粪肠球菌

摘要

目的

土壤微生物耐受单一重金属或有机污染物的生物调控机制已被广泛研究，但微生物应对复合污染的生物学机制仍不清楚。本研究旨在通过转录组学揭示粪肠球菌HHT-1耐受镉(Cd)和苯胺(aniline, AN)单一及复合污染胁迫的生物学应对机制。

方法

采用转录组学方法，探究在半数抑制浓度(IC₅₀)下HHT-1在Cd (150 mg/L)和苯胺(2 g/L)单一及复合胁迫(Cd浓度150 mg/L+苯胺浓度2 g/L)的转录调控机制。

结果

在Cd单一胁迫下，HHT-1通过增强金属结合蛋白和转运蛋白基因的表达，促进Cd²⁺的固定或排出。高浓度Cd引发细胞内的氧化应激反应，HHT-1上调核糖体和核苷酸相关基因的表达，以修复由氧化应激引起的蛋白质和DNA损伤，并产生过氧化氢酶清除细胞内的活性氧(reactive oxygen species, ROS)。此外，Cd胁迫还诱导HHT-1中致病基因和抗生素抗性相关基因的上调。在苯胺单一胁迫下，HHT-1激活苯胺降解酶基因的表达以降低其毒性，并上调药物外排蛋白基因将苯胺排出细胞外。苯胺同样引起细胞内的氧化应激，HHT-1通过上调谷胱甘肽合成酶基因来清除ROS。在Cd和苯胺复合胁迫下，HHT-1展现出复杂的应对机制。首先，HHT-1通过上调金属转运蛋白和药物外排蛋白基因，有效地将Cd和苯胺这2种有害物质排出细胞外，减轻了它们对细胞的毒性影响。同时，HHT-1通过过氧化氢酶和谷胱甘肽双重途径清除细胞内的ROS。在复合胁迫下，HHT-1上调致病基因和抗生素抗性相关基因，可能增强其致病性和耐药性。值得注意的是，在复合胁迫下，HHT-1并未显著表达苯胺降解酶相关基因。

结论

粪肠球菌HHT-1对Cd和苯胺复合胁迫的转录调控机制结合了单一Cd胁迫和单一苯胺胁迫下的转录调控机制，但与单一Cd胁迫下的机制更为接近。在复合胁迫下，HHT-1主要通过增强细胞壁合成、Cd²⁺外排、DNA修复、清除ROS等机制进行调控，同时结合了苯胺胁迫下的药物外排蛋白、谷胱甘肽等相关基因的表达。Cd单一及Cd和苯胺复合胁迫都可能增加HHT-1的致病潜力和耐药性。

关键词

粪肠球菌; 转录组学; 镉; 苯胺; 复合污染

肠球菌属(Enterococcus)是一类广泛分布于自然环境和人体内的革兰氏阳性球菌，常见的肠球菌主要包括粪肠球菌(E. faecalis)和屎肠球菌(E. faecium)^[1]。肠球菌是一种条件致病菌，在人体免疫力低下时容易引发感染和疾病^[2]，如泌尿道感染、心内膜炎、口腔疾病等。近年来，由于肠球菌具有较强的耐药性，并且能够通过水平基因转移迅速传播耐药基因^[3]，使其在医学和环境健康领域受到广泛关注和研究^[4]。

肠球菌不仅定殖于人体和动物体内，还广泛存在于多样的自然环境中，例如土壤、水体以及植被等^[5]。肠球菌对多种环境胁迫具有较强的耐受性，例如肠球菌能够在10-45 ℃、6.5% NaCl、pH 9.6的条件下生长，并且可以在60 ℃下存活30 min^[6]。此外，肠球菌还表现出交叉耐受性的特征，例如，其在pH 10.5的环境中的适应性可以显著提高其在0.3%胆汁溶液中的存活率^[7]。正是这些特性赋予了肠球菌在人体肠道、土壤、湖泊甚至盐湖等极端环境中较强的生存能力^[3]。此外，研究发现环境中的肠球菌可以降解多种有机污染物^[8-10]。因此，研究环境中肠球菌对环境胁迫的耐受机理具有广泛的科学意义和应用价值。目前大量研究表明微生物能够通过自身的生物学响应机制拮抗环境中的重金属和有机污染物胁迫。如假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)可以通过产生胞外多糖显著降低Pb污染根际土壤及小白菜可食用组织和根部的Pb含量，有效地提高了小白菜的生物量^[11]；一株深海冷泉芽孢杆菌在受到重金属Cd胁迫时，通过吸收钙离子将NO活性氧压力转化为氮循环的驱动力，从而有效增强细菌应对Cd胁迫的能力^[12]；微小杆菌属(Exiguobacterium)细菌能够利用4-氯吲哚作为唯一的碳源和能量来源，并且在浓度高达0.5 mmol/L的情况下，仍能高效地对其进行降解^[13]。然而，微生物拮抗复合胁迫(特别是重金属-有机物复合胁迫)的生物学机制仍不清楚。复合胁迫会产生比单一胁迫更复杂的联合毒性效应，即协同(1+1>2)、拮抗(1+1<2)或加和(1+1=2)效应^[14]。这表明微生物可能通过独特的生物学机制来耐受复合污染物的胁迫。

Cd作为一种典型的重金属污染物，具有毒性强、半衰期长、环境迁移性强、生物易吸收且不可逆的特点^[15]。苯胺(aniline, AN)作为化工合成中不可或缺的原料^[16]，具有致癌、致畸和致突变的潜在风险^[17]。苯胺在水溶液中具有较好的溶解性^[18]，而且在环境中具有较高的持久性和生物降解难度^[19]，导致许多国家和国际组织已将其列为环境优先控制的污染物^[20]。在实际工业生产场景下，Cd和苯胺在化学合成、半导体制造、橡胶生产等行业具有较高的复合暴露风险。

与单一污染相比，目前对于微生物拮抗复合胁迫(尤其是针对重金属与有机污染物的复合胁迫)的机制仍不清楚。本研究以分离自土壤中的粪肠球菌HHT-1作为研究对象，该菌能够耐受高浓度Cd和苯胺胁迫。通过转录组学揭示粪肠球菌HHT-1应对Cd和苯胺单一及复合胁迫的生物学调控机制。了解这些机制有助于预测和评估耐药微生物在不同环境中的生态作用和潜在影响，深入理解环境复合污染带来的额外生态风险——即条件致病性以及耐药基因的传播。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

胰蛋白胨和酵母提取物，OXOID公司；氯化钠(NaCl)，生工生物工程(上海)股份公司；氯化镉(CdCl₂) (纯度≥99%)和苯胺(纯度≥99%)，上海麦克林生化科技股份有限公司；cDNA逆转录试剂盒，ThermoFisher Scientific公司；RNA提取试剂TRIzol Reagent，Invitrogen公司。

电泳仪，Agilent公司；基因测序仪Illumina NovaSeq 6000，Illumina公司；NanoDrop 2000分光光度计，Invitrogen公司

1.2 菌株的富集和培养

实验菌株粪肠球菌(Enterococcus faecalis) HHT-1由天津大学地质微生物学团队从中国长春市吉林农业大学长期农田试验站(43°49′N，125°23′E)的玉米地表层土壤(0-20 cm)中分离纯化得到。粪肠球菌HHT-1的培养使用LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，氯化钠10.0；并在30 ℃、150 r/min的摇床中培养。

1.3 镉和苯胺对粪肠球菌HHT-1的半数抑制浓度及联合毒性效应分析

参照文献[21]的方法，将粪肠球菌HHT-1分别暴露于不同浓度的Cd和苯胺中，并定期监测细胞的生物量(OD₆₀₀)，通过生物量与有毒物质浓度的拟合计算得到菌株的半数抑制浓度(IC₅₀)。细胞生物量的抑制率计算如公式(1)所示。

生物量抑制率=(各处理组的生物量减少量/对照组的生物量)×100%

(1)

1.4 粪肠球菌HHT-1响应镉和苯胺单一及复合胁迫实验处理

实验共设置4个处理组，每个处理组设置3个重复。处理组包括：(1) 对照(CK)，在LB培养基中加入纯净水；(2) 镉单一胁迫处理(Cd)，将一定体积的CdCl₂母液加入LB培养基中，使最终Cd浓度为150 mg/L；(3) 苯胺单一胁迫处理(AN)，将一定体积的苯胺母液加入到LB培养基中使最终苯胺浓度为2 g/L；(4) Cd和苯胺复合胁迫处理(Mix)，将一定体积的CdCl₂和苯胺母液加入到LB培养基中最终Cd和苯胺浓度分别为150 mg/L和2 g/L。确保各处理组的培养体系体积一致。将粪肠球菌HHT-1按1%的接种量接种到含有不同处理的LB培养基的锥形瓶中，置于30 ℃、150 r/min的摇床中培养。在细菌对数生长后期(CK处理组OD₆₀₀值为0.482；Cd处理组OD₆₀₀值为0.241；AN处理组OD₆₀₀值为0.241；Mix处理组OD₆₀₀值为0.096)，将各处理组以10 000 r/min离心5 min，分离得到菌体，置于-80 ℃冰箱保存，用于RNA提取。

1.5 RNA提取和纯化

使用RNA提取试剂从样品中提取总RNA，并去除基因组DNA。对所提取的RNA进行浓度和纯度检测，采用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，测定RIN值。高质量的RNA样本(OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.8-2.2，OD₂₆₀/OD₂₃₀≥2.0，RIN≥6.5，28S:18S≥1.0，总量>10 μg)用于构建测序文库。RNA检测合格后，取5 μg的总RNA，按照标准操作手册中的方法去除rRNA。使用Fragmentation Buffer将mRNA随机打断成短片段。按照Illumina的标准进行cDNA合成、末端修复、A碱基添加和测序接头连接。筛选出200-300 bp的cDNA目标片段，随后使用Phusion DNA聚合酶(NEB公司)进行PCR扩增。PCR扩增体系(50 μL)：2×PCR预混液，正、反向引物(浓度10 μmol/L)各2.5 μL，DNA模板50 ng，补充ddH₂O至50 μL。PCR扩增条件：98 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共15个循环；72 ℃延伸10 min。通过TBS380定量后，使用测序平台进行测序。以上过程由上海凌恩生物科技有限公司完成。

1.6 基因差异表达分析和功能富集

利用reads per kilobase per million mapped reads (RPKM)法计算基因表达量，以识别实验组和对照组间的差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)，RPKM法能有效消除基因长度和测序量差异对基因表达计算的影响，计算得到的基因表达量可直接用于比较不同样品间的基因表达差异。差异基因的筛选标准为|log₂ fold change|≥1且错误发现率(false discovery rate, FDR)≤0.05。通过基因本体数据库(gene ontology, GO)和京都基因和基因组百科全书数据库(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)进行注释分析和显著性富集分析，确定差异基因涉及的生物功能及代谢途径，进而分析粪肠球菌HHT-1在Cd和苯胺单一及复合胁迫下的响应机制。

1.7 实时荧光定量PCR (RT-qPCR)验证

为验证RNA-seq实验结果，选取10个相关差异表达基因进行RT-qPCR分析，基因名称及引物序列见表1。取5 μg总RNA使用cDNA逆转录试剂盒将获得的RNA转录成cDNA，根据操作手册，按20 μL体系添加引物、模板进行RT-qPCR分析，以16S rRNA基因作为内参。采用2^-ΔΔCt相对定量法分析不同基因mRNA表达水平的变化，得到基因的相对表达水平。

表1  RT-qPCR验证基因及引物序列

Table 1  Gene selection and primer design for RT-qPCR

Gene name	Forward primer (5′→3′)	Reverse primer (5′→3′)	References
thiE	GCAAATACGGATCCTGCT	GTTGGCGTTGTGAGGAGA	[22]
nanE	CAACAACTGCATACGCTC	TGGAAGGCCCAGATTATG	[22]
recA	TGAAACTAGGTGATGGTA	CTTAGGATAACCGCCTAC	[23]
secE	TTCGGACGCATCTGGCTG	TGAATGCCACGAACACCA	[24]
recO	CGCATCGTGATCCTGCTC	AGACGATGTCCAGCGACC	[24]
efp	CGCAGCGAGTACCAGTAC	CTGGTTCTCGAGCATGAA	[24]
GAPDH	CATGACAATTCGGCATCG	ATGTTCTGGGCAGCACCT	[24]
rpoB	TGTCCGCATTGATCGCAC	TCAAGCGTATTTCGCAGG	[25]
rpmE	TCGATCGACTGACCATCG	GTCTAGCATCCTGACTAC	[25]
murC	GTCATCGATCGATCCTAC	CTATCGAGCTATCGATTG	[25]

2 结果与分析

2.1 粪肠球菌HHT-1拮抗镉和苯胺单一及复合胁迫的差异表达基因分析

转录组的主成分分析(principal component analysis, PCA)能从整体上反映各组之间的总体表达差异和组内样本之间的变异度大小。结果显示，主成分1 (PCA1)与主成分2 (PCA2)可分别解释样品基因表达总体差异的92.35%和4.87%，PCA1和PCA2共同解释了总体方差的97.22% (图1)。各处理的3个生物学重复数据点聚集在一起，表明转录结果可靠。此外，各污染物处理的数据点均距离CK处理较远，且Cd处理和Mix处理(Cd和苯胺复合胁迫)的数据点较为接近，说明HHT-1应对Cd和Mix胁迫具有相对接近的转录响应。

图1  HHT-1响应Cd和苯胺单一及复合胁迫的转录水平主成分分析(PCA)。CK为对照组；Cd为单一Cd处理；AN为单一苯胺处理；Mix为Cd和苯胺复合处理。

Figure 1  Principal component analysis of the transcriptional level response of HHT-1 to single and combined stress of Cd and AN. CK represents the control treatment; Cd represents the single Cd treatment; AN represents the single AN treatment; Mix represents the combined treatment of Cd and AN.

将符合|log₂ fold change|≥11且FDR≤0.05的基因鉴定为差异表达基因，结果如图2所示。在Cd处理组，共有1 179个上调基因和428个下调基因(图2A)；在AN处理组，共有463个上调基因和600个下调基因(图2B)；在Mix处理组，共有1 173个上调基因和411个下调基因(图2C)。

图2  Cd和苯胺单一及复合胁迫下HHT-1差异表达基因分析。A：Cd胁迫下差异表达基因火山图；B：苯胺胁迫下差异表达基因火山图；C：Cd和苯胺复合胁迫下差异表达基因火山图；D：AN、Cd和Mix处理中上调差异表达基因韦恩图；E：AN、Cd和Mix处理中下调差异表达基因韦恩图。

Figure 2  Analysis of DEGs in HHT-1 under single and combined stress of Cd and AN. A: Volcano plot of differentially expressed genes under Cd stress; B: Volcano plot of differentially expressed genes under AN stress; C: Volcano plot of differentially expressed genes under combined Cd and AN stress; D: Venn diagram of upregulated differentially expressed genes in AN, Cd and Mix treatments; E: Venn diagram of down regulated differentially expressed genes in AN, Cd and Mix treatments.

将各处理组的差异表达基因进行韦恩图(Venn diagram)可视化分析。图2D、2E展示了各处理组差异表达基因的数量及重叠关系。在AN、Cd和Mix三种处理下，分别有118、161、149个特异性上调基因，分别占各自差异上调基因的25.49%、13.66%、12.70% (图2D)。同时，分别有289、38、25个特异性下调基因在AN、Cd和Mix处理中出现，占各自下调基因的48.17%、8.88%、6.10% (图2E)。

2.2 粪肠球菌HHT-1拮抗镉和苯胺单一及复合胁迫的差异表达基因GO富集分析

为进一步揭示这些差异表达基因的特定生物学功能，将不同处理下的差异表达基因在GO (gene ontology)数据库进行了显著性富集分析。GO富集分析根据基因功能将基因和基因产物分为分子功能(molecular function, MF)、生物过程(biological process, BP)和细胞组分(cellular composition, CC) 3类^[26]。

Cd处理组共获得31个GO功能注释，其中上调基因富集到26个GO terms，下调基因富集到5个GO terms。AN处理组共得到61个GO功能注释，上调基因富集到13个GO terms。Mix处理组共获得55个GO功能注释，上调基因富集到41个GO terms，下调基因富集到14个GO terms (表2)。

表2  Cd、AN和Mix三种处理组中GO通路富集数量

Table 2  The enrichment quantity of GO pathway in Cd, AN and Mix treatment groups

Item	Upregulated GO terms				Downregulated of GO terms
	BP	CC	MF	All	BP	CC	MF	All
Cd	18	5	3	26	4	0	1	5
AN	6	1	6	13	32	13	3	48
Mix	29	9	3	41	7	4	3	14

Cd处理组中，生物过程富集到了细胞大分子代谢(cellular macromolecule metabolic process)、基因表达(gene expression)、RNA修饰(RNA modification)、tRNA修饰(tRNA modification)、核糖体蛋白复合物组装(ribonucleoprotein complex assembly)、大分子代谢过程(macromolecule metabolic process)、细胞大分子生物合成过程(cellular macromolecule biosynthetic process)；细胞组分中富集了核糖体蛋白复合物(ribonucleoprotein complex)、核糖体(ribosome)、细胞质(cytosol)；分子功能中富集了RNA结合(RNA binding)、核糖体结构成分(structural constituent of ribosome) (图3A)。

图3  HHT-1响应Cd和苯胺单一及复合胁迫的上调差异表达基因GO富集分析。A：Cd胁迫下上调差异表达基因GO富集分析；B：苯胺胁迫下上调差异表达基因GO富集分析；C：Cd和苯胺复合胁迫下上调差异表达基因GO富集分析。

Figure 3  GO enrichment analysis of upregulated DEGS in HHT-1 in response to single and combined stress of Cd and AN. A: GO enrichment analysis of upregulated DEGS in response to Cd stress; B: GO enrichment analysis of upregulated DEGS in response to AN stress; C: GO enrichment analysis of upregulated DEGS in response to Cd stress the combined stress of Cd and AN.

AN处理组中，生物过程中富集到了对非生物刺激的响应(response to abiotic stimulus)、细胞脂质代谢(cellular lipid metabolic process)、脂质代谢过程(lipid metabolic process)、脂质生物合成(lipid biosynthetic process)；细胞组分中上调了ATP酶复合体(ATPase complex)；分子功能中上调了核苷酸结合(nucleotide binding)、核苷酸磷酸结合(nucleoside phosphate binding)、蛋白质结合(protein binding)、小分子结合(small molecule binding) (图3B)。

Mix处理组中，生物过程中上调了细胞大分子代谢过程(cellular macromolecule metabolic process)、细胞大分子生物合成过程(cellular macromolecule biosynthetic process)、大分子生物合成过程(macromolecule biosynthetic process)、基因表达(gene expression)、肽生物合成过程(peptide biosynthetic process)；细胞组分中富集了非膜结构细胞器(non-membrane-bounded organelle)、细胞内非膜结构细胞器(intracellular non-membrane-bounded organelle)、核糖体(ribosome)、核糖核蛋白复合物(ribonucleoprotein complex)、核糖体亚基(ribosomal subunit)；分子功能中富集了核糖体的结构成分(structural constituent of ribosome)、RNA结合(RNA binding)、结构分子活性(structural molecule activity) (图3C)。

2.3 粪肠球菌HHT-1拮抗镉和苯胺单一及复合胁迫的差异表达基因KEGG富集分析

为了更深入地探讨Cd和苯胺单一及复合胁迫对HHT-1代谢途径的影响，本研究利用KEGG数据库对相关基因进行归类，并按照它们参与的代谢通路或生物学功能进行了系统性分析。将不同处理组的全部差异基因进行KEGG富集分析，结果如图4所示。

图4  HHT-1响应Cd和苯胺单一及复合胁迫的差异表达基因KEGG富集分析。A：Cd胁迫下差异表达基因KEGG富集分析；B：苯胺胁迫下差异表达基因KEGG富集分析；C：Cd和苯胺复合胁迫下差异表达基因KEGG富集分析。

Figure 4  KEGG enrichment analysis of DEGs in HHT-1 in response to single and combined stress of Cd and AN. A: KEGG enrichment analysis of DEGs in response to Cd stress; B: KEGG enrichment analysis of DEGs in response to AN stress; C: KEGG enrichment analysis of DEGs in response to the combined stress of Cd and AN.

Cd处理组富集到的通路包括细胞运动性(cell motility)、翻译(translation)、核苷酸代谢(nucleotide metabolism)、脂质代谢(lipid metabolism)、糖类生物合成和代谢(glycan biosynthesis and metabolism)、外源生物降解和代谢(xenobiotics biodegradation and metabolism)、信号传导(signal transduction) (图4A)。

AN处理组上调的差异基因富集到生物合成其他次级代谢产物(biosynthesis of other secondary metabolites)、碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)、膜转运(membrane transport)、糖类生物合成与代谢(glycan biosynthesis and metabolism)、翻译(translation) (图4B)。

Mix处理组富集的通路则包括细胞运动性(cell motility)、信号传导(signal transduction)、翻译(translation)、复制和修复(replication and repair)、外源生物降解和代谢(xenobiotics biodegradation and metabolism) (图4C)。

2.4 粪肠球菌HHT-1耐受镉和苯胺单一及复合胁迫的关键基因表达情况分析

2.4.1 细胞壁合成相关基因的转录调控

在Cd、AN和Mix处理下，HHT-1上调了与肽聚糖生物合成(peptidoglycan biosynthesis)、壁酸生物合成(teichoic acid biosynthesis)、萜类骨架生物合成(terpenoid backbone biosynthesis)等与细胞壁合成相关的途径。在肽聚糖合成途径中，Cd处理组和Mix处理组分别上调了20个和18个基因，而AN处理组仅上调了9个相关基因。在壁酸合成中，Cd处理组和Mix处理组分别上调了18个和15个基因，而AN处理组仅上调了11个相关基因。Cd、AN和Mix三个处理组在萜类骨架生物合成中上调基因数量相似(图5A)。

图5  Cd和苯胺单一及复合胁迫下HHT-1关键基因的表达情况分析。A：细胞壁合成相关基因；B：核糖体合成相关基因；C：ABC转运蛋白相关基因。

Figure 5  Analysis of the expression of key genes in HHT-1 under single and combined stress of Cd and AN. A: Cell wall synthesis-related genes; B: Ribosome synthesis-related genes; C: ABC transporter-related genes.

2.4.2 核糖体合成相关基因的转录调控

核糖体主要负责细胞内的蛋白质合成，作为细胞中的“蛋白质工厂”，核糖体通过翻译mRNA (信使RNA)上的遗传信息，将氨基酸组装成蛋白质。核糖体的正常功能对于细菌的生长、代谢以及应对环境胁迫至关重要。Cd处理组和Mix处理组分别上调了41个和42个核糖体合成相关基因。AN处理组仅上调了4个相关基因，却下调了28个相关基因。这可能反映了HHT-1在应对不同类型胁迫时资源和能量的重新分配以及调控策略的调整(图5B)。

2.4.3 ABC转运蛋白相关基因的转录调控

在细菌体内，ABC转运蛋白利用ATP水解产生的能量来实现物质的跨膜转运，参与细胞内的多种生理过程，包括营养物质的摄取、代谢产物的排出、维持细胞内外物质平衡等。转录组数据显示，Cd处理组和Mix处理组分别上调了45个和41个相关基因，AN处理组仅上调了9个基因，却下调了32个相关基因(图5C)。

2.4.4 氧化应激相关基因的转录调控

细菌在接触高浓度的必需或非必需金属后，普遍会产生氧化应激反应，这是由于活性氧(ROS)生成增加或抗氧化防御能力下降造成的^[27]。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)是细胞内抗氧化防御系统的关键酶。在Cd和Mix处理组中，氧化胁迫转录调控基因perR分别上调了6.30倍和5.12倍，而过氧化氢酶编码基因KatE在Cd和Mix处理组中也分别上调了3.45倍和3.35倍。此外，锰超氧化物歧化酶(MnSOD)编码基因sodA在Mix处理组上调了2.01倍，谷胱甘肽合成相关基因gshA在AN处理组上调了1.35倍(图6)。粪肠球菌可以通过不同的机制拮抗H₂O₂的胁迫，结果表明Cd和Mix显著上调KatE基因的表达，而显著下调Npr和ahpc基因的表达；AN处理则主要上调gshA基因，同时下调Npr和ahpc基因的表达。

图6  HHT-1拮抗ROS的机制分析

Figure 6  Analysis of the mechanism of HHT-1 antagonizing ROS.

2.4.5 DNA损伤修复相关基因的转录调控

Cd和苯胺能够引发细胞内的氧化应激反应，导致细胞产生大量ROS，这些ROS与细胞内的大分子物质反应，会引起脂质过氧化、蛋白质氧化和DNA损伤^[28]。在AN、Cd和Mix处理组中，核苷酸代谢途径(purine metabolism)中分别富集到7、26和23个差异表达基因，这表明重金属Cd可能诱发了粪肠球菌HHT-1的DNA损伤(表3)。

表3  与DNA损伤修复相关基因的转录水平分析

Table 3  Transcriptional analysis of genes related to DNA damage and repair

Gene name	log2 fold change
	AN	Cd	Mix
ndk, NME	-	2.04	-
nrdD	-	3.34	-
guaA, GMPS	-	2.38	2.02
gmk, GUK1	-	2.51	2.44
udk, UCK	-	3.60	4.17
pdp	-1.08	-	-
nagD	-	2.33	2.49
cmk	2.21	3.89	3.99
yfkN	-1.28	-2.01	-2.48

-表示基因差异表达不显著(-1<log₂ fold change<1)。

- means differentially expressed genes are not significant (-1<log₂ fold change<1).

2.5 致病基因及耐药相关基因表达情况分析

为了评估环境胁迫对微生物生态毒性的影响，本研究对粪肠球菌的致病基因和耐药基因进行了深入分析。研究发现这些基因在不同处理组的表达情况存在显著差异。粪肠球菌致病基因efaA在Cd处理组和Mix处理组中分别上调了7.7倍和8.3倍，而在AN处理组中下调了1.7倍。黏附蛋白基因ace在AN处理组中上调了3.1倍，而在Cd和Mix处理组中上调了6.50-8.25倍。与粪肠球菌表面黏附、免疫逃避相关的蛋白基因cpsB和cpsA在Cd和Mix处理组中上调了2.73-3.42倍，在AN处理组中仅上调了1.51-1.73倍。

Cd和Mix处理对粪肠球菌耐药基因的表达也有显著影响。Cd和Mix处理显著上调了HHT-1多种抗生素耐受基因的表达(Cd：51个，Mix：48个)，而AN处理对抗生素耐受基因的上调作用较弱(17个)。其中，抗生素外排基因mdeA在Cd和Mix处理组中分别上调了5.18倍和5.40倍，抗生素抗性基因fabI在Cd和Mix处理组中分别上调了3.68倍和2.35倍，抗生素抗性基因nfsA在AN、Cd和Mix处理组中分别上调了1.16倍、3.62倍和4.65倍。抗生素外排泵相关基因TaeA、patA、patB、efrA，抗生素抗性相关基因vanYB、vanSG、vanRG等只在Cd和Mix处理组中显著表达，在AN处理组中未显著表达(图7)。

图7  HHT-1致病及耐药基因表达情况分析

Figure 7  Analysis of the expression of pathogenic genes and drug-resistant genes in HHT-1.

2.6 差异表达基因的RT-qPCR验证

为了验证RNA-seq数据的可靠性，本研究从转录组测序结果中选取了10个相关基因进行RT-qPCR验证，包括细胞代谢基因thiE，DNA修复基因recO和recA，RNA合成基因rpoB，转运蛋白基因secE，糖酵解基因nanE和GAPDH，细胞壁合成基因murC，以及蛋白合成基因efp和rpmE。如图8A所示，差异表达基因的RT-qPCR结果与转录组测序结果在基因表达量上有一定的差异，但RT-qPCR测定结果与转录组数据(图8B)的趋势一致，验证了RNA-seq结果的可靠性。

图8  差异表达基因的RT-qPCR验证

Figure 8  Validation of DEGs using RT-qPCR.

3 讨论与结论

3.1 粪肠球菌HHT-1对镉和苯胺单一及复合胁迫的耐受能力

环境微生物对Cd和苯胺的耐受浓度范围通常分别为0.01-10 mg/L和30-700 mg/L。例如，Cd对明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum) T3S 15 min的IC₅₀值为0.537 mg/L^[29]，对发光藻类索罗金小球藻(Chlorella sorokiniana) 48 h内的IC₅₀值为0.088 mg/L^[30]，对厌氧氨氧化细菌短期暴露的IC₅₀值为5.43 mg/L。苯胺对肠杆菌的最低抑制浓度(MIC)为700 mg/L^[31]，不产氧光合细菌解苯海红长命菌(Rubrivivax benzoatilyticus) JA2可以耐受的苯胺浓度为30 mmol/L。在我国相关国家标准中，建设用地土壤Cd和苯胺污染风险筛选值分别为65 mg/kg和260 mg/kg。本研究从无污染农田土壤中富集、筛选并纯化得到的粪肠球菌HHT-1，对Cd(Ⅱ)和苯胺的IC₅₀值分别达到150 mg/L和2 g/L。本研究中Cd和苯胺的浓度设置远高于国家的环境质量标准。当Cd和苯胺的浓度均为IC₅₀时，其混合物对HHT-1的生物量抑制率为80%，且Cd和苯胺混合物的联合毒性效应表现为拮抗效应^[21]。以上数据表明，粪肠球菌HHT-1对Cd和苯胺单一及复合污染胁迫具有极强的拮抗能力，因此研究其应对环境胁迫的转录调控机制具有重要的生物学意义。

3.2 粪肠球菌HHT-1在半数抑制浓度下拮抗镉和苯胺单一及复合胁迫的机制

镉能够对细胞造成损伤，尤其是对细胞壁和细胞膜。为了抵御Cd的毒性，HHT-1首先通过增加肽聚糖和壁酸的合成来强化细胞壁结构，从而增强其对环境胁迫的耐受性。HHT-1还上调了与ZinT/AdcA家族金属结合蛋白相关的基因来增强对Cd²⁺的固定能力，这些蛋白通过与重金属离子的结合降低其活性，减少对细胞的毒性并可能将过量的金属离子隔离至细胞内的特定区域，避免对细胞结构和功能的损害。此外，HHT-1上调了与核糖体相关的基因，这可能是因为细胞在面对多种压力时需要合成更多的应激反应蛋白和分子伴侣来修复损伤和维持正常功能，因此上调了与核糖体相关的基因有助于细胞维持蛋白质合成的效率和质量。同时，在Cd处理组中，HHT-1还上调了与ABC转运蛋白相关的基因。ABC转运蛋白可以参与金属离子的转运，当细胞应对高浓度Cd胁迫时，可能通过增强ABC转运蛋白基因的表达促进Cd²⁺排出细胞外，减少其在细胞内的积累，从而保护细胞免受重金属毒性的影响。除了将细胞内的Cd²⁺排出细胞外，ABC转运蛋白中与锰离子转运相关的基因mntA、mntB、mntC在Cd和Mix处理组也显著上调，锰离子作为多种酶的辅助因子，有助于细胞抵抗因重金属引起的氧化应激，并维持细胞内的正常代谢活动^[33]。

高浓度Cd会引起细胞内的氧化应激反应，虽然Cd不直接参与ROS的产生^[34]，但它会干扰细胞的抗氧化防御系统，导致ROS增加^[35-36]。这些ROS能够破坏RNA、DNA、蛋白质和脂质，从而引发细胞和组织损伤，细胞可以通过产生各种抗氧化酶来清除ROS。在Cd胁迫下，HHT-1主要通过产生过氧化氢酶来分解有害的活性氧，减少细胞成分的氧化损伤。同时，HHT-1还激活了锰超氧化物歧化酶抗氧化系统，这些酶有助于中和ROS，维护细胞内的氧化还原平衡。

苯胺主要通过电子传递链在细胞内参与ROS的产生对细胞产生毒性^[37-38]。这一过程可能导致DNA和蛋白质受损，进而触发细胞死亡机制或引起基因突变^[37-39]。在苯胺胁迫下，HHT-1主要通过上调谷胱甘肽相关途径来应对细胞内的氧化应激反应。此外，还上调了过氧化氢酶和MnSOD相关途径以清除细胞内的过氧化氢和其他过氧化物。除了导致细胞的氧化应激，苯胺作为一种亲脂性有机化合物，不会直接损伤细胞壁，而是穿过细胞膜进入细胞内，干扰细胞的正常代谢过程，包括能量产生、蛋白质合成以及细胞信号传导等^[39]。此外，苯胺还可能与细胞内的某些酶和蛋白质发生反应，影响它们的正常功能^[40]，苯胺的代谢产物也可能会对细胞的健康状态产生影响。因此，HHT-1上调了药物外排蛋白相关基因EmrB将苯胺排出细胞外，这也是肠球菌多药耐药性的重要机制之一^[41]。在苯胺胁迫下，核糖体相关的基因下调可能是因为苯胺或其代谢产物对细胞具有毒性，影响了特定的细胞代谢途径或细胞功能，导致细胞内对某些蛋白质的需求减少，从而下调了核糖体相关基因的表达。

虽然HHT-1不是苯胺降解菌，但在面对苯胺胁迫时，HHT-1上调表达了苯胺降解酶相关的基因，如邻苯二酚2,3-双加氧酶(由catE基因编码，上调了4.8倍)，证明了HHT-1以间位降解途径参与苯胺的降解^[42]，这与红球菌(Rhodococcus sp.) AN-P1^[43]、代尔夫特菌(Delftia sp.) XYJ6^[44]的代谢方式一致。这种酶在微生物降解芳香族化合物的过程中起着关键作用，通过增强catE基因的表达，HHT-1能够更有效地利用这些化合物作为碳源^[45]或者加速苯胺的转化和清除，以降低其对细胞的潜在毒性。

镉和苯胺复合污染物对粪肠球菌HHT-1的联合毒性体现为拮抗效应(1+1<2)。粪肠球菌HHT-1在Cd和苯胺复合胁迫下，HHT-1的响应机制结合了Cd和苯胺单一污染胁迫的响应特征。首先，HHT-1上调了参与肽聚糖和壁酸生物合成的相关基因，增强了细胞壁的合成能力，从而有效抵御了Cd对细胞的毒性作用；通过上调ABC转运蛋白相关基因将Cd²⁺排出细胞外；以及上调药物外排蛋白相关基因将苯胺排出细胞外。这些机制共同作用，减轻了Cd和苯胺对细胞的毒性影响。由于Cd和苯胺引起的氧化应激反应在细胞内产生了大量ROS，HHT-1还通过上调核糖体相关基因来修复由ROS引起的蛋白质损伤。这一过程对于维持细胞正常运转至关重要，因为蛋白质的氧化损伤会严重影响其结构和功能。HHT-1激活了超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽等抗氧化途径，有效清除了细胞内的ROS，从而保护细胞免受进一步的氧化损伤。

从转录调控机制来看，粪肠球菌HHT-1在复合污染下的生物学响应机制结合了单一Cd和单一苯胺胁迫转录调控机制的特点，并且与单一Cd胁迫下的转录调控机制更为相似。PCA分析图显示，Mix处理组和Cd处理组在PC1和PC2上具有极高的相似性。在差异表达基因的韦恩图中，Mix处理组和Cd处理组具有最多的重叠差异基因，且显著高于Mix处理与AN处理的重叠差异基因(上调：704 vs. 31)。这一发现表明HHT-1在响应Cd和苯胺复合胁迫的转录调控时，其过程与单一Cd胁迫下的转录调控过程具有较高的相似性。

3.3 半数抑制浓度下镉和苯胺单一及复合胁迫对粪肠球菌HHT-1致病性及耐药性的影响

镉和苯胺作为单一及复合污染物，对生态系统构成了严重的危害，其毒性效应复杂且多样。深入研究Cd和苯胺的生态毒性机制，不仅能够更全面地理解这些污染物的潜在危害，还能为制定有效的环境保护策略和人类健康保护措施提供科学依据。肠球菌通过水平基因转移机制，能够获得对多种抗生素的耐药性^[3]。Paulsen等^[46]对万古霉素耐药E. faecalis的基因组分析发现，其抗性基因是由外来序列构成的。重金属和有机污染物能够影响细菌的致病性和耐药性，废水中发现的新兴污染物，已被证明可以改变细菌对抗生素的反应并增加抗菌素耐药性(AMR)基因的水平转移^[47]。杀生剂作为一种新型有机污染物，可能会通过共选择机制增强细菌的抗生素耐药性^[48]。

本研究也有相同的发现，efaA在粪肠球菌中编码一种特定的抗原EfaA，EfaA是一种心内膜炎相关的表面蛋白，对肠球菌的致病性发挥重要作用^[49]。在Cd和Mix处理组中，efaA基因上调了6-8倍，AN处理组中下调了该基因。与粪肠球菌感染宿主细胞相关的基因ace、cpsB、cpsA在Cd和Mix处理组中的上调量是AN处理组的2倍。这些毒力基因通过编码毒力因子^[50]，使粪肠球菌对宿主细胞产生黏附、定殖、抗吞噬和入侵等作用。以上结果表明，Cd和Mix处理可能会增强粪肠球菌HHT-1的致病潜力，AN处理下HHT-1的致病潜力相对较弱。此外，Cd和Mix处理组还上调了抗生素外排泵相关基因和抗生素抗性基因簇，抗生素外排基因mdeA在Cd和Mix处理组上调了5倍，抗生素抗性基因fabI在Cd和Mix处理组上调了2-3倍，而抗生素抗性基因nfsA在Cd和Mix处理组的上调量是AN处理组的3倍。这些基因的存在能够帮助细胞排出或耐受多种有害物质，从而使粪肠球菌对多种药物产生耐药性。本研究结果表明，Cd和Mix处理与抗生素一样，都对微生物构成选择压力。当微生物暴露于这些污染物时，具有耐药性的个体更容易存活并繁殖，从而导致耐药基因的富集和传播。环境因素(如重金属和有机污染)对微生物耐药性的影响显著，为研究微生物与环境之间的相互作用以及抗生素耐药性的产生机制提供了新的思路。

作者贡献声明

渠素敏：数据整理、数据分析、初稿撰写和文稿修改；陈钰璇：实验分析；朱翔宇：数据分析；王钺博：数据分析；管冬兴：数据分析；张坚超：概念构思、方法设计和文稿修改；滕辉：概念构思。

利益冲突

作者声明不存在任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。