培养基参考文献[35]配制。上述培养基中不加入琼脂即为其培养液。

1.2 防病促生菌初筛

分别将供试病原真菌及防病促生菌活化后,采用平板对峙[

36]对拮抗菌进行初筛。将已活化的病原真菌菌饼(d=0.6 cm)接种于PDA培养基中央,同时在四周等距离处接种已活化的细菌,置于25 ℃恒温培养箱中培养7 d后,测定抑菌圈直径。同时将已活化的细菌接种于蒙金娜有机磷平板,5 d后观察是否产生溶磷圈,并测定溶磷圈直[36]

1.3 菌株复筛

参考李雪萍[

36]方法,将筛选得到的同时具有拮抗和溶磷能力的菌株接入LB培养液中,30 ℃、180 r/min摇床培养48 h后,将菌液装入10 mL离心管中,4 ℃、12 000 r/min离心10 min,用无菌针管(10 mL)吸取上清液1 mL,经0.22 µm微孔滤膜过滤后,滤液涂布于PDA平板上,制成带毒平板,并以未涂布无菌发酵液的PDA平板作为对照,分别接入供试病原真菌(菌饼直径0.6 cm),每处理3重复,于25 ℃下恒温培养7 d后,测量病原菌菌落直径,计算生长抑制[36],如公式(1)所示。

生长抑制率=(对照平板病原菌菌落直径-带毒平板病原菌菌落直径)/(对照平板菌落直径-接入菌饼直径)×100% (1)

1.4 优良菌株促生特性测定

选取1.3中抑菌率最为优良的菌株,活化后接入LB培养液中,30 ℃、180 r/min摇床培养48 h后,按照许世洋[

34]的方法,采用钼锑抗比色法测定磷含量、凯氏定氮法测定氮含量、火焰分光光度法测定可溶性钾含量;参考韦鑫[37]的方法,采用分光光度计法测定铁载体活性,如公式(2)所示;培养5 d后,参考程鑫宇[35]方法,采用紫外分光光度计法测定发酵液中IAA的含量。

铁载体活性单位(su)=[(Ar-As)/Ar] (2)

式中:Ar为不接菌培养液吸光值,As为接菌培养后处理组吸光值。

1.5 优良菌株耐酸、耐碱及耐盐特性

参考王艳霞[

38]的方法,对筛选得到的菌株进行活化,取1 mL活化后OD660值≥0.5的菌液,分别接入pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的培养液中,以及盐(NaCl)浓度为1%、5%、10%、15%、20%的LB培养液中,30 ℃、180 r/min摇床培养48 h,采用分光光度法测定各菌液OD660值。

1.6 防病促生复合菌系的构建与筛选

采用两两十字划线[

34]测定优良菌株之间是否存在拮抗作用。针对不同病原选取互相无拮抗作用且功能不同的菌株进行组合形成不同的复合菌系配方。根据各配方取1 mL活化后OD660值≥0.5的菌液,按照体积比1:1接入三角瓶中(装液量100 mL/250 mL),30 ℃、180 r/min摇床培养48 h,形成复合菌系,每菌系3重复。按照1.4的方法测定各复合菌系的溶磷量、固氮量、解钾量、分泌IAA及分泌铁载体能力,进行综合分析得到优良复合菌系。最后按照菌株复筛的方法测定优良复合菌系的抑菌能力,确定抑菌能力最强的菌系为最优复合菌系。

1.7 最优复合菌系菌种鉴定

采用DNA提取试剂盒(Bacterial DNA Kit,Omega Bio-tek公司),按照其说明书提取筛选得到的最优复合菌系所涉及菌株的DNA,16S rRNA基因通用引物(27F:5′-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3′;1492R:5′-TACGGCTACCT TGTTACGACTT-3′)、gyrB引物(F:5′-GAAGT CATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′;R:5′-AGCAGGGTACGGATGTG CGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′)进行PCR扩[

39]。PCR反应体系(25 μL):正、反向引物(10 μmol/L)各1 μL,DNA模板1 μL,2×PCR Mix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR反应程序:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35个循环;72 ℃终延伸10 min。经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后,委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序结果在NCBI中进行BLAST同源性比对,选取相似序列及外源基因序列,利用MEGA 11.0软件中的邻接法构建系统发育树,并以Bootstrap 1 000重复检验其可信度。

1.8 最优复合菌系的防病促生作用

以青稞镰孢根腐病、微座孢根腐病及普通根腐病为靶标,采用盆栽法对最优复合菌系T2的防病促生作用进行测定,参考李雪萍[

13]的方法对青稞进行催芽处理及移栽,生长10 d后,挑选长势相近的青稞幼苗并标记。设置6个处理:对照组CK1 (燕麦镰孢+木贼镰孢灌根)、CK2 (微座孢灌根)、CK3 (麦根腐平脐蠕孢灌根)及处理组M1 (T2复合菌系+燕麦镰孢+木贼镰孢灌根)、M2 (T2复合菌系+微座孢灌根)、M3 (T2复合菌系+麦根腐平脐蠕孢灌根),每处理3重复,每重复10株,各处理接入病原菌孢子悬浮液30 mL (孢子浓度为2×106 CFU/mL)。4 d后,CK1、CK2、CK3用LB培养液灌根(30 mL/株),M1、M2、M3用4×108 CFU/mL的复合菌系T2发酵液灌根(30 mL/株)。10 d后统计病情指数、株高、茎粗等指标。参考文献[13,15-16]的分级标准,计算病情指数和防效,如公式(3)公式(4)所示。

病情指数=∑(病级株数×代表数值)/株数总和×发病最重级的代表数值×100 (3)
防效=(对照组发病率-处理组发病率)/对照组发病率×100% (4)

1.9 数据统计与分析

采用Excel软件进行数据整理及作图,使用DPS15.2软件进行方差分析(Duncan’s检验)和综合分析(Topsis法)[

34]

2 结果与分析

2.1 菌株初筛

2.1.1 拮抗菌初筛

表1所示,共筛选得到拮抗菌86株。其中,15株菌对燕麦镰孢的拮抗效果较好,K87的抑菌圈直径最大,为15.28 mm,其余菌株的抑菌圈直径在8.78-15.11 mm之间。53株菌对木贼镰孢的拮抗效果较好,其中21株的抑菌圈直径大于30 mm,超过59%的拮抗菌株对其他病原也表现出不同程度的拮抗作用。27株菌对尖镰孢的拮抗效果较好,抑菌圈直径范围在22.48-33.16 mm之间。35株菌对茄镰孢拮抗效果较好,抑菌圈直径最大可达38.52 mm,最小为10.8 mm,拮抗能力差异较大。仅6株菌对麦根腐平脐蠕孢的拮抗效果较好,抑菌圈直径范围在12.70-21.71 mm之间,且这6株菌对本研究中的其余3种以上病原菌均有拮抗效果。32株菌对微座孢的拮抗效果较好,抑菌圈直径最大为30.99 mm,最小为16.94 mm。图1为部分拮抗菌的拮抗效果图。

表1  拮抗菌抑菌圈直径
Table 1  Inhibition zone diameter of the antagonistic bacteria
Target pathogenStrain No.IZD (mm)Target pathogenStrain No.IZD (mm)Target pathogenStrain No.IZD (mm)
Fusarium avenaceum K87 15.28±0.16a K103 15.58±0.09tuv LB7 23.35±1.18jkl
K11 15.11±0.40a K120 14.93±0.13uv LB6 23.12±0.51kl
K91 14.53±0.44ab K110 14.45±0.41vw LB33 22.24±0.88lm
K38 14.43±0.16ab K118 13.39±0.26wx LB35 22.05±0.57lm
K37 13.73±0.30bc LB3 13.01±0.25wxy LB26 21.34±0.60mn
K79 13.71±0.24bc LB4 12.67±0.38xy K96 21.33±0.57mn
K12 12.94±0.27cd LB13 12.34±0.53xy K105 21.17±0.36mno
K34 14.42±0.31ab LB5 11.61±0.42yz LB8 21.00±0.99mno
LB35 12.00±0.44de K86 11.43±0.23yz LB5 20.86±0.94mno
K102 11.94±0.03de K121 10.68±0.33z LB44 19.97±0.24nop
LB33 11.25±0.50ef LB36 31.61±0.43j LB13 19.46±0.22op
LB11 10.94±0.48ef LB40 18.39±0.36r LB4 18.70±0.88pq
K71 10.53±0.38f Fusarium oxysporum K33 33.16±0.55a K100 17.59±0.33qr
LB10 8.78±0.15g K102 31.69±0.24ab K98 17.44±0.28qr
LB16 12.01±0.49de K91 30.47±1.14abc LB16 16.67±0.11rs
Fusarium equiseti K91 42.23±0.16a K29 30.01±0.93abcd K89 16.61±0.41rs
LB44 41.59±1.24a N22 27.45±0.56bcde K119 15.41±0.16s
K115 38.72±0.08b K87 27.35±0.76bcdef K56 10.80±0.36t
K105 38.69±0.33b K117 27.22±5.95bcdef Bipolaris sorokiniana LB17 21.71±0.03a
K113 38.32±0.53bc K12 26.54±0.91cdefg K91 20.55±0.02b
LB35 37.47±1.21bc LB33 26.42±0.71cdefg K33 11.37±0.01e
LB17 36.83±0.51cd LB64 26.02±0.23cdefgh LB33 9.28±0.03f
K87 35.86±0.46de N20 25.32±0.80defgh K102 13.74±0.06c
LB33 35.53±0.36def K16 25.18±0.49efgh K34 12.70±0.10d
K56 35.21±0.07efg K71 24.66±0.90efgh Microdochium bolleyi K102 30.99±0.52a
LB2 34.71±0.36efgh LB67 24.56±0.57efgh K87 30.69±0.51a
LB11 34.63±0.28efgh K34 24.32±2.45efghi LB10 28.26±0.41b
LB27 16.17±0.75tu K93 23.60±0.49efghi K119 27.50±0.63bc
K96 26.09±0.32lmn LB7 23.57±0.68efghi LB33 27.47±0.76bc
K102 34.20±0.54fgh LB6 23.29±1.80efghi LB11 27.46±0.27bc
LB26 33.98±0.51fgh LB75 22.13±0.56ghij MP2 27.09±0.27bcd
LB16 33.73±0.55gh LB73 21.34±0.54hij LB30 26.10±0.87cde
LB15 33.42±0.37hi K37 21.33±0.73hij LB35 25.91±0.65cde
K85 32.07±0.33ij LB34 19.77±0.56ijk LB31 25.62±0.64de
K117 31.69±0.32j K79 18.46±0.95jk LB27 25.49±0.22de
LB32 31.48±0.14j LB26 17.89±0.46jk LB7 24.62±0.90ef
LB28 30.50±0.44jk LB28 16.12±0.21k K118 24.61±0.08ef
LB1 29.93±0.90k K26 25.57±0.51defgh K117 24.50±0.30ef
LB10 29.63±1.39k K11 22.48±0.73fghij MP8 24.46±0.39ef
LB20 27.51±0.16l Fusarium solani K87 38.52±0.46a LB32 23.72±0.64fg
LB7 27.50±0.68l LB17 37.10±0.80ab K100 22.98±0.08fgh
LB14 26.47±0.89lm K116 36.34±0.44b LB16 22.94±0.38fgh
K119 25.88±0.15mn K114 34.26±0.62c K86 22.27±0.55ghi
LB34 25.64±0.38mn K113 34.22±0.39c LB40 21.97±0.89hij
LB8 25.11±0.68mn LB20 31.14±0.40d LB34 21.95±0.58hij
K51 24.71±0.15n LB15 30.62±0.24d LB37 21.65±0.36hijk
LB25 22.75±0.35o K85 30.20±0.59de K91 21.39±0.69hijk
LB21 22.10±0.77op LB14 29.82±0.71def LB24 21.14±0.89ijk
N66 21.40±0.30opq K91 28.89±0.62efg MP14 20.39±0.02jkl
LB24 21.31±0.53opq K102 28.48±0.19fgh LB9 19.97±0.52kl
LB37 21.03±0.21pq K115 28.03±0.24ghi LB18 19.90±0.22kl
N48 19.99±0.33q LB2 27.18±0.12hi MP13 19.34±0.78l
LB38 18.35±0.39r LB11 26.55±0.03i MP16 19.24±0.43l
LB19 17.76±0.28rs LB28 24.97±0.24j K89 19.16±0.20l
K98 16.67±0.37st LB21 24.12±0.88jk MP12 17.49±0.60m
LB6 15.97±0.14tuv LB10 24.05±0.18jk MP17 16.94±0.56m

IZD indicates inhibition zone diameter of the antagonistic bacteria. The data are expressed by mean±SD, and different lowercase letters after the same column indicate significant differences (P<0.05). The same as below.

fig

图1  部分拮抗菌的抑菌效果

Figure 1  Antifungal effects of partial antagonistic bacteria.

2.1.2 溶磷菌初筛

表2所示,共筛选得到溶磷菌134株。其中,MP6、MP41、K87的溶磷圈直径最大,分别为37.79、35.67、32.89 mm;K85次之,溶磷圈直径为27.49 mm;K102等5株菌的溶磷圈直径在15-20 mm之间,其余菌株的溶磷圈直径均在15 mm以下,80%的菌株溶磷圈直径在10 mm左右。图2为部分溶磷菌的溶磷效果图。

表2  溶磷菌溶磷圈直径
Table 2  Solubilization zone diameter of the phosphate-solubilizing bacteria
No.PSZD (mm)No.PSZD (mm)No.PSZD (mm)No.PSZD (mm)No.PSZD (mm)
CK 0.00±0.00 K38 11.21±0.01 K115 8.88±0.01 K17 10.78±0.20 MP8 8.83±0.03
K86 7.33±0.02 K37 10.97±0.04 K116 9.68±0.02 K6 9.76±0.02 MP12 13.64±0.04
K87 32.89±0.01 K79 12.59±0.01 K92 11.81±0.01 K5 7.76±0.02 MP13 13.68±0.01
K89 8.65±0.05 K12 7.01±0.01 K93 8.77±0.03 MP1 10.84±0.03 MP14 9.60±0.01
K91 10.27±0.03 K71 8.58±0.02 K94 11.54±0.02 MP7 11.19±0.05 MP16 6.75±0.07
K100 8.25±0.03 MP41 35.67±0.02 K95 7.41±0.02 MP10 11.23±0.07 MP17 7.82±0.04
K102 17.67±0.20 MP6 37.79±0.02 K72 11.21±0.01 MP11 10.19±0.05 K110 8.50±0.03
K117 9.93±3.34 MP9 16.49±0.02 K73 9.98±0.01 MP29 10.23±0.07 K112 6.90±0.01
K118 8.37±0.04 MP5 9.69±0.01 K74 12.98±0.01 MP28 9.23±0.07 K113 8.70±0.67
K119 14.29±0.01 MP3 8.71±0.01 K75 9.45±0.01 MP26 7.81±0.07 K114 11.28±0.01
LB7 9.59±0.03 K53 7.76±0.05 MP31 7.45±0.01 MP25 8.73±0.07 K34 10.90±0.01
LB9 15.56±0.06 K52 10.48±0.03 MP32 12.66±0.01 LB21 13.23±0.07 LB17 16.69±0.01
LB10 9.48±0.13 K61 8.38±0.01 MP33 9.24±0.01 LB22 8.99±0.06 K16 11.22±0.40
LB11 7.90±0.04 K62 13.26±0.02 K63 8.40±0.01 LB23 10.29±0.05 K45 13.74±0.01
LB16 11.68±0.01 K67 8.47±0.02 K35 7.30±0.02 LB25 8.29±0.05 K57 13.21±0.01
LB18 8.85±0.04 K85 27.49±0.01 K21 8.50±0.01 LB28 9.17±0.03 K11 7.85±0.03
LB24 12.77±0.03 K90 9.53±0.10 K22 9.70±0.01 LB38 9.84±0.02 K42 11.05±0.01
LB27 6.24±0.04 K108 8.58±0.29 K23 10.26±0.03 LB3 10.25±0.02 K58 8.10±0.01
LB30 12.39±0.01 K107 7.89±0.01 K24 8.64±0.01 LB2 7.25±0.02 K65 10.77±0.01
LB31 16.68±0.21 LB36 11.68±0.01 K25 7.90±0.01 LB29 13.28±0.02 K43 10.98±0.01
LB32 8.32±0.04 LB8 13.36±0.02 K26 7.75±0.21 K40 7.43±0.02 K44 11.43±0.01
LB33 11.62±0.04 LB6 7.38±0.09 K27 7.48±0.42 K41 8.56±0.02 K33 16.31±0.02
LB34 5.16±0.92 LB5 8.93±0.01 K28 10.79±0.42 MP36 7.31±0.01 MP2 16.34±0.04
LB35 7.60±0.01 LB1 8.72±0.03 K31 10.94±0.42 MP39 9.23±0.01 K104 9.85±0.03
LB37 7.41±0.02 K103 11.08±0.03 K13 13.26±0.42 MP40 7.23±0.01 K15 11.62±0.39
LB40 10.29±0.01 K105 10.86±0.02 K14 8.69±0.39 K111 10.91±0.01 MP34 12.24±0.02

PSZD indicates solubilization zone diameter of the phosphate-solubilizing bacteria.

fig

图2  部分溶磷菌的溶磷效果

Figure 2  Solubilization effects of partial phosphate-solubilizing bacteria.

2.2 菌株复筛

复筛共得到20株抑菌效果良好的菌株(表3),部分菌株抑菌效果如图3所示。其中,K87对5种病原[燕麦镰孢(F. avenaceum)、尖镰孢(F. oxysporum)、茄镰孢(F. solani)、麦根腐平脐乳孢(B. sorokiniana)、微座孢(M. bolleyi)]均有良好的抑制效果,抑菌率均在75.00%以上。LB17对4种病原[尖镰孢(F. oxysporum)、茄镰孢F. solani)、麦根腐平脐蠕孢(B. sorokiniana)、微座孢(M. bolleyi)]均有抑制作用,抑菌率均超过61.00%。针对不同病原菌,11株菌对燕麦镰孢的抑菌效果较好,抑菌率在44.79%-87.54%之间;10株菌对木贼镰孢的抑菌效果较好,抑菌率在61.89%-92.88%之间。对尖镰孢抑菌效果良好的菌株数最多,共12株,占初筛菌株的59%,其中抑菌率最高为80.18%;6株菌对茄镰孢的抑菌效果良好,抑菌率均在69.00%以上;对麦根腐平脐蠕孢抑菌效果较好的菌株仅有6株,最高抑制率为87.23%,最低为53.36%;对微座孢抑制效果较好的菌株有11株,占初筛有抑菌能力菌株的34%,最高抑菌率可达92.55%。

表3  拮抗菌的抑菌率
Table 3  Antifungal rate of the antagonistic bacteria
Target pathogenStrain No.Antifungal rate (%)Target pathogenStrain No.Antifungal rate (%)
Fusarium avenaceum K56 87.54±0.01a Fusarium oxysporum K71 72.02±0.02j
K87 87.53±0.02a K11 65.70±0.02k
K37 66.52±0.06b LB16 61.31±0.01lmn
LB16 66.05±0.03bc K34 61.21±0.01lmn
LB35 56.87±0.02de K21 65.70±0.02k
K11 55.46±0.01def Fusarium solani LB17 87.52±0.01a
K91 54.86±0.03efg K11 83.09±0.01b
K34 53.89±0.04efgh K87 79.69±0.01c
K38 52.14±0.02fghi K38 69.04±0.04d
LB33 49.80±0.05hij K21 79.74±0.01c
K79 44.79±0.02k K102 79.74±0.02c
Fusarium equiseti K102 92.88±0.02a Bipolaris sorokiniana LB17 87.23±0.03a
LB64 82.01±0.03b K91 82.47±0.02b
K91 81.23±0.01bc K34 57.61±0.01de
K34 79.92±0.04cd K33 53.36±0.03f
K21 79.43±0.02cd K102 66.81±0.02c
K56 78.06±0.05de LB33 58.09±0.01d
K87 74.90±0.01fgh Microdochium bolleyi LB33 92.55±0.01a
K117 74.92±0.02fgh K33 89.69±0.02c
LB33 73.75±0.02h K37 89.17±0.02c
LB17 61.89±0.01i K34 89.04±0.01c
Fusarium oxysporum LB33 80.18±0.03ab K20 88.58±0.03cd
K33 78.99±0.04bc K87 88.43±0.04cd
K37 78.14±0.02bcd K56 65.63±0.01e
K38 75.40±0.01ef LB17 57.37±0.01f
K87 75.15±0.01efg K91 54.54±0.01g
K102 75.05±0.02efgh K71 45.16±0.03h
LB34 74.39±0.01fghi LB64 91.50±0.04ab
fig

图3  部分拮抗菌发酵液抑菌效果

Figure 3  Antifungal efficacy of the fermentation broth from selected antagonistic bacteria.

2.3 优良菌株的促生特性

表4可知,LB17分泌铁载体能力最强,su值为0.32,同时其溶无机磷能力较强,为1 102.95 μg/mL。K113固氮能力最强,固氮量为0.08 g/L,其余菌株固氮量则在0.04-0.06 g/L之间。K87分泌IAA能力最强,可达9.87 mg/L,其余菌株分泌IAA能力较弱,为5.69-6.85 mg/L。K85溶有机磷能力最强,为1 321.23 μg/mL,同时分泌铁载体su值在0.2以上。MP6溶无机磷能力最强,为1 470.69 μg/mL,同时具有良好的溶有机磷(1 141.86 μg/mL)及解钾(40.90 mg/L)能力。MP41解钾能力最强,为140.33 mg/L。

表4  优良菌株的促生特性
Table 4  Plant growth-promoting potential of the superior strains
Strain No.

Nitrogen-fixing

quantity (g/L)

Dissolved inorganic phosphorus (μg/mL)

Dissolved organic phosphorus

(μg/mL)

Potassium-releasing quantity (mg/L)

Producing

IAA (mg/L)

Producing

siderophore (su)

CK 0.000 0±0.000 1 0.00±0.01 0.00±0.01 0.00±0.01 0.000±0.001 0.000 0±0.000 1
LB17 0.051 2±0.000 2d 1 102.95±0.02b 586.45±0.03e 43.17±0.02b 5.687±0.001g 0.320 0±0.043 0a
K113 0.080 3±0.000 4a 909.84±0.04d 744.68±0.07d 33.70±0.02g 6.781±0.005c 0.310 2±0.000 3a
K87 0.059 6±0.001 6c 367.63±0.13h 432.79±0.10g 25.75±0.02h 9.873±0.003a 0.263 7±0.000 3b
K85 0.060 2±0.002 0b 949.69±0.09c 1 321.23±0.09a 35.52±0.03ef 5.790±0.006f 0.258 0±0.001 2b
MP6 0.060 6±0.002 0b 1 470.69±0.20a 1 141.86±0.04c 40.90±0.02c 6.672±0.023d 0.170 6±0.000 3c
K33 0.042 8±0.000 3e 569.64±0.01f 436.47±0.03f 36.23±0.03d 5.950±0.001e 0.170 2±0.000 3c
K56 0.043 6±0.000 3f 458.87±0.02g 336.92±0.04h 35.86±0.03de 6.649±0.012d 0.133 4±0.000 7d
MP41 0.053 7±0.000 4cd 742.27±0.02e 1 272.80±0.04b 140.33±0.03a 6.852±0.008b 0.132 9±0.000 6d

2.4 优良菌株耐酸、耐碱、耐盐能力

2.4.1 耐酸能力

图4所示,测定优良菌株的耐酸能力发现,各菌株在pH 7.0条件下OD660值最高,均大于2.0。在pH 5.0时,菌株K56和MP41的OD660值降低至0.9以下,说明菌株K56和MP41耐酸性较差,其余菌株的OD660值虽有所降低,但均在1.5-1.7之间。在pH 4.0的培养液中,K56几乎不生长,MP41、K87、K33的OD660值高于1.6,表明MP41、K87、K33具有较好的耐酸能力。在pH 3.0条件下,各菌株的OD660值均接近CK,低于0.02,说明各菌株在pH 3.0环境下均不能生长。因此,确定在pH 4.0、5.0、6.0条件下均生长良好的菌株LB17、K87、K113为耐酸菌株。

fig

图4  优良菌株的耐酸能力

Figure 4  Acid tolerance of the superior strains.

2.4.2 耐碱能力

图5所示,当培养液pH值为8.0时,各菌株OD660值下降,但除LB17、K113外均大于1.5。当培养液pH达到9.0及以上时,各菌株OD660值均显著下降,但MP6在pH 10.0以上溶液中的OD660值显著高于(P<0.05)其他菌株。因此,确定MP6为耐碱菌株。

fig

图5  优良菌株的耐碱能力

Figure 5  Alkali tolerance of the superior strains.

2.4.3 耐盐能力

图6所示,各菌株在盐浓度为1%时,OD660值均大于2.0,生长情况良好。当盐浓度达到5%时,各菌株OD660值显著下降(P<0.05),其中菌株K85、K113、K33、K56的OD660值均小于1.3。当盐浓度达到10%时,K113、K33、K56的OD660值接近0.2,说明10%的盐浓度完全抑制了K113、K33、K56的生长,而LB17、MP41、K85、K87的OD660值仍大于1.1。当盐浓度达到15%及20%时,各菌株OD660值极低,不具参考性。因此,确定在5%和10%盐浓度下生长均良好的菌株LB17、MP41、K87为耐盐菌株。

fig

图6  优良菌株的耐盐能力

Figure 6  Salt tolerance of the superior strains.

2.5 优良防病促生复合菌系构建与筛选

2.5.1 优良菌株间的互作效应

图7所示,菌株K87与菌株MP41相交处断开,说明两者可能存在拮抗作用,因此在构建复合菌系时,应避免将这2株菌组合在同一复合菌系中。其余菌株间未出现此现象,可以互相组合。组合结果发现,针对不同病原,将不同功能菌株组合,共形成14组(T1-T10、T12-T15)菌系配方(表5)。

fig

图7  优良菌株间的互作效应

Figure 7  Compatibility of the superior strains.

表5  优良复合菌系的促生特性
Table 5  Plant growth-promoting potential of the superior bacterial consortia
Bacterial consortium

Nitrogen-fixing quantity

(g/L)

Potassium-releasing quantity (mg/L)Dissolved organic phosphorus (μg/mL)Dissolved inorganic phosphorus (μg/mL)

Producing

IAA (mg/L)

Producing

siderophore (su)

Comprehensive analysis

T1

(K87+LB17)

0.107 1±0.000 2e 84.00±0.10b 300.56±2.03g 351.86±2.30d 9.94±0.02m 0.276 0±0.001 2f 0.302

T2

(K87+LB17+MP6)

0.212 0±0.000 0a 86.28±0.10a 346.50±0.77e 413.11±2.03c 16.91±0.05h 0.328 4±0.000 3e 0.611

T3

(K87+LB17+MP6+K85)

0.018 9±0.000 1k 71.78±0.10f 437.60±2.03b 419.23±1.53b 18.56±0.03e 0.181 6±0.001 3j 0.376

T4

(K56+LB17)

0.012 1±0.000 1l 43.01±0.01h 255.40±0.01i 299.80±0.77f 51.63±0.09a 0.210 9±0.000 3i 0.464

T5

(K56+LB17+K113)

0.104 7±0.000 2f 39.72±0.03l 322.77±2.03f 328.13±3.05e 19.39±0.03d 0.368 6±0.000 3c 0.434

T6

(K56+LB17+MP6+K113)

0.011 1±0.000 0l 43.97±0.01g 263.25±3.63i 273.00±0.77g 20.28±0.01c 0.176 6±0.001 5k 0.249

T7

(K33+LB17)

0.045 3±0.000 1i 41.30±0.01k 386.31±1.33d 409.43±0.15c 15.59±0.00j 0.260 0±0.000 9g 0.320

T8

(K33+LB17+MP6)

0.018 0±0.000 0k 42.12±0.03j 403.91±0.77c 413.25±2.66c 15.00±0.04kl 0.339 2±0.000 9d 0.335

T9

(K33+LB17+MP6+K113)

0.149 2±0.000 0b 80.40±0.01e 259.22±1.53i 275.50±2.63g 18.28±0.02f 0.112 7±0.000 0m 0.471

T10

(MP6+K85+MP41+K113)

0.037 2±0.000 3j 42.19±0.03j 281.43±1.53h 298.27±2.03f 23.54±0.02b 0.226 9±0.000 6h 0.306

T12

(K113+MP41)

0.073 0±0.002 5h 30.37±0.03m 212.98±8.68k 233.19±1.53i 14.98±0.02l 0.164 1±0.000 9l 0.234

T13

(LB17+K113+MP41)

0.141 0±0.000 0c 81.26±0.01c 482.00±0.77a 425.35±0.01a 15.10±0.05k 0.470 2±0.000 9a 0.579

T14

(K87+LB17+MP6+K113)

0.077 6±0.000 0g 80.78±0.10d 257.69±0.01i 348.02±0.01d 15.88±0.03i 0.413 6±0.001 2b 0.464

T15

(K87+LB17+MP6+MP41)

0.135 2±0.000 1d 42.82±0.01i 233.19±2.03j 247.74±1.53h 18.11±0.04g 0.112 2±0.000 3m 0.376

2.5.2 复合菌系的促生特性

表5所示,在14组复合菌系中,T2的固氮量和解钾量最高,分别为0.212 0 g/L和86.28 mg/L。T13的溶有机磷量、溶无机磷量及分泌铁载体量最高,分别为482.00 μg/mL、425.35 μg/mL和su值0.4702;T4分泌IAA能力最强,为51.63 mg/L。Topsis综合评价显示,T2和T13的统计量分别为0.611和0.579,高于其他组,因此确定为优良复合菌系配方。

2.5.3 优良复合菌系的抑菌特性

图8所示,复合菌系T2的抑菌性较T13更强,对木贼镰孢的抑菌率最高,达87.69%,对茄镰孢和微座孢的抑菌率分别为77.84%和76.71%;对燕麦镰孢、尖镰孢、麦根腐平脐蠕孢的抑菌率分别为60.26%、65.71%和64.46%。复合菌系T13对供试真菌的抑菌性也较强,对麦根腐平脐蠕孢的抑制效果最强,为64.45%,其次是木贼镰孢,抑菌率为63.68%;对微座孢、燕麦镰孢的抑菌率分别为47.45%和53.99%,而对茄镰孢、尖镰孢的抑菌率较低,分别为19.47%和19.56%,且普遍低于T2。因此,确定T2为最优复合菌系。

fig

图8  优良复合菌系对病原真菌的抑菌率

Figure 8  Antifungal rate of the superior bacterial consortia against pathogenic fungi.

2.6 最优复合菌系菌种鉴定

图9所示,基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树显示,最优复合菌系T2所涉及的菌株LB17、K87和MP6与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的遗传距离均小于0.01,1 000次重复自展支持率为99,其序列提交至GenBank,获得登录号分别为PQ211017、PQ211018、PQ211019。进一步构建其gyrB序列系统发育树(图9)发现,LB17和K87与贝莱斯芽孢杆菌标准株BCRC 17467 (DQ903176.1)的遗传距离为0,1 000次重复自展支持率为98;MP6与贝莱斯芽孢杆菌标准株NRRL 41580T (EU138622.1)的遗传距离为0,1 000次重复自展支持率为99,其序列提交至GenBank,获得登录号分别为PQ144581、PQ144582、PQ144583。因此,确定菌株LB17、K87、MP6的分类地位为贝莱斯芽孢杆菌。

fig

图9  基于16S rRNA基因(A)gyrB基因(B)的系统发育树

Figure 9  Phylogenetic tree constructed by the neighbor-joining method based on the sequences from 16S rRNA gene (A) and gyrB (B) locus of the strains. The accession numbers of the sequences in GenBank are shown following the species name, and the superscript “T” indicates the type strain. The branch numbers indicate the bootstrap support rate; The scale bar indicates a nucleotide substitution rate of 0.10.

2.7 最优复合菌系的防病促生作用

表6所示,对照组CK1 (燕麦镰孢+木贼镰孢灌根)、CK2 (微座孢灌根)、CK3 (麦根腐平脐蠕孢灌根)的青稞根腐病病情指数为85.00-86.50,处理组M1 (T2复合菌系+燕麦镰孢+木贼镰孢灌根)、M2 (T2复合菌系+微座孢灌根)、M3 (T2复合菌系+麦根腐平脐蠕孢灌根)的病情指数为21.50-25.25。最优复合菌系T2对青稞镰孢根腐病、微座孢根腐病、普通根腐病的防效分别为72.35%、70.81%、75.07%。处理组M1、M2、M3的株高分别为30.11、30.22、30.71 cm,茎粗分别为0.114、0.123、0.114 mm,显著高于对照组(P<0.05)。株高增幅为13.28%-34.00%,茎粗增幅为55.0%-65.8%。

表6  最优复合菌系T2对青稞根腐病的防效及促生作用
Table 6  Root rot control efficacy and plant growth promoting effect on naked barley of the optimal bacterial consortium T2
TreatmentDisease indexControl effect (%)Plant height (cm)Stem diameter (mm)
CK1 85.00±3.90a - 19.75±2.89b 0.058±0.010b
M1 23.50±4.74b 72.35 30.11±1.24a 0.114±0.012a
CK2 86.50±3.16a - 19.89±3.37b 0.042±0.013b
M2 25.25±5.19b 70.81 30.22±1.27a 0.123±0.010a
CK3 86.25±2.12a - 26.63±1.65b 0.051±0.015b
M3 21.50±5.67b 75.07 30.71±1.19a 0.114±0.011a

“-” indicates the treatment was absent from control effect.

3 讨论与结论

微生物菌剂因其良好的防效、较长的持效期,以及环境友好和可再生性强等优势,已成为控制作物病害的主要途径之一。其中,芽孢杆菌属在国内外研究中最为常[

40]。芽孢杆菌具有快速定殖、逆境生存能力[41]、抑菌性能[42]、可诱导免疫系统反[43]以及部分菌株具有分解农药残留等功[44],因此被大量制成微生物菌剂,应用于多种作物病害的防控,并可替代化学药剂的使用。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)[45]、短小芽孢杆菌(B. pumilus)[46]、贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis)、耐盐芽孢杆菌(B. halotolerans)和蜡样芽孢杆菌(B. cereus)等对根腐类病害的防控效果尤为显著。施春兰[47]研究发现,解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌对烟草根腐病菌的抑制率在60%左右,枯草芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌以及蜡样芽孢杆菌对草莓灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)和链格孢菌(Alternaria alternata)的抑制率为50.1%-72.1%。Lan[48]研究发现,解淀粉芽孢杆菌对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的抑制率为58%。

贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis)是近年来芽孢杆菌属中一种新型且热门的生防细菌,其生防效果良好,具有很大的开发潜力,尤其在根腐类病害防控方面表现出色。陈静[

49]研究发现,贝莱斯芽孢杆菌TCS001对草莓灰霉病病原有明显的抑制作用,抑制率可达72.18%。何明川[50]研究发现,贝莱斯芽孢杆菌对烟草黑胫病的抑菌率为62.87%。Wang[51]研究发现,贝莱斯芽孢杆菌BER1菌株对番茄青枯病的抑制率为49.0%。李界秋[52]研究发现,4种贝莱斯芽孢杆菌对尖镰孢的抑制率为40.56%-56.30%。本研究中筛选得到的贝莱斯芽孢杆菌LB17和K87的防效均优于已报道的同类菌株。LB17对麦根腐平脐蠕孢的抑制率为87.23%,同时对尖镰孢和茄镰孢的抑制率分别为87.52%和61.89%;而K87对百合根腐病病原茄镰孢的抑制率达75.15%。

目前针对多种作物根腐病病原均有效的复合菌系研究较少。本研究成功研发出一种抑菌谱更广的T2复合菌系,其对百合、番茄、辣椒等不同作物上分离的根腐病病原(如茄镰孢、尖镰孢)以及青稞根腐病病原(如微座孢、木贼镰孢、麦根腐平脐蠕孢、燕麦镰孢)的抑菌率分别为77.84%、65.71%、76.71%、87.69%、64.46%、60.26%,且抑菌率均超过60.00%,显示出良好的本土根腐类病害防治潜力。在促生功能方面,复合菌剂T2的固氮能力显著提高,固氮量为0.212 g/L,分泌IAA能力相较单一菌株平均提升了2.6倍,解钾及分泌铁载体能力均提升了2倍,解钾量达86.28 mg/L,分泌IAA量达16.91 mg/L。Du[

53]研究发现,单一菌株对香蕉枯萎病的抑制率为21.21%-60.61%,平均控制效果为47.27%,而复合菌剂(芽孢杆菌属)的生防菌株组合的控制效果平均为72.73%,与本研究结果一致。黄文茂[54]研究发现,由恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、弯曲芽孢杆菌(B. flexus)、坚强芽孢杆菌(B. firmus)和贝莱斯芽孢杆菌组成的复合菌剂施用于辣椒根际土壤后,溶磷、解钾菌和固氮量较对照均提高了5倍以上。本研究所构建的复合菌系对青稞根腐类病害的防效良好,且具有较强的促生作用,其对土壤的影响及对其他作物的田间效应有待进一步研究。

作者贡献声明

李雪萍:实验设计、数据核查、论文撰写;马佳璇:菌株筛选、特性测定、菌种鉴定;许世洋:数据汇总、图表绘制、英文写作;孟欢:辅助菌种鉴定、盆栽试验;李建军:辅助菌株筛选、特性测定;漆永红:负责数据核查、论文核查、保障实验条件。

利益冲突

作者声明不存在任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。

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