毛竹根际解磷菌木糖氧化无色杆菌的分离及其解磷机制

摘要

目的

分离毛竹(Phyllostachys edulis)根际兼备溶解无机磷和有机磷能力的菌株，挖掘菌株解磷相关的功能基因，为利用解磷微生物活化土壤磷库、提高土壤磷有效性奠定基础。

方法

以亚热带地区重要经济林木——毛竹为研究对象，采用高通量筛选技术分离毛竹根际解磷菌。通过微孔板培养和土壤接种实验，分别探究碳源类型和土壤磷含量对其解磷能力的影响。采用全基因组测序技术解析其与解磷相关的基因，以探究其解磷机制。

结果

筛选出一株多途径解磷的细菌，命名为zafu-3，鉴定为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)。该菌株能利用葡萄糖和柠檬酸等4种碳源来溶解Ca₃(PO₄)₂、FePO₄、AlPO₄、卵磷脂和植酸钙，最佳解磷效果为32.75 mg/(L·d)。与对照组相比，接种菌株zafu-3后，土壤酸性和碱性磷酸酶活性分别增加了4.21%-33.88%和13.54%-112.06%，特别是在高磷土壤中，土壤pH值降低了0.04，有效磷含量增加了16.32%。全基因组结果表明，该菌株包含了35个参与磷酸水解酶编码的基因和53个参与有机酸代谢的编码基因。此外，菌株zafu-3具有产生产吲哚乙酸、铁载体和降解木质素的相关功能基因。

结论

菌株zafu-3可通过分泌多种有机酸和磷酸酶直接溶解无机和有机磷源，并可能通过促进植物生长间接激活土壤磷库，这为多功能生物肥料的开发提供了重要的菌种资源和科学依据。

关键词

毛竹; 木糖氧化无色杆菌; 解磷菌; 土壤磷动员; 基因组

磷(phosphorus, P)是植物生长所必需的元素，直接决定了植物生产力与生态功能的发挥。土壤总磷含量约为0.05-3.00 g/kg，但大多数磷以难溶解的形式存在，这限制了植物对磷的直接吸收与利用^[1]。施用含磷化肥是缓解磷限制、提高植物生产力的重要方式。然而，磷元素因其在土壤中移动性较差而极易被固持，导致仅有10%-20%的磷肥可被植物吸收利用^[2]。过量施用磷肥不仅会耗尽有限的磷矿资源，还会导致一系列的环境问题。因此，绿色高效地激活土壤磷库是促进磷素良性循环、缓解植物磷限制的关键策略。

根际微生物是驱动土壤元素循环和植物养分获取的引擎。解磷菌是辅助植物获取土壤磷素的主要微生物类群。解磷微生物活化土壤中的磷主要包括2个过程：(1) 释放多种磷酸酶矿化有机磷；(2) 分泌有机酸、质子以及自身的呼吸作用释放并溶解于土壤溶液中的CO₂，从而降低土壤pH，增加无机磷的溶解性^[3]。此外，解磷菌也可通过分泌吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)等生长激素促进植物生长^[4-5]，间接增加土壤磷素的释放。然而，以往研究中解磷菌活化的磷源单一，这导致解磷菌的活性较低，且对土壤和气候等环境变化的适应能力差，使得分离的解磷菌在田间应用仍面临很大挑战^[6]。与解磷真菌相比，解磷细菌繁殖速度快、多样性更丰富^[7]，它们占整个土壤微生物种群的1%-50%^[8]，并具有环境适应性强、遗传操作简单的优势。因此，分离多途径解磷的细菌是确保微生物制剂能够同时活化多种磷组分，并在多变的环境下稳定提升土壤磷可利用性与植物生产力的先决条件。

毛竹(Phyllostachys edulis)是我国竹林资源的主体，面积为527.76万hm²，具有经济价值高和固碳能力强等优势^[9-10]。毛竹林主要分布在缺磷的亚热带地区，随着竹秆采伐，大量磷素被移出生态系统，同时长期施用化肥引起的土壤退化导致毛竹林生产力和生态功能的发挥受到严重的磷限制^[11-12]。研究表明，毛竹林土壤微生物可通过其pqqC或phoD等基因编码的吡咯并喹啉醌合酶和碱性磷酸酶等酶类，活化土壤中的难溶性无机磷和有机磷^[13-14]。因此，亟须挖掘毛竹根际的多效解磷微生物资源，并阐明其解磷机制，以持续活化土壤磷库、缓解毛竹林的磷限制。

本研究以3种难溶性无机磷和2种难溶性有机磷为磷源，分离毛竹根际解磷细菌，并采用微孔板培养和土壤接种实验探究其解磷效果，进一步采用全基因组测序技术，分析其解磷机制及植物促生潜力。本研究旨在分离出能够同时溶解多种无机磷和有机磷且具备多种促生特性的菌株，并挖掘菌株编码有机酸和磷酸酶等解磷相关的基因，为利用这些菌株提高土壤有效磷含量奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样地概况和样品采集

试验样地位于浙江省杭州市临安区毛竹林试验平台(30°14′N，119°42′E)。该地区地处中亚热带季风气候区，土壤为黄土壤，pH 4.3±0.1。于2022年10月，在试验样地随机设置3个20 m×20 m的样方。在样方内随机选择5株胸径相近(11.9±0.6) cm的毛竹，沿着毛竹基部挖取根系样品，随后轻轻抖动根系以去除其上黏附的大块土壤。根系样品置于无菌采样袋中，低温运至实验室立即进行解磷微生物的分离。此外，从该地区低磷(low phosphorus, LP)样地及其邻近的高磷(high phosphorus, HP)毛竹林样地，各自采集了5份林间土壤样本，分别混匀、风干后过20目筛，用于探究解磷菌对土壤磷库的活化潜力。LP和HP样地土壤总磷含量分别为(0.55±0.10) g/kg和(0.60±0.80) g/kg，有效磷含量无显著差异，均为(27.20±4.54) mg/kg。

1.2 根际解磷微生物分离

采用微孔板高通量筛选法^[15]分离毛竹根际解磷菌。筛选培养基为3种蒙金娜无机磷培养基(Pikovskaya’s medium, PVK) [Ca₃(PO₄)₂，PVK1；FePO₄，PVK2；AlPO₄，PVK3]和2种蒙金娜有机磷培养基(Mongina medium, MG) (卵磷脂，MG1；植酸钙，MG2)^[16-17]。简言之，将3 g根系样品置于20 mL的PBS溶液(上海源叶生物科技有限公司)中，充分振荡后所得溶液为根际微生物悬液。微生物悬液经过10倍梯度稀释后，按1:9的体积比与筛选培养基混合，然后添加至96孔细胞培养板中，于30 ℃下培养7 d。将培养板中呈现浑浊状态的菌液在固体筛选培养基上进行涂布以分离菌种。将获得的一株能同时活化上述5种磷源的多效解磷菌(zafu-3)，用于后续解磷效果与机制的研究。

1.3 菌株zafu-3的形态及生长特征

菌株zafu-3接种在胰蛋白胨大豆肉汤固体(trypticase soy agar, TSA) (青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)培养基上，观察其菌落特征；以无碳源的PVK和MG培养基为基础，探究菌株zafu-3对15种常见的毛竹根系分泌物中碳源^[18-21]的利用及溶磷情况，包括葡萄糖、果糖、蔗糖、纤维素和木聚糖5种糖类，谷氨酸、丝氨酸、脯氨酸、异亮氨酸和赖氨酸5种氨基酸，以及草酸、苹果酸、柠檬酸、丁二酸和乳酸5种有机酸，碳源以5 g/L的浓度添加至基础培养基中^[21]。以上实验每个处理均设置3个重复，以不接菌作为空白对照，在30 ℃下暗培养3 d后进行分析。菌株zafu-3在光学显微镜下的细胞形态特征、生长的pH范围(3.0-11.0，以1.0为单位增量)和NaCl的质量分数范围(1%-7%，间隔1%)，通过在胰蛋白胨大豆肉汤液体(trypticase soy broth, TSB) (青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)培养基中30 ℃、180 r/min振荡培养3 d后确定。以不接菌作为空白对照，每个处理设置6个重复。

菌株zafu-3接种至TSB培养基中，30 ℃、180 r/min振荡培养3 h后，30 ℃、3 000 r/min离心10 min，去上清，菌体用无菌水进行重悬，调整菌液浓度至OD₆₀₀值为0.1，以便进行定量分析。以体积分数5%的接种量将OD₆₀₀值为0.1的菌液接种至新鲜的TSB培养基中，30 ℃、180 r/min振荡培养，每隔3-9 h测定菌液在OD₆₀₀处的吸光度数值，并通过稀释涂布法，在TSA培养基上对菌液中的细胞数量进行计数，绘制菌株的生长曲线。每次取样设置3个重复，用未接菌的TSB培养基对紫外分光光度计进行校正。

1.4 菌株zafu-3的解磷能力及促生特性

以葡萄糖、蔗糖、木聚糖和柠檬酸为碳源时，菌株在解磷培养基上形成明显的溶磷圈，用溶解圈直径(D)与菌株直径(d)的比值(D/d)初步判断菌株的解磷能力。进一步，将菌株接种在添加这4种碳源的PVK1、PVK2、PVK3、MG1和MG2液体培养基中，探究碳源对菌株解磷能力的影响。每个处理设置6个重复，以不接菌的培养基作为空白对照。所有样本在30 ℃、180 r/min振荡培养3 d后，采用钼锑抗显色法测定菌株的解磷能力^[22]。此外，将菌株接种于苯胺蓝培养基上^[23]，培养8 d后观察溶解圈直径(D)及菌株直径(d)，用D/d值表示菌株对木质素的降解能力。采用Salkowski比色法测定菌株产生IAA的能力^[24]。

1.5 菌株zafu-3对土壤磷素的活化

土壤样品在121 ℃灭菌5次，每次30 min，每次间隔12 h。实验在300 mL的玻璃培养瓶中进行。每个培养瓶中加入30 g LP或HP样地的土壤。然后，将1 mL处于指数期的菌液在30 ℃、3 000 r/min离心10 min后，与用等量无菌水重悬，将其接种至土壤中，使得终浓度为10⁹ CFU/g。最后，加入无菌水混匀，调整土壤含水率至田间最大持水量的60%^[25]。添加等量灭菌的菌液为对照组，每个处理设置3个重复。培养瓶置于室温下暗培养30 d后，采用稀释涂布法确定土壤中菌株的存活情况^[26]。将土壤和水按照1:2.5的质量比混匀后，用于测定土壤pH^[27]。采用土壤酸碱磷酸酶活性测定试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)测定土壤酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的活性。采用Hedley等的方法测定土壤有效磷含量^[28]。

1.6 菌株zafu-3的全基因组测序及分析

将菌株zafu-3接种至装有50 mL TSB的100 mL锥形瓶中，在30 ℃、180 r/min振荡培养12 h后，于30 ℃、12 000 r/min离心10 min，去上清，收集菌体。通过细菌DNA提取试剂盒(磁珠法) (上海美吉生物医药科技有限公司)对菌株zafu-3进行基因组DNA提取。对菌株基因组DNA进行定量后，高质量的DNA用于建库测序。使用Sequel IIe测序仪(PacBio公司)和Illumina测序仪[因美纳(中国)科学器材有限公司]进行全基因组测序。将DNA片段化为约400 bp片段，并使用琼脂糖凝胶鉴定片段的大小和分布，之后进行Illumina文库制备；将基因组DNA片段化为约10 kb的片段，然后根据PacBio说明书进行末端补平，两端分别连接环状单链，构建PacBio文库。在Illumina测序仪上对文库分别进行双端测序(2×150 bp)，通过高通量测序技术测定其序列^[29]。对文库单链环退火后，在PacBio Sequel IIe测序仪上通过单分子实时测序技术进行实时检测^[30]。使用fastp v0.23.0去除质量较低、含N比例较高的序列，并通过Unicycler v0.4.8^[31]对PacBio Sequel IIe和质控后的Illumina测序结果进行组装，使用Pilon v1.22将Illumina测序得到的短序列组装到基因组上，并进行二次矫正获得全基因完成图。利用Glimmer和Prodigal v2.6.3对基因组中的编码序列(coding sequences, CDS)进行预测^[32]。利用BLASTp、Diamond、HMMER等序列比对工具，从KEGG数据库中对预测到的CDS进行功能注释。以上数据分析均在上海美吉生物云平台进行(http://cloud.majorbio.com)。菌株zafu-3并将组装好的基因序列通过与NCBI数据库对比，在数据库中基于16S rRNA基因序列选择相似度最高的20株菌，用MEGA 11.0软件及邻接法(neighbor joining, NJ)构建菌株系统发育树。利用在线工具JSpeciesWS (https://jspecies.ribohost.com/jspeciesws/#home)中的ANIb模式将菌株zafu-3与其近缘菌株进行平均核苷酸一致性(average nucleotide identity, ANI)比对。

1.7 统计分析

数据采用SPSS 22.0进行分析，运用单因素方差分析(one-way ANOVA)检测不同磷源下菌株的解磷能力差异、不同碳源下菌株的解磷能力差异，以及不同磷添加水平和溶磷菌接种对土壤理化性质的影响，具体包括土壤pH、ACP活性、ALP活性和有效磷含量，并采用最小显著差值法(least significant difference, LSD)进行显著性分析(α=0.05)，采用Logistic模型对菌株的OD₆₀₀值和CFU对数值进行非线性拟合。采用Origin 2024对数据进行绘图，图中所用数据均为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 解磷菌株的形态及培养特征

从毛竹根际分离得到一株能活化Ca₃(PO₄)₂、FePO₄、AlPO₄、卵磷脂和植酸钙5种磷源的菌株zafu-3。该菌株可在pH 4.0-10.0、6%以下的NaCl浓度条件下生长。菌株zafu-3在6-24 h快速增长，培养24 h后，菌株OD₆₀₀值为3.21，细胞数量为3.15×10¹⁵ CFU/mL，24 h后开始进入稳定期(图1A)。菌株的菌落颜色为淡黄色，不透明(图1A中1)。菌株为革兰氏阴性菌，细胞呈球杆状，大小为1.3 μm×1.8 μm (图1A中2)。

图1  菌株zafu-3的形态与培养特征及其解磷能力。A：生长曲线(1：菌落形态；2：光学显微镜下的细胞形态)；B：添加不同碳源后菌株解磷能力的变化(1：不同碳源下菌株溶解5种磷源的总量)，不同小写字母和斜体小写字母分别代表组内和组间显著差异(P<0.05)。

Figure 1  The morphological and cultural characteristics and the phosphorus solubilization ability of strain zafu-3. A: Growth curves (1: Colony morphology; 2: Cell morphology under the light microscope); B: P solubilizing activity of strain zafu-3 cultured with different carbon sources (1: Total content of five P sources solubilized among different carbon sources). Different lowercase letters and italic lowercase letters indicated significant differences among groups and between different groups respectively (P<0.05).

添加不同碳源后菌株zafu-3在5种磷源培养基中的生长情况如表1所示。以葡萄糖、脯氨酸、异亮氨酸、草酸或丁二酸为唯一碳源时，菌株在5种磷源培养基上均能生长，但其难以利用丝氨酸和乳酸。添加果糖、蔗糖或赖氨酸等8种碳源后，菌株仅在部分磷源培养基中生长。

表1  添加不同碳源后菌株zafu-3在不同磷源培养基上的生长情况

Table 1  Growth of strain zafu-3 on the different P source media containing different carbon sources

Carbon source	PVK1	PVK2	PVK3	MG1	MG2
Carbohydrate
Glucose	+++*	+++*	++*	++*	+++*
Fructose	+++	+	-	++	++
Sucrose	++	+*	-	+*	++*
Cellulose	-	-	+	-	-
Xylan	+*	-	-	+*	++*
Amino acid
Glutamate	-	-	++	++	+++
Serine	-	-	-	-	-
Proline	++	++	+	+++	++
Isoleucine	++	++	++	++	++
Lysine	++	++	+++	-	++
Organic acids
Oxalic acid	+++	+++	++	+++	++
Malic acid	+	-	-	+	-
Citric acid	+++*	++*	-	-	++*
Succinic acid	+++	+++	++	+++	+++
Lactic acid	-	-	-	-	-

-: Negative; +, ++, +++: Positive; * indicated the presence of a P-solubilizing circle on the medium.

2.2 菌株zafu-3的解磷能力与促生特性

以葡萄糖、蔗糖、木聚糖和柠檬酸为碳源时，菌株在部分解磷培养基上形成明显的溶磷圈(表1)，且在以柠檬酸为唯一碳源、植酸钙为唯一磷源的培养基中效果最好，D/d=2.67±0.10 (图2A)。添加这4种碳源后，对菌株zafu-3的解磷能力变化进一步定量分析，结果表明以葡萄糖为唯一碳源时，菌株zafu-3对5种磷源的总溶解量最高，为46.57 mg/(L·d)，分别是以蔗糖、柠檬酸和木聚糖为唯一碳源时的1.8、2.3和3.7倍(图1B中1)。以葡萄糖或柠檬酸为唯一碳源时，菌株zafu-3对Ca₃(PO₄)₂的溶解效果均为最佳，溶磷量分别为32.75 mg/(L·d)和13.14 mg/(L·d)。以蔗糖或木聚糖为唯一碳源时，菌株对植酸钙的溶解效果最好，溶磷量为12.42 mg/(L·d)和10.83 mg/(L·d)。菌株溶解FePO₄、AlPO₄或卵磷脂时，分别添加柠檬酸、葡萄糖和蔗糖的解磷效果最好，溶磷量分别为10.99、5.84和1.31 mg/(L·d) (图1B)。此外，菌株zafu-3接种在苯胺蓝培养基上培养后，其菌落周边形成明显的透明圈(图2B)，D/d=1.37±0.04，表明菌株具有降解木质素的能力。向菌株的培养液中加入Salkowski比色液后，观察到溶液明显变红(图2C)，表明菌株zafu-3具备产生IAA能力。

图2  菌株zafu-3的促生特性。A：以柠檬酸为唯一碳源降解植酸钙；B：木质素降解；C：IAA产生。

Figure 2  The plant growth-promoting properties of strain zafu-3. A: Degradation of calcium phytate using citric acid as the sole carbon source; B: Degradation of lignin; C: Generation of IAA.

2.3 菌株zafu-3对土壤磷有效性的调控

菌株zafu-3接种至土壤中30 d后，其在LP和HP土壤中的数量分别为68.34 CFU/g和162.72 CFU/g。在HP土壤中接菌后，土壤pH值与对照相比降低了0.04，而LP土壤pH值几乎不变(图3A)。接菌后LP和HP土壤的ACP活性分别上升了33.88%和4.21% (图3B)。在HP土壤中ALP上升了13.54%，在LP土壤中ALP活性显著增加，是对照组的2.12倍(图3C)。接菌后有效磷含量在LP土壤中降低了7.87%，而在HP土壤中增加了16.32%，但这些差异均不显著(图3D)。

图3  接种菌株zafu-3后低磷和高磷土壤的理化性质。A：pH；B：酸性磷酸酶活性；C：碱性磷酸酶活性；D：有效磷含量。不同小写字母表示不同处理之间的显著性差异(P<0.05)。

Figure 3  The soil physicochemical properties of LP and HP after the inoculation with strain zafu-3. A: pH; B: ACP activity; C: ALP activity; D: Available P content. Different lowercase letters indicated significant differences in different conditions (P<0.05).

2.4 菌株zafu-3全基因组特征和KEGG分析

基于16S rRNA基因序列的系统发育树分析，结果表明菌株zafu-3与木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)在一起形成稳定的分支(图4)。将菌株zafu-3与GenBank中已收录的近缘菌株进行ANI值比对分析发现，其全基因组序列也与A. xylosoxidans高度相似，序列相似度达98.95%，与其他无色小杆菌属(Achromobacter)相应标准菌株序列相似度均大于80.00%。因此，菌株zafu-3为木糖氧化无色杆菌(A. xylosoxidans)。

图4  基于16S rRNA基因序列的系统发育树及与近缘菌株的ANI值。括号中为菌株的GenBank序列号，标尺0.01表示每个位点的核苷酸替换率，ANI值对比菌株与发育树菌株水平对应。

Figure 4  The phylogenetic tree of strain zafu-3 based on 16S rRNA gene sequences and ANI values among strain zafu-3 and other closely related four strains. The serial number in brackets was the GenBank accession number of the strain. Bar indicated 0.01 nucleotide substitutions per site. The strains with comparative ANI values horizontally corresponded to the strains of the phylogenetic tree.

全基因组结果表明，菌株zafu-3由一个环状染色体组成，其全基因组序列长度为6 650 369 bp，G+C比例为67.49%，包含了6 009条编码基因。全基因组有6条KEGG一级分类通路，共包含42条KEGG二级分类通路(图5)。6条KEGG分类通路中属于代谢通路的基因最多，为2 874个，其次分别是环境信息处理通路(660个)、细胞过程通路(476个)、人类疾病通路(247个)、遗传信息处理通路(202个)、生物系统通路(106个)。

图5  菌株zafu-3的KEGG通路。不同颜色代表KEGG通路的一级分类；纵坐标代表KEGG通路的二级分类；横坐标代表该分类的基因数量。

Figure 5  The KEGG pathways in strain zafu-3. Different column colors indicated the level 1 classification of KEGG pathway; The ordinate indicated the level 2 classification of KEGG pathway; The abscissa indicated the number of genes under the annotation of this classification.

2.5 菌株zafu-3编码有机酸和水解酶的基因

菌株zafu-3有53个参与有机酸代谢的编码基因，这些基因共合成26种与有机酸代谢相关的酶且均属于代谢通路(表2)。菌株包含了35个参与26种磷酸水解酶编码的基因，这些酶分解不同底物的同时会产生能被植物吸收的磷酸(H₃PO₄)，除了ipgD基因属于人类疾病通路、wzb和ffh属于环境信息处理通路外，其余基因均属于代谢通路。此外，在代谢通路中发现有45个编码色氨酸代谢途径(Pathway ID：ko00380)的基因和28个编码苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成(Pathway ID：ko00400)的基

表2  菌株zafu-3分泌参与有机酸生成和有机磷水解酶的基因功能预测

Table 2  Function prediction of genes involved in organic acid and organic phosphorus hydrolase secreted by strain zafu-3

Genes	KEGG ID	Annotation	EC number	Gene numbers
Organic acid
ilvB	K01652	Acetolactate synthase I/II/III large subunit	2.2.1.6	8
argD	K00821	Acetylornithine/N-succinyldiaminopimelate aminotransferase	2.6.1.11; 2.6.1.17	2
leuA	K01649	2-isopropylmalate synthase	2.3.3.13	2
argJ	K00620	Glutamate N-acetyltransferase/amino-acid N-acetyltransferase	2.3.1.35; 2.3.1.1	1
aspB	K00812	Aspartate aminotransferase	2.6.1.1	4
argC	K00145	N-acetyl-gamma-glutamyl-phosphate reductase	1.2.1.38	2
ilvD	K01687	Dihydroxy-acid dehydratase	4.2.1.9	2
ilvE	K00826	Branched-chain amino acid aminotransferase	2.6.1.42	2
icd	K00031	Isocitrate dehydrogenase	1.1.1.42	2
ilvH	K01653	Acetolactate synthase I/III small subunit	2.2.1.6	1
ilvC	K00053	Ketol-acid reductoisomerase	1.1.1.86	1
argE	K01438	Acetylornithine deacetylase	3.5.1.16	4
gltA	K01647	Citrate synthase	2.3.3.1	4
argAB	K14682	Amino-acid N-acetyltransferase	2.3.1.1	1
ectB	K00836	Diaminobutyrate-2-oxoglutarate transaminase	2.6.1.76	1
leuC	K01703	3-isopropylmalate/(R)-1-methylmalate dehydratase small subunit	4.2.1.33; 4.2.1.34	2
leuD	K01704	3-isopropylmalate/(R)-2-methylmalate dehydratase small subunit	4.2.1.33; 4.2.1.35	2
leuB	K00052	3-isopropylmalate dehydrogenase	1.1.1.85	1
asd	K00133	Aspartate-semialdehyde dehydrogenase	1.2.1.11	1
acnA	K01681	Aconitate hydratase	4.2.1.3	2
lysC	K00928	Aspartate kinase	2.7.2.4	1
acnB	K01682	Aconitate hydratase 2/2-methylisocitrate dehydratase	4.2.1.3; 4.2.1.99	1
LYSN	K05825	2-aminoadipate transaminase	2.6.1.-	2
argB	K00930	Acetylglutamate kinase	2.7.2.8	1
ict-P	K18289	CoA-transferases;succinyl-CoA:(S)-malate CoA-transferase	2.8.3.22	2
-	K18292	(S)-citramalyl-CoA lyase	4.1.3.25	1
Phosphohydrolase
acyP	K01512	Acylphosphate phosphohydrolase	3.6.1.7	1
ushA	K11751	UDP-sugar sugarphosphohydrolase	3.1.3.5	1
gph	K01091	2-phosphoglycolate phosphohydrolase	3.1.3.18	4
rsbU_P	K07315	O-phosphoserine phosphohydrolase	3.1.3.3	4
suhB	K01092	Myo-inositol-phosphate phosphohydrolase	3.1.3.25	2
gmhB	K03273	d-glycero-alpha-d-manno-heptose 1,7-bisphosphate 7-phosphohydrolase	3.1.3.82; 3.1.3.83	2
serB	K01079	O-phosphoserine phosphohydrolase	3.1.3.3	2
mupP	K22292	N-acetyl-d-muramate 6-phosphate phosphohydrolase	3.1.3.105	1
rsgA	K06949	Thiamine phosphate phosphohydrolase	3.1.3.100	1
phnX	K05306	2-oxoethylphosphonate phosphonohydrolase	3.11.1.1	1
fbp	K03841	d-fructose-1,6-bisphosphate 1-phosphohydrolase	3.1.3.11	1
pphA	K07313	Protein-serine/threonine-phosphate phosphohydrolase	3.1.3.16	1
surE	K03787	Phosphoric-monoester hydrolases;3′-ribonucleotide phosphohydrolase	3.1.3.5; 3.1.3.6	1
-	K07053	Nucleoside-3′,5′-bisphosphate 3′-phosphohydrolase	3.1.3.97	1
cpdB	K01119	3′-ribonucleotide phosphohydrolase	3.1.3.6	1
wzb	K25307	Protein-tyrosine-phosphate phosphohydrolase	3.1.3.48	1
ipgD	K13085	1-phosphatidyl-1-d-myo-inositol-4,5-bisphosphate 4-phosphohydrolase	3.1.3.78	1
bacA	K06153	Ditrans, octacis-undecaprenyl-diphosphate phosphohydrolase	3.6.1.27	1
ppx-gppA	K01524	Polyphosphate phosphohydrolase	3.6.1.40; 3.6.1.11	1
bcrC	K19302	Ditrans, octacis-undecaprenyl-diphosphate phosphohydrolase	3.6.1.27	1
pgpA	K01095	Phosphatidylglycerophosphate phosphohydrolase	3.1.3.27	1
ribBA	K14652	GTP 7,8-8,9-dihydrolase (formate-releasing, phosphate-releasing)	3.5.4.25	1
ffh	K03106	GTP phosphohydrolase (protein-synthesis-assisting)	3.6.5.4	1
-	K01081	5′-ribonucleotide phosphohydrolase	3.1.3.5	1
kdsC	K03270	3-deoxy-d-manno-octulosonate-8-phosphate 8-phosphohydrolase	3.1.3.45	1
IMPL2	K18649	β-l-galactose-1-phosphate phosphohydrolase	3.1.3.15; 3.1.3.25; 3.1.3.93	1

(待续)

因。在细胞过程通路中发现有3个参与木质素降解的基因，其中2条同属于环境信息通路，3条基因编码同种超氧化氢酶降解木质素，同时有165个基因，编码参与苯丙氨酸代谢、苯甲酸盐降解、丙酮酸代谢等代谢路径的蛋白质，这些蛋白质与木质素降解过程密切相关。

3 讨论与结论

本研究从毛竹根际分离出一株多效解磷菌zafu-3，为木糖氧化无色杆菌。目前报道的解磷细菌主要为芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudolnonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)等^[33]。木糖氧化无色杆菌多被报道具有修复重金属等污染土壤^[34-35]、生物防治^[36]、纤维素分解^[37]、降解氨氮^[38]的功能，其解磷及植物促生能力尚未见报道。菌株zafu-3在提高土壤磷生物有效性方面，主要展现出以下显著优势：(1) 具有广泛的溶磷能力，能够溶解难溶性有机磷，以及钙、铁、铝结合态无机磷，从而提高解磷效率；(2) 能够利用多种糖类、氨基酸和有机酸作为碳源，这表明它可能在土壤具有较强的生存能力和广泛的分布范围，特别是在碳输入较高的区域，如植物根际；(3) 菌株zafu-3的生物量较高，为巨大普里斯特氏菌(Priestia megaterium)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、米氏假单胞菌(Pseudomonas migulae)这些解磷菌生物量的1.28-3.20倍^[39-41]。当然，TSB作为常见的细菌培养基，含有丰富的营养物质^[42]，有利于菌株生长，菌株在野外条件下的存活能力及与其他微生物共生竞争关系仍需进一步研究；(4) 菌株zafu-3具有较强的环境耐受性，在pH 4.0-10.0、6%以下NaCl的条件下均能生长，前期研究也表明木糖氧化无色杆菌有较强的生存能力^[43]。在高磷土壤中，菌株zafu-3可能通过降低土壤pH、分泌碱性磷酸酶来提高土壤有效磷含量。然而，低磷土壤接种该菌后有效磷含量降低，可能是因为菌株产生的磷酸酶更多将难溶性有机磷转化为难溶性无机磷^[44]，以及被微生物自身利用。因此，菌株zafu-3能通过产生有机酸和磷酸酶来激活土壤磷库，为植物和自身提供可直接吸收利用的有效磷。

菌株zafu-3全基因组序列中含有53条编码有机酸和35条编码磷酸水解酶的基因，且接菌后土壤pH下降、磷酸酶活性上升，这表明在细菌培养过程中，多种编码有机酸和水解酶的基因得到了表达。例如，gltA编码的柠檬酸合成酶催化草酰乙酸和乙酰辅酶A合成柠檬酸，柠檬酸和土壤中的金属离子反应后生成的柠檬酸盐能够降低土壤pH值，这一变化进而增加了难溶性磷的溶解，增强了植物对磷的吸收^[45]，这有助于减少化肥的使用量，减轻径流污染。菌株zafu-3分泌的多种磷酸水解酶可作用于不同的磷酸酯键，促使多种含磷有机物发生脱磷反应。例如，surE编码的磷酸单酯水解酶作用于磷酸单酯键，可溶解土壤中丰富的磷酸单酯类物质^[46]。因此，深入挖掘菌株zafu-3解磷相关的基因资源，探究菌株解磷机制，将有助于更精准地调控其解磷过程，这对于提高土壤磷有效性、缓解植物磷限制至关重要。

菌株zafu-3不仅具备解磷功能，还具有多种促生特性。在其全基因组中，存在参与合成色氨酸侧链氧化酶(tryptophan side-chain oxidase, TSO)的基因，如kynA，可用于合成促进植物生长的激素IAA。在菌株培养液中已检测到IAA，这表明相应基因在活细菌中表达。同时，菌株zafu-3有21条参与铁载体编码的基因，铁载体与土壤中的铁螯合，进而释放磷酸铁中的磷，为植物同时提供铁元素和有效磷。本研究在菌株的培养过程中并未检测到铁载体的产生，这可能是由于全基因组中有2条编码转录调节蛋白Fur的furB基因。在铁离子充足的环境下，Fur蛋白会抑制铁载体编码基因的表达^[47]。此外，菌株zafu-3全基因组还包含大量与木质素降解有关的基因，且在苯胺蓝培养基培养后观察到了明显的透明圈，这表明菌株zafu-3可能具备分解植物凋落物的能力，能够释放植物残体中的磷等营养物质，促使磷元素重新进入土壤的生物地球化学循环。

值得注意的是，在实际应用中解磷菌株所处的环境条件远比实验室环境复杂，这增加了利用解磷菌提高土壤磷有效性和促进植物生长的不确定性。例如，菌株在野外环境中的稳定性和存活期限难以预测。然而，菌株zafu-3在不同pH值、NaCl浓度、碳源和磷源供应下，均能保持其解磷活性。因此，该菌株有望在多样化的土壤环境中持续发挥其促进土壤中有机磷和无机磷转化的能力。这可能与菌株基因组中编码多种有机酸和磷酸酶的基因表达密切相关，多样化的功能基因有助于菌株适应不同的环境条件。此外，基于菌株zafu-3所包含的解磷相关功能基因，可通过基因编辑与基因表达调控、构建工程菌株等分子生物学技术提高其解磷能力，有效缓解植物因磷素不足而面临的生长限制问题。

本研究从毛竹根际分离出一株具备多途径解磷的木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans) zafu-3。该菌含有大量与解磷和促生功能相关的基因，主要通过分泌多种有机酸和磷酸酶溶解难溶性无机磷和有机磷，尤其是在高磷土壤中。此外，菌株zafu-3在多种碳源和磷源、较宽的pH和NaCl浓度范围内均能良好生长，这确保了其功能稳定性。因此，菌株zafu-3有望成为提高土壤磷生物有效性的工程菌株，其在解磷菌肥研发、促进缺磷土壤条件下的植物生长方面具有广阔的应用前景。

作者贡献声明

项春铸：方法设计、调查研究、数据分析、结果可视化、论文撰写与修订；房翠莲：调查研究、结果可视化；田佳怡：调查研究；张清：调查研究；李全：方法设计、论文修订；宋新章：研究概念生成；曹婷婷：研究概念生成、方法设计、论文撰写与修订、课题监管与指导。

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