一株芽孢杆菌的筛选及其降解木质纤维素性能

摘要

目的

为了更好地利用因气候、机械配套等原因导致苜蓿延迟收割而沉积的木质纤维素，筛选可以降解木质纤维素的菌株，为苜蓿的高效利用提供菌种资源。

方法

采用碱性木质素、羧甲基纤维素钠培养法初筛菌株；结合颜色变化和褪色圈复筛能够分泌木质素酶和纤维素酶的菌株；通过16S rRNA基因和全基因组测序进行分类鉴定；将全基因组测序结果与京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)和碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes, CAZy)数据库比对，注释基因功能；利用扫描电镜法评价菌株对苜蓿茎微观结构的降解效果；采用菌株添加法评价其对苜蓿干草养分和微生物群落变化的影响。

结果

获得1株能够分泌木质素酶和纤维素酶的菌株S1，经全基因组测序鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。其基因组中有305个基因被注释为参与碳水化合物代谢，其中包含139个编码碳水化合物活性酶的基因。在苜蓿干草中添加该菌株后，茎中维管束的微观结构发生显著变化，粗蛋白(crude protein, CP)含量随储存时间增加而升高，木质素、中性洗涤纤维(neutral detergent fiber, NDF)和酸性洗涤纤维(acid detergent fiber, ADF)含量降低，同时微生物α多样性也有所下降。

结论

筛选鉴定的菌株为蜡样芽孢杆菌，其具有较强的木质纤维素降解能力。

关键词

木质纤维素降解; 蜡样芽孢杆菌; 苜蓿; 基因功能注释

木质纤维素原料来源广泛，在农作物秸秆中纤维素(cellulose)含量为30%-50%，半纤维素(hemicellulose)含量为25%-30%，木质素(lignin)含量为15%-20%^[1-2]。木质素的致密结构是纤维素酶降解利用的主要物理障碍，影响纤维素和半纤维素的工业转化利用^[3-4]。苜蓿具有较高的营养价值，被誉为“牧草之王”。李彦芳^[5]研究发现，反刍动物适量饲喂苜蓿可以加快生长速度、提高产奶量和饲料转化率，经济效益良好。然而，苜蓿的木质纤维素含量会随生育期推进而逐渐升高，降低适口性，影响消化率^[6-7]。苜蓿茎的比例可达50%-70%^[8]，其木质化程度远高于叶，而叶肉组织则永不木质化^[9]。在生产实践中，阴雨天气、机械不配套等原因常导致苜蓿收割延迟，进而加剧木质化，降低品质。

在诸多加工方法中，生物降解因其成本低、降解条件宽泛、效率高等优点而备受关注^[10]。虽然真菌的木质素降解效率高于细菌，但其对极端环境的耐受性较差，限制了其应用^[11-12]。相比之下，细菌具有繁殖速度快、基因组较小且便于分子遗传和蛋白质表达等优势^[13]。芽孢杆菌属能够形成芽孢，具有耐热、耐干、耐酸碱等特性^[14]，可在较宽的温度和pH范围内存活和繁殖^[15]。Chukwuma等^[16]从城市固体废物沉积物中筛选分离出降解木质纤维素的芽孢杆菌。谢长校^[17]分离出一株芽孢杆菌，其漆酶和过氧化物酶活性较高，可将木质素大分子解聚为小分子苯化合物，并进一步降解进入三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle, TCA)。燕红等^[18]通过酶活测定、残渣结晶度分析、表面结构观察和傅里叶红外光谱检测，研究了蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)降解麦麸木质纤维素的能力，但未对其基因组进行分析。Tao等^[19]对蜡样芽孢杆菌ATCC 14579的宏基因组进行分析，发现其与蛋白质降解酶相关的基因数量较多，但未预测到与纤维素分解相关的基因。

目前，关于全基因组分析具有木质纤维素降解能力的蜡样芽孢杆菌，以及其对苜蓿干草微生物群落多样性的影响研究报道较少。筛选并鉴定降解木质纤维素的蜡样芽孢杆菌，基于全基因组分析KEGG通路，注释碳水化合物活性酶基因，解析其对苜蓿干草养分及微生物多样性的影响，不仅可以为优质苜蓿草产品的生产发掘宝贵的微生物资源，还可为探究木质纤维素降解的内在机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

富含腐殖质的土壤样品采集于山西农业大学校园内及种植中苜一号的试验地，将土壤带回实验室后，在4 ℃保存。

苜蓿来源：山西农业大学草业学院试验地栽培的中苜一号。

1.2 培养基

LB肉汤和LB营养琼脂、碱性木质素、木聚糖(来源于玉米芯)均购自北京索莱宝科技有限公司。羧甲基纤维素钠购自天津市光复科技发展有限公司。

碱性木质素固体培养基(g/L)：碱性木质素5.0，(NH₄)₂SO₄ 2.0，K₂HPO₄ 1.0，NaCl 0.5，MgSO₄·7H₂O 0.2，琼脂粉22.0。

羧甲基纤维素钠固体培养基(g/L)：羧甲基纤维素钠5.0，(NH₄)₂SO₄ 2.0，K₂HPO₄ 1.0，NaCl 0.5，MgSO₄·7H₂O 0.2，琼脂粉22.0。

苯胺蓝-NA培养基：0.1 g苯胺蓝溶解在1 L营养琼脂培养基。

木聚糖培养基(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 2.0，MgSO₄ 0.5，K₂HPO₄ 1.0，NaCl 0.5，木聚糖2.0，琼脂粉22.0。

无机盐矿物元素营养液(MSM) (g/L)：(NH₄)₂SO₄ 2.0，KH₂PO₄ 2.0，MgSO₄ 0.3，CaCl₂ 0.3，NaCl 0.5，FeSO₄ 0.005，MnSO₄ 0.016，ZnCl₂ 0.017，CoCl₂ 0.002。

1.3 菌株筛选

取样品土壤10 g置于100 mL灭菌锥形瓶中，加入90 mL的0.9%生理盐水，在30 ℃、150 r/min下振荡30 min，将锥形瓶中液体过滤至新的灭菌锥形瓶中，作为初始液体，备用。

初筛：分别取100 μL初始液体至碱性木质素固体培养基和羧甲基纤维素钠固体培养基，涂布均匀，在37 ℃条件下倒置培养24 h。挑取直径大于0.2 cm的单菌落，于LB固体培养基上通过划线培养进行多次纯化，直至获得纯菌株。

复筛：通过苯胺蓝褪色、愈创木酚液体培养基^[20]变色和革兰氏碘液^[21]褪色圈筛选具有产生过氧化物酶、漆酶和羧甲基纤维素酶的菌株。将复筛得到的菌株接种于LB液体培养基中，在37 ℃、150 r/min振荡培养24 h，并用于后续试验。

木聚糖酶定性试验：将复筛菌株点涂于木聚糖培养基，在37 ℃条件下倒置培养24 h，之后用1%刚果红溶液浸染30 min，用1 mol/L NaCl溶液进行脱色，观察是否出现褪色圈。

1.4 木质素酶活性检测

以苜蓿粉为唯一底物的培养基作为液体产酶培养基，在37 ℃、150 r/min恒温摇床振荡培养，分别在0、1、2、3、4、5、6、7 d进行取样，通过4层无菌纱布过滤，滤液在4 ℃、8 000 r/min离心10 min获得粗酶液，每天3个重复。

参照田林双^[22]的方法进行酶活测定和计算：通过吸光度变化，利用2,2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), ABTS]、MnSO₄、藜芦醇在30 ℃下与粗酶液反应3 min，测定结束与初始吸光度的变化。具体反应体系如下。

漆酶反应体系：100 mmol/L丙二酸-丙二酸钠缓冲液、0.6 mmol/L ABTS溶液各0.5 mL，粗酶液50 μL，测定420 nm处的吸光度变化。

锰过氧化物酶反应体系：100 mmol/L丙二酸-丙二酸钠缓冲液0.5 mL，10 mmol/L MnSO₄溶液0.1 mL，粗酶液50 μL，纯净水0.4 mL，10 mmol/L H₂O₂溶液0.01 mL启动反应，测定270 nm处的吸光度变化。

木质素过氧化物酶反应体系：200 mmol/L酒石酸缓冲液0.5 mL，40 mmol/L藜芦醇0.1 mL，粗酶液50 μL，纯净水0.4 mL，20 mmol/L H₂O₂溶液0.01 mL启动反应，测定310 nm处的吸光度变化。

1.5 菌株分子鉴定

用Bacterial DNA Kit (Omega Engineering公司)提取总DNA后用扩增引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增细菌16S rRNA基因。PCR反应体系(50 μL)：PrimeSTAR Max Premix (2×) (TaKaRa公司) 25 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各2 µL，DNA模板1 µL，ddH₂O 20 µL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃终延伸10 min。扩增产物进行Sanger测序，16S rRNA基因测序由南昌科畅生物科技有限公司完成。序列提交至NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对。

用超声波破碎仪将DNA样品随机打断成长度约为350 bp的片段，制备文库后进行初步定量以及插入片段的检测，采用Illumina NovaSeq 6000平台进行细菌全基因组测序，全基因组测序(whole genome sequencing, WGS)由天津诺禾致源生物信息科技有限公司完成。组装整合后过滤掉500 bp以下的片段，最后使用FastANI计算平均核苷酸相似度(average nucleotide identity, ANI)。

1.6 基因功能注释

基于全基因组测序结果，用BLASTp比对编码蛋白，利用京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG) (http://www.genome.jp/kegg)和碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes, CAZy)数据库(http://www.cazy.org/)等平台进行功能注释。

1.7 扫描电子显微镜观察

在MSM培养基中加入5 g切至1-2 cm的苜蓿茎，121 ℃灭菌20 min后，加入100 μL培养好的菌液，在37 ℃、150 r/min振荡培养48 h。用4层灭菌棉纱布过滤，获得的苜蓿茎进行冷冻干燥后，用扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)观察其微观结构。

扫描电子显微镜显微照片通过JSM-6701F系统(JEOL公司)进行拍摄。在高真空离子喷镀仪中喷镀金属膜后，在15 kV分辨率下成像。

1.8 苜蓿茎秆养分分析和细菌群落变化分析

留茬20 cm刈割初花期苜蓿，将样品在60 ℃烘干至恒重，装入灭菌小瓶中，每瓶15 g，备用。将菌液用蒸馏水稀释至1×10⁶ CFU/mL，均匀喷洒至烘干后的苜蓿干草，使含水量约为30%，在室温条件下保存。分别在第0、8、16、32天取样，每组设3个重复。

在0、8、32 d的样品中，每个重复取1 g样品至无菌冻存管，用液氮速冻5 min后，迅速转移至-80 ℃冰箱保存，送至生工生物工程(上海)股份有限公司，通过高通量测序进行微生物多样性分析。

将0、8、16、32 d的样品烘干至恒重后，送至蓝德雷牧草·饲料品质检测实验室，利用近红外光谱NIRS DS2500 (FOSS公司)测定养分。扫描波长范围为850-2 500 nm，每个样品重复8次。

1.9 统计分析

酶活和养分指标数据采用IBM SPSS Statistics v26.0进行单因素方差分析，P<0.05时认为具有统计学显著性差异。数据处理和作图使用Origin 2021完成。比对分析后，用MEGA 11软件中的邻接法构建基于16S rRNA基因序列的系统发育树。ANI值的热图使用OAT (orthologous ANI tool) (https://www.ezbiocloud.net/tools)绘制。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选

通过初筛培养基，筛选出4株在碱性木质素固体培养基和羧甲基纤维素钠固体培养基上均生长良好的菌株，将其分别编号为S1、S2、S3、S4。

初筛菌株接种于复筛培养基，培养24 h后对复筛结果进行统计(表1)。在初筛菌株中，S1产生的革兰氏碘液褪色圈直径大于S2，表明S1产羧甲基纤维素酶的能力优于S2；S3未产生苯胺蓝褪色圈，说明其无过氧化物酶活性；S4不能使愈创木酚培养基变色，说明其无漆酶活性。因此，选择表现最优的S1菌株进行后续试验。

表1  菌株复筛情况

Table 1  Second screening of strains

编号 No.	苯胺蓝褪色圈直径 The decolorization of aniline blue (cm)	革兰氏碘液褪色圈直径 The decolorization of Gram’s iodine solution (cm)	愈创木酚变色 Color change of guaiacol
S1	0.4-0.6	1.4-1.8	Yes
S2	0.3-0.5	0.6-0.8	Yes
S3	-	0.3-0.4	Yes
S4	0.8-0.9	0.7-0.8	No

-：表示未出现水解圈。

-: Indicates that no hydrolysis circle occurs.

S1菌株接种于苯胺蓝-NA固体培养基，在37 ℃下培养24 h后，菌落周围出现明显酶解圈(图1A)；培养结束后，将羧甲基纤维素钠培养基用革兰氏碘液浸泡染色，出现明显褪色圈(图1B)；愈创木酚液体培养基在37 ℃、150 r/min下振荡24 h后，与未接种的培养基相比，颜色显著变红(图1C)；通过刚果红染色，木聚糖培养基未出现褪色圈(图1D)，表明该菌无木聚糖酶活性。

图1  木质纤维素降解菌的筛选。A：过氧化物酶的鉴定；B：羧甲基纤维素酶的鉴定；C：漆酶的鉴定；D：木聚糖酶的鉴定。

Figure 1  Screening of lignocellulose-degrading bacteria. A: Identification of peroxidase; B: Identification of carboxymethylcellulases; C: Identification of laccase; D: Identification of xylanase.

2.2 木质素酶活性分析

通过对菌株S1分泌的漆酶进行活性分析，发现漆酶活性在第1天达到峰值，随后活性呈下降趋势。在第4天，漆酶活性下降至与第0天无显著差异，甚至在第7天时酶活显著低于第0天(图2A)。锰过氧化物酶活性在前5天呈现总体上升趋势，在第5天达到峰值后开始下降(图2B)。木质素过氧化物酶活性在前3天呈上升趋势，随后活性下降(图2C)。在3种胞外酶中，锰过氧化物酶活性高于其他2种酶，并且在高酶活状态下持续时间较长。

图2  酶活性定量。A：漆酶活性；B：锰过氧化物酶活性；C：木质素过氧化物酶活性。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Figure 2  Quantification of the enzyme activity. A: Laccase activity; B: Manganese peroxidase activity; C: Lignin peroxidase activity. Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05).

2.3 分子鉴定

菌株S1的测序结果完成后，将测序结果上传至国家微生物科学数据中心(http://nmdc.cn/)，编号为NMDCN0006AUT。该序列在NCBI数据库中进行比对，与其亲缘关系最近的3株菌株均属于芽孢杆菌属，分别为B. proteolyticus strain MCCC 1A00365、B. sanguinis strain BML-BC004和B. wiedmannii strain FSL W8-0169，这3株菌与菌株S1的序列比对一致度均为99.45%，因此无法在种水平对菌株S1进行精确分类鉴定(图3A)。

  

  

图3  菌株S1的分子鉴定。A：基于16S rRNA基因序列的原始系统发育树(分支处的值是bootstrap值；菌株后面的括号中是登录号)；B：基于全基因组序列的ANI热图(图中的值是ANI值)。

Figure 3  Molecular identification of the bacterial strain S1. A: Original phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequence (The value at the branch is the bootstrap value; Accession numbers are shown in parentheses after the strain); B: Heatmap of the ANI based on the whole genome sequence (The values are the ANI values).

对菌株S1进行全基因组测序，并计算ANI值，通过热图进行可视化。结果显示，S1与蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的ANI值最高，且大于95% (图3B)。据此，鉴定该菌为蜡样芽孢杆菌，并将其命名为Bacillus cereus S1。

2.4 基因组特征

通过全基因组测序，蜡样芽孢杆菌S1的全基因组大小为5 926 808 bp，G+C含量为34.76%，编码5 948个基因，平均编码基因长度为831.99 bp。测序结果显示，蜡样芽孢杆菌S1含有57个tRNA和3个rRNA，其中rRNA由1个23S rRNA、1个5S rRNA和1个16S rRNA组成(图4)。

图4  蜡样芽孢杆菌S1的全基因组图谱。最外层为第1圈，第1圈和第4圈指的是每一个CDS所属的COG，第4圈与第1圈含义相同；第2圈以及第3圈代表的是基因组上的CDS、tRNA及rRNA；第5圈代表的是G+C的含量；第6圈代表的是G+C skew；最里面一圈代表的则是刻度；中间的数字代表全基因组序列总长度。

Figure 4  The genome-wide map of Bacillus cereus S1. The outermost circle is the first circle; The first circle and fourth circles indicate the COG classification to which each CDS belongs; The second and the third circles indicate CDS, tRNA, and rRNA on the genome; The fifth circle represents the G+C content; The sixth circle represents the G+C skew; The innermost circle represents the scale; The middle number represents the total length of the whole genome sequence.

2.5 基因功能注释

KEGG数据库是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的综合数据库。通过与KEGG数据库比对注释，蜡样芽孢杆菌S1共有3 789个基因得到功能注释，其中2 681个基因在一级分类中被注释为代谢(metabolism)，在二级分类中，305个基因被注释为碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)，157个基因被注释为能量代谢(energy metabolism) (图5A)。

图5  基因功能注释。A：KEGG数据库比对结果；B：CAZy数据库比对结果。

Figure 5  Gene function annotation. A: Alignment results of KEGG database; B: Alignment results of the CAZy database.

与KEGG数据库不同，CAZy数据库是依据蛋白质结构域内氨基酸序列的相似程度，将碳水化合物活性酶划分到不同的蛋白质家族中。与CAZy数据库比对后，蜡样芽孢杆菌S1共有139个基因得到注释，分为以下6大类糖代谢酶家族：糖苷水解酶(glycoside hydrolases, GHs)、糖基转移酶(glycosyl transferases, GTs)、多糖裂合酶(polysaccharide lyases, PLs)、碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases, CEs)、碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding modules, CBMs)和辅助氧化还原酶(auxiliary activities, AAs)。其中，44个基因被注释为糖基转移酶，38个基因被注释为糖苷水解酶，35个基因注被释为碳水化合物酯酶(图5B)。

通过注释结果分析，发现有14个基因编码碳水化合物酯酶CE1家族，占编码碳水化合物酯酶类基因数量的40%。

2.6 扫描电镜

对照组中，苜蓿茎虽有轻微破裂，但各组织结构清晰可辨(图6A)；经蜡样芽孢杆菌S1处理后，苜蓿茎结构被严重破坏，出现裂缝和脱落，维管束结构与髓腔发生碎片化，无法对各组织进行区分，并且有大量白色物质附着在被破坏的组织上(图6B)。

图6  苜蓿茎纵切面的扫描电镜结果。A：对照组；B：蜡样芽孢杆菌S1处理组。

Figure 6  SEM results of the longitudinal section of alfalfa stems. A: Control group; B: Treated with B. cereus S1.

2.7 养分分析

通过对苜蓿干草养分分析发现，木质素含量在第32天显著低于第0、8、16天(P<0.05)；随着贮存时间延长，酸性洗涤纤维(acid detergent fiber, ADF)和中性洗涤纤维(neutral detergent fiber, NDF)含量呈下降趋势，且在第32天显著低于第0天(P<0.05)。灰分(ash)含量在第32天最低；粗脂肪(ether extract, EE)含量变化不显著；粗蛋白(crude protein, CP)含量在第8、16、32天时显著高于第0天(P<0.05) (表2)。

表2  添加蜡样芽孢杆菌S1后的养分含量变化

Table 2  Nutrition of alfalfa treated with Bacillus cereus S1

天数 Day	灰分Ash (% DM)	粗脂肪EE (% DM)	粗蛋白CP (% DM)	木质素Lignin (% DM)	酸性洗涤纤维ADF (% DM)	中性洗涤纤维NDF (% DM)
0	9.12±0.15b	1.74±0.10	23.96±0.42d	5.45±0.34a	27.09±0.31a	34.14±1.36a
8	12.19±0.48a	1.73±0.11	28.30±0.37b	5.94±0.42a	22.63±0.25b	28.66±0.72b
16	11.68±0.44a	1.74±0.28	29.99±0.59a	5.41±0.49a	22.26±1.72b	27.83±0.94b
32	8.88±0.55b	1.74±0.12	26.54±0.30c	3.73±0.51b	20.94±0.49b	28.18±0.54b

表中数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

The data in the table are mean±SD. Different lowercase letters in same column indicate significant differences (P<0.05).

2.8 微生物群落变化

添加蜡样芽孢杆菌S1后，Shannon指数从0天至第8天和第32天逐渐下降，第32天极显著低于第0天(P<0.01) (图7A)。与Shannon指数类似，ACE指数在第32天显著低于第0天(P<0.05) (图7B)。

图7  微生物群落多样性。A：Shannon指数；B：ACE指数。ns：不显著；*：P<0.05；**：P<0.01。

Figure 7  The diversity of the microbial communities. A: Shannon index; B: ACE index. ns: Not significant; *: P<0.05; **: P<0.01.

3 讨论

3.1 菌株筛选和分子鉴定

微生物分泌的降解木质素的3种主要胞外酶包括漆酶(laccase, Lac)、木质素过氧化物酶(lignin peroxidase, LiP)和锰过氧化物酶(manganese peroxidase, Mnp)。这些酶可以作用于木质素结构单元间的酯键或醚键，生成小分子化合物，并进一步催化裂解苯丙烯醇间的碳碳键，从而得到更小的化合物^[23]。羧甲基纤维素酶，又称内切纤维素酶或内切-β-1,4葡聚糖酶，是降解纤维素的关键酶之一，通过在纤维素链的无定形位点切割β-1,4-糖苷键，释放葡萄糖、纤维素二糖和其他低聚糖，从而实现纤维素的降解^[24]。

在本研究中，通过固体培养基褪色圈和液体培养基颜色变化，表明所筛选的菌株具有木质素酶和羧甲基纤维素酶活性，但缺乏木聚糖酶活性。木聚糖酶是主要的半纤维素降解酶，由于半纤维素主要由戊糖、己糖和葡萄糖醛酸组成，含有较多短支链，相比长链纤维素更容易被水解^[25]，因此本文主要研究具有降解木质素和纤维素能力的菌株。

素有“细菌化石”之称的16S rRNA基因编码原核生物核糖体小亚基rRNA (16S rRNA)。16S rRNA基因分子生物学鉴定方法具有较高的灵敏度，通过比对菌种间16S rRNA基因可变区的特异性核苷酸序列，可鉴定细菌种属^[26]。在本研究中，通过16S rRNA鉴定，筛选菌株S1与3株菌株具有相同的序列相似性，因此无法在种水平进行准确分类鉴定。当16S rRNA基因高度保守、突变率低，无法用16S rRNA基因分子生物学对相似率极高的近缘种做进一步区分时，可进行全基因组测序^[27-28]。

3.2 酶活定量分析

在本研究中，蜡样芽孢杆菌S1在以苜蓿粉为唯一底物的培养基中检测到锰过氧化物酶的活性最高。Kong等^[29]研究结果表明，锰过氧化物酶是一种能同时降解非酚类和酚类木质素的酶，而漆酶在无介质存在时仅降解酚类木质素模型化合物；并且锰过氧化物酶可分解的低分子量木质素种类多于漆酶。

Zhang等^[30]研究表明，漆酶是混合酶反应的起始酶，随后协同木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶共同破坏木质素的大分子结构，破坏其关键化学键，打开苯环，并且当漆酶分别与木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶共同作用时，可提升木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶的降解效果。因此，3种胞外酶同时存在时会对木质素的降解产生协同作用，降解率最高、降解效果最好。

3.3 基因功能注释

在木质纤维素降解过程中涉及大量的碳水化合物代谢过程，例如氨基糖和核苷酸糖代谢、丙酮酸代谢、糖酵解/糖异生、淀粉和蔗糖代谢以及磷酸戊糖途径，这些过程与木质纤维素降解密切相关^[31]。这些代谢过程需要消耗大量能量，而能量代谢相关基因的大量存在表明，蜡样芽孢杆菌S1菌株具有降解木质纤维素的潜力，并且可以通过物质和能量的持续交换来应对外界环境。

碳水化合物活性酶在木质纤维素降解过程中起主要作用，是一类在生物体内参与碳水化合物代谢的酶。它们依次将多糖侧链和骨架水解成寡糖和单糖，对生物体内碳水化合物的降解、合成和转运起着至关重要的作用^[32-33]。

糖苷水解酶中的纤维素酶系在降解纤维素时发挥关键作用，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，这3种酶协同作用，逐步将纤维素分解为可被微生物利用的葡萄糖^[34]。

碳水化合物酯酶CE1家族中的阿魏酸酯酶是木质纤维素降解的重要酶，能够特异性地水解阿魏酸与多糖之间的酯键，打破半纤维素和木质素之间的连接，原本紧密的结构变得松散，从而使纤维素和半纤维素更易暴露出来，极大地促进了木质纤维素的降解^[35]。

3.4 扫描电镜

用筛选菌株蜡样芽孢杆菌S1处理后，苜蓿茎结构出现严重裂缝和脱落，维管束组织遭到严重破坏。黏附在被破坏组织上的白色物质，与Weiss等^[36]研究观察到的结果相似，疑似为糖降解和木质素碎片凝结形成的液滴结构。

3.5 养分分析

近红外光谱是一种分子吸收光谱，主要反映含氢基团的合频和倍频振动，具有丰富的组成和结构信息^[37]。近年来，近红外光谱技术在植物养分测定领域备受关注。付趁等^[38]构建了基于近红外光谱的花生秧营养组分预测模型；郭歌^[39]建立作物籽粒主要成分和生物质灰分的近红外光谱预测模型；Mostafa等^[40]通过近红外光谱法对饲料营养参数实时监测。

ADF和NDF含量是衡量饲料适口性和消化率的重要指标，ADF由木质素和纤维素组成，NDF由木质素、纤维素和半纤维素组成^[41]。木质素是由高分子量芳香族聚合物的分支组成，其生物降解性较低，是限制半纤维素和纤维素与降解酶接触的关键因素^[42]。在本研究中，木质素含量在第8天后才开始逐渐下降，可能是由于木质素结构较为坚固；而NDF与ADF含量在整个阶段呈下降趋势，可能是蜡样芽孢杆菌S1分泌的碳水化合物活性酶发挥作用，使得苜蓿中的纤维素结构发生了降解。

粗蛋白含量是衡量饲草品质的重要指标，高含量通常意味着价值更高、品质更好^[43-44]。在本研究中粗蛋白含量的增加，可能是由于蜡样芽孢杆菌S1在降解木质纤维素过程中合成了大量菌体蛋白，从而提高了粗蛋白含量，这与Zhong等^[45]研究结果相似。

灰分反映了牧草中矿物质的总体含量，灰分含量越低，牧草品质越高^[46]。在本研究中，灰分含量在第32天最低，与其他养分变化的结果相互印证，表明添加蜡样芽孢杆菌S1后，苜蓿干草的品质得到了提升。张闻喜等^[47]的研究也表明，灰分的变化可能受到添加菌株所产生的代谢产物的影响。

3.6 微生物群落变化

α多样性中的Shannon指数与物种多样性呈正相关，Shannon值越大，说明群落多样性越高；ACE指数常被用来估计群落中操作分类单元(operational taxonomic units, OTU)的数目，与物种丰富度呈正相关^[48]。在本研究中，第32天微生物多样性和丰富度显著低于第0天，微生物群落结构发生变化。苏鑫等^[49]研究中，添加复合菌系后玉米秸秆微生物α多样性也存在差异。可能外源细菌加入后迅速占领位点，与其他微生物竞争水分和营养等，抑制了部分微生物的生长，使微生物群落结构发生变化^[50]。

4 结论

本文筛选了一株菌株S1，该菌株能够产生木质素过氧化物酶、漆酶和锰过氧化物酶，并具有较高的锰过氧化物酶活性。通过基于全基因组的ANI分析判定该菌与蜡样芽孢杆菌的ANI值最大且大于95%，因此将其鉴定为蜡样芽孢杆菌，并命名为Bacillus cereus S1。基于全基因组与KEGG数据库的比对，该菌拥有大量与碳水化合物代谢和能量代谢相关的基因；与碳水化合物活性酶数据库比对后，发现有139个基因注释到碳水化合物活性酶。该菌作用于苜蓿茎后，破坏其结构；作用于苜蓿干草时，能够降低干草中木质纤维素的含量，提高粗蛋白含量，提升干草品质；通过α多样性分析表明，该菌对苜蓿干草的微生物群落产生了影响，降低了干草中微生物群落的多样性。该菌可作为木质纤维素降解的候选菌株，但其降解产物和降解机制仍有待进一步探索。

作者贡献声明

张鑫：研究构思和设计、数据收集和处理、论文撰写和修改；罗雨帆：协助实验操作、参与论文讨论；许庆方：提供技术支持、研究构思和设计、论文撰写和修改。

利益冲突

作者声明不存在任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。