鼠伤寒沙门菌

摘要

沙门菌作为一种常见的人畜共患病原体，可导致多种食源性疾病，其中鼠伤寒沙门菌(Salmonella Typhimurium, STM)是关键血清型之一，其研究与防控对公共卫生具有重要意义。

目的

探究greA和greB基因对鼠伤寒沙门菌生物学特性和致病性的影响。

方法

运用Red同源重组技术构建greA和greB基因缺失株及其回补株，并对其生长特性、生物被膜形成能力、对Caco-2细胞的黏附及侵袭能力进行检测；利用小鼠模型评估了greA和greB基因缺失对STM致病性的影响。

结果

成功构建了突变株STM LT2ΔgreA和STM LT2ΔgreB；与野生株相比，greA和greB基因的缺失均不影响其生长速度，但导致STM的生物被膜形成能力、黏附力、侵袭力均有所下降；greA和greB缺失降低了STM对小鼠肝、脾的定殖力，并使得STM的LD₅₀分别上升了39.81倍和2.5倍。

结论

greA和greB基因的缺失均可降低鼠伤寒沙门菌的致病性，本研究结果为进一步揭示沙门菌的致病机理提供了理论基础。

关键词

鼠伤寒沙门菌; 转录延伸因子; greA; greB; 生物特性

肠炎沙门菌(Salmonella enterica)是全球范围内重要的食源性病原体，而鼠伤寒沙门菌(Salmonella Typhimurium, STM)则是导致人类及家畜感染的主要血清型之一，宿主感染STM后会引发胃肠炎、败血症等疾病，严重时甚至可致宿主死亡^[1-2]。因此，加强STM的监测、预防与控制，对于保障人类健康与促进畜牧业的可持续发展具有重要意义。此外，鼠伤寒沙门菌因其感染率高、生长条件简单以及容易培养等特性，长期以来一直被视为研究沙门菌的模型菌株^[3]。

转录延伸因子(transcription elongation factor)广泛分布于原核生物中。基因表达的首要环节是转录，然而，转录过程往往会遭遇RNA聚合酶(RNA polymerase, RNAP)的暂停与回溯，这些现象能导致转录异常，而转录延伸因子通过与RNAP二级通道发生相互作用，有效预防转录延伸过程中的停滞，从而增强转录效率，并进而调控基因的表达^[4]。目前，细菌中的转录延伸因子GreA和GreB (统称Gre因子)已被证实有3方面的作用。(1) 增强细菌的环境适应力与生存竞争力：多项研究数据表明，在面临诸如营养饥饿、酸性环境、热休克等环境压力时，GreA在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)^[5]、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)^[6]、大肠杆菌(Escherichia coli)^[7]、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)^[8]、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)^[9]等多种细菌中，能够通过调节自身表达水平，从而提高细菌对环境压力的适应性和生存能力；(2) 关联细菌致病性机制：Gaviria-Cantin等^[10]通过敲除STM的greA和greB基因，证明Gre因子介导了Salmonella pathogenicity island 1 (SPI-1)毒力岛的主要调控因子hilD的转录调控路径，进而间接削弱了STM对宿主上皮细胞的侵袭能力；(3) 调控细菌生物膜形成：研究表明，Gre因子能够抑制csgD基因的表达，导致生物膜细胞外基质中的2个主要促进成分——淀粉样纤维和胞外多糖的产生减少，从而影响了细菌生物膜的形成^[11]。

鉴于Gre因子在多种细菌中的重要功能，以及STM中Gre因子的编码基因greA、greB高度保守，本研究利用Red同源重组技术构建了STM转录延伸因子greA和greB单基因突变株STM LT2ΔgreA及STM LT2ΔgreB，并对其生物学相关特性进行检测，旨在为进一步研究greA和greB对细菌致病性的作用研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒及细胞

鼠伤寒沙门菌野生株MA3409 (STM LT2)、MA6950 (含pKD13质粒)、MA7455菌株(含pKD46质粒)、MA12488 (含pCP20质粒)、P22噬菌体均由法国巴黎第十一大学分子遗传学波西实验室惠赠；Caco-2细胞系购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.1.2 主要试剂

2×Taq PCR Master Mix、DL2000 Plus DNA Marker均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、结晶紫均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；L-阿拉伯糖、DMEM高糖培养基、胎牛血清FBS、绿色荧光核酸染料均购自北京索莱宝科技有限公司；GeneJET质粒小提试剂盒购自赛默飞世尔科技公司；其余试剂均为分析纯。

1.1.3 实验动物

实验动物为6周龄的雌性BALB/c小鼠，购自江苏华创信诺医药科技有限公司；该研究已通过贵州大学实验动物伦理分委员会审批(审批号：EAE-GZU-2022-E060)。

1.2 greA和greB基因缺失株及回补株的构建

1.2.1 构建菌株的引物设计

基于NCBI上公布的STM LT2的全基因组序列(NC_003197.2)，针对greA基因设计替换greA的外源DNA扩增引物P1/P2、回补株构建的greA全基因扩增引物P3/P4、greA基因缺失及回补鉴定的P5/P6；针对greB基因设计替换greB的外源DNA扩增引物P7/P8、回补株构建的greB全基因扩增引物P9/P10，greB基因缺失及回补鉴定的P11/P12。引物信息如表1所示，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1  PCR引物序列

Table 1  PCR primer sequences

Primers name	Primer sequences (5′→3′)	Amplicon size (bp)
P1	TCCACTTTAAGCACTTCGTATTCCACATCG CCGCCAGGCGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTT	1 377
P2	TGCGCGAAGAGCTGGATTTTCTGAAATCTGTGCGCCGTCCGATCCGTCGACCTGCAGTTC
P3	ACTGCTTAAAGGTATTCCAC	510
P4	CTACAGGAATGTTCAAGAGG
P5	CTCATCGTCGCCAACAAT	254
P6	AAATCATCGCCGCTATCG
P7	GACAGCAAAGGTAAATCAACGAGATGAAAA CGCCCCTGATGATCCGTCGACCTGCAGTTC	1 377
P8	GACGTATTCGATCGCATTGACGTACCAGTTT GCTTCGCCGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTT
P9	CCGTGTGCGCAATATCGACAG	533
P10	GGCTTAGGATTCTTCTTGTC
P11	TCAATTATCTCTGGCGTGAA	267
P12	CGACAATGCGGAACTTCA

表中下划线部分为靶基因的同源重组区两侧的同源序列。

The underlined part of the table is the homologous sequence on both sides of the homologous recombination region of the target gene.

1.2.2 greA和greB基因缺失株的构建

基于Red同源重组原理，构建greA和greB基因缺失株，基因缺失原理如图1A所示(以greA缺失为例)：(1) 以pKD13质粒为模板，通过含有靶基因同源序列的F1Fa、F2Fb (即表1中的引物对P1/P2)扩增含有Kn抗性基因及FRT位点的打靶片段；(2) 将(1)中获得的打靶片段电转至含pKD46质粒的感受态细胞中；(3) 在pKD46质粒中，3种酶(Exo、Bet、Gam)的作用下发生同源重组，将Kn抗性基因置换入宿主染色体，37 ℃培养消除pKD46质粒，次日挑取阳性转化子；(4) 将pCP20质粒二次电转至(3)中获得的阳性转化子内以消除Kn抗性基因，37 ℃培养消除pCP20质粒，获得greA缺失株。以上述相同方式构建greB缺失株。

图1  基因缺失及基因缺失回补原理模式图。A：基因缺失原理模式图；B：基因缺失回补原理模式图。F1：目的基因上游同源臂；F2：目的基因下游同源臂；Fa：pKD13上游引物；Fb：pKD13下游引物；FRT：同源重组酶识别位点；Kn CDS：卡那霉素抗性基因编码序列；P3/P4：greA全基因扩增引物；P5/P6：greA基因缺失验证引物。

Figure 1  Schematic diagram of gene deletion and gene deletion compensation. A: Schematic diagram of gene deletion; B: Schematic diagram of gene deletion compensation. F1: Upstream homology arm of the target gene; F2: Downstream homology arm of the target gene; Fa: pKD13 upstream primer; Fb: pKD13 downstream primer; FRT: Homologous recombinase recognition site; Kn CDS: Kanamycin resistance gene coding sequence; P3/P4: greA whole gene amplification primers; P5/P6: greA gene deletion validation primers.

分别使用引物对P5/P6、P11/P12对基因缺失株进行PCR验证，若无扩增条带，表明greA和greB基因成功缺失，并将验证正确的缺失株分别命名为STM LT2ΔgreA和STM LT2ΔgreB。

1.2.3 greA和greB基因回补株的构建

构建greA和greB基因缺失回补株，基因缺失回补原理如图1B所示(以greA缺失为例)：(1) 以STM LT2基因组为模板，使用引物对P3/P4扩增greA全序列，将其连接入pMD19-T载体；(2) 将(1)中获得的重组质粒电击转化入STM LT2ΔgreA感受态细胞中，获得greA缺失回补株。以上述相同方式构建greB缺失回补株。

分别使用引物对P5/P6、P11/P12对基因缺失回补株进行PCR验证，若扩增条带分别为254 bp和267 bp，表明回补株构建成功，并将验证正确的回补株分别命名为STM LT2ΔgreA::greA和STM LT2ΔgreB::greB。

1.3 生长特性检测

将STM LT2、STM LT2ΔgreA及STM LT2ΔgreB、STM LT2ΔgreA::greA、STM LT2ΔgreB::greB分别接种于5 mL LB内，置于37 ℃、170 r/min振荡条件下培养约12 h后，转接至新的5 mL LB内，并将各菌液初始OD₆₀₀调整为0.01；将调整后的菌液继续置于37 ℃、170 r/min振荡条件下培养8 h，培养期间每隔1 h测量并记录各菌液OD₆₀₀值，实验重复3次。

1.4 生物被膜形成能力检测

取复苏后STM LT2、STM LT2ΔgreA、STM LT2ΔgreB、STM LT2ΔgreA::greA及STM LT2ΔgreB::greB菌液各50 μL复接于5 mL LB中，培养至生长对数期(OD₆₀₀=0.8-0.9)，96孔板中每孔加入150 μL LB和5 μL菌液，其中两排不加菌液作空白对照，将96孔板置入37 ℃培养箱培养48 h；小心弃净96孔板中培养液，无菌PBS洗板3次；甲醛固定15 min后弃去，无菌PBS洗板3次；2%结晶紫染色20 min后弃去，无菌PBS洗板3次；95%的乙醇溶解孔内结晶紫，检测孔内液体OD₅₇₅值。实验重复3次。

1.5 细菌黏附、侵袭试验

将24孔板内生长至90%的Caco-2细胞用无菌PBS洗涤3次，每孔加入经抗MEM重悬后的STM LT2、STM LT2ΔgreA、STM LT2ΔgreB、STM LT2ΔgreA::greA及STM LT2ΔgreB::greB菌液[感染复数(MOI)=100]各20 μL以侵染Caco-2细胞，室温1 000 r/min离心5 min，于37 ℃恒温培养1 h，培养结束后用PBS洗涤细胞板3次，每孔加入1 mL 1% Triton X-100裂解细胞，倍比稀释后取100 μL细胞裂解液进行涂板计数，测定细菌的黏附率，重复3次。同时，将上述各菌株感染后的细胞以1 mL/孔加入含100 μg/mL庆大霉素的20% DMEM，37 ℃恒温培养1 h，PBS洗去未黏附的细胞，每孔加入1 mL 1% Triton X-100裂解细胞，倍比稀释后取20 μL细胞裂解液进行涂板计数，测定细菌的侵袭率，实验重复3次。黏附率计算如公式(1)所示，侵袭率计算如公式(2)所示。

黏附率=(黏附细胞细菌数/孔内感染细菌数)×100%

(1)

侵袭率=(侵入胞内细菌数/孔内感染菌数)×100%

(2)

1.6 小鼠体内致病性实验

将110只雌性6-8周龄BALB/c小鼠，随机分为22组，其中，STM LT2感染组、STM LT2ΔgreA感染组、STM LT2ΔgreB感染组各7组为实验组，剩余1组为空白对照组；根据活菌计数结果，将浓度梯度分别为1.0×10⁷-1.0×10¹ CFU/mL的各菌液以0.2 mL/只腹腔注射接种小鼠，同时设立腹腔注射等量PBS对照组，每间隔6 h观察1次小鼠死亡数量及精神状况，连续观察21 d，利用寇氏改良法公式计算各实验菌株的半数致死量(LD₅₀)。

将36只雌性6-8周龄BALB/c小鼠随机分成12组，每组3只，其中，1-4组、5-8组、9-12组小鼠分别腹腔注射1.0×10⁴ CFU/mL的各菌株菌液0.1 mL；在攻毒后24 h时取1、5、9组，48 h时取2、6、10组，72 h时取3、7、11组，96 h时取4、8、12组，分别进行颈椎脱臼处死后，无菌采集肝脏及脾脏；按照每0.05 g组织加入995 μL PBS进行研磨，研磨液10倍稀释至适宜浓度进行涂板计数，计算小鼠肝、脾脏的载菌量，结果取平均值。

1.7 数据统计分析

采用 GraphPad Prism 8.0对各菌株生长特性、生物被膜形成能力、侵染Caco-2细胞的结果、小鼠肝、脾组织载菌量进行差异显著性分析。实验结果以平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，ns表示无显著性差异。

2 结果与分析

2.1 greA、greB基因缺失株及回补株的构建结果

使用引物对P5/P6、P11/P12分别验证缺失株STM LT2ΔgreA、STM LT2ΔgreB，以及回补株STM LT2ΔgreA::greA、STM LT2ΔgreB::greB。greA缺失、回补验证中，STM LT2及STM LT2ΔgreA::greA条带大小均为254 bp且STM LT2ΔgreA无条带；greB缺失、回补验证中，STM LT2及STM LT2ΔgreB::greB条带大小均为267 bp且STM LT2ΔgreB无条带，与预期相符(图2A、2B)。结果表明，缺失株STM LT2ΔgreA、STM LT2ΔgreB，以及回补株STM LT2ΔgreA::greA、STM LT2ΔgreB::greB均构建成功。

图2  greA、greB基因缺失株及回补株的构建结果。A：greA重组菌株构建的PCR电泳结果(M：DL2000 DNA Marker；1：STM LT2；2：STM LT2ΔgreA；3：STM LT2ΔgreA::greA)；B：greB重组菌株构建的PCR电泳结果(M：DL2000 DNA Marker；1：STM LT2；2：STM LT2ΔgreB；3：STM LT2ΔgreB::greB)。

Figure 2  The results of the construction of greA and greB gene deletion strains and the back strains. A: PCR electrophoresis results of greA recombinant strains (M: DL2000 DNA Marker; 1: STM LT2; 2: STM LT2ΔgreA; 3: STM LT2ΔgreA::greA); B: PCR electrophoresis results of greB recombinant strains construction (M: DL2000 DNA Marker; 1: STM LT2; 2: STM LT2ΔgreB; 3: STM LT2ΔgreB::greB) .

2.2 生长特性检测结果

分别将STM LT2、STM LT2ΔgreA、STM LT2ΔgreB、STM LT2ΔgreA::greA、STM LT2ΔgreB::greB在同等条件下培养8 h，每间隔1 h测定细菌的OD₆₀₀值，并绘制生长曲线。结果如图3所示，greA、greB缺失株及回补株的生长速度相对于野生株无明显差异。

图3  生长曲线的测定结果

Figure 3  Growth curves measurement results.

2.3 生物被膜形成能力检测结果

各菌株的生物被膜形成能力如图4所示，与野生株相比，greA和greB基因的敲除均使STM的生物被膜形成能力极显著(P<0.01)下降，但greA基因缺失较greB基因缺失影响更为显著；而回补株STM LT2ΔgreA::greA、STM LT2ΔgreB::greB的生物被膜形成能力并无显著变化。

图4  细菌生物被膜96孔板检测结果。**：差异极显著(P<0.01)；ns：无显著性差异。

Figure 4  Bacterial biofilm 96-well plate assay results. **: Extremely significant difference (P<0.01); ns: No significant difference.

2.4 黏附力、侵袭力检测结果

如图5A、5B所示，与野生株相比，STM LT2ΔgreA对Caco-2细胞的黏附力、侵袭力均极显著(P<0.01)降低；STM LT2ΔgreB对Caco-2细胞的黏附力极显著(P<0.01)降低，侵袭力显著(P<0.05)降低；而回补株STM LT2ΔgreA::greA、STM LT2ΔgreB::greB的黏附力、侵袭力均无显著变化。

图5  细菌的黏附力、侵袭力结果。A：黏附性结果；B：侵袭力结果。*：差异显著(P<0.05)；**：差异极显著(P<0.01)；ns：无显著性差异。

Figure 5  Results of bacterial adhesion and invasion. A: Adhesion results; B: Invasion results. *: Significant difference (P<0.05); **: Extremely significant difference (P<0.01); ns: No significant difference.

2.5 小鼠体内致病性检测结果

野生株和基因缺失株感染小鼠的致病力结果如表2所示，通过寇氏改良法公式计算得出STM LT2、STM LT2ΔgreA和STM LT2ΔgreB的LD₅₀分别为1×10^1.9、1×10^3.5、1×10^2.3；相对于STM LT2，greA、greB基因缺失导致STM的LD₅₀值分别上升了39.81倍和2.5倍，表明greA和greB基因对沙门氏菌的毒力有明显的影响。

表2  细菌LD₅₀测定

Table 2  Determination of LD₅₀ for bacteria

攻毒剂量 Challenge dose	小鼠死亡数量/每组总数 Number of mouse deaths/Total number per group
	PBS	STM LT2	STM LT2ΔgreA	STM LT2ΔgreB
1×107	0/5	5/5	5/5	5/5
1×106		5/5	5/5	5/5
1×105		5/5	5/5	5/5
1×104		5/5	4/5	5/5
1×103		5/5	1/5	5/5
1×102		3/5	0/5	1/5
1×101		0/5	0/5	0/5
LD50		1×101.9	1×103.5	1×102.3

野生株和基因缺失株的肝、脾载菌能力结果如图6、图7所示，与野生株相比，STM LT2ΔgreA的肝脏载菌量在所有检测时间段均发生极显著下降(P<0.01)，脾脏载菌量除24 h无显著变化外，其余时间段均发生极显著下降(P<0.01)；STM LT2ΔgreB的肝脏载菌量在所有检测时间段均发生显著下降(P<0.05)，脾脏载菌量除24 h无显著变化外，其余时间段均发生显著下降(P<0.05)。

图6  肝脏载菌量。*：差异显著(P<0.05)；**：差异极显著(P<0.01)。

Figure 6  Bacterial load in liver. *: Significant difference (P<0.05); **: Extremely significant difference (P<0.01).

图7  脾脏载菌量。*：差异显著(P<0.05)；**：差异极显著(P<0.01)；ns：无显著性差异。

Figure 7  Bacterial load in spleen. *: Significant difference (P<0.05); **: Extremely significant difference (P<0.01); ns: No significant difference.

3 讨论与结论

greA和greB基因编码的Gre转录延伸因子在DNA的转录过程中发挥着重要作用^[12]。在基因表达的首个步骤——转录中的延伸阶段，DNA常因调控序列的错误结合导致RNAP回溯失活，进而引起转录异常，但Gre转录延伸因子能够加速异常RNA复合物的裂解，从而重新激活转录^[10,13-14]。近年来的研究表明，Gre不仅确保转录过程的正常进行，还作为细菌的全局调控因子发挥着重要作用。因此，本研究采用Red同源重组技术，缺失了STM菌株中转录延伸因子编码基因greA和greB，并比较了野生株与基因缺失株之间的相关特性，探究了Gre转录延伸因子对细菌生物学特性的影响。

Gre因子的反回溯活性可影响细菌基因组的精确、高效表达，进而为细菌供应生长过程中必需的蛋白质及其他生物分子，以保证细菌正常生长与代谢。Stepanova等^[15]通过比较分析大肠杆菌野生株与大肠杆菌greA缺失株转录组，发现GreA上调的操纵子主要负责蛋白质合成及细菌能量代谢过程。然而，在本研究中，greA/B基因的敲除对于细菌的生长速度并无明显影响，这表明在特定条件下，Gre因子对STM生长特性的影响可能相对有限，或者存在其他具有相似作用的调控因子以补偿Gre因子的缺失。这一推测在大肠杆菌中得到验证：Vinella等^[16]发现大肠杆菌GreA过表达可抑制dksA突变体的生长缺陷，表明DksA和GreA/GreB具有相似的功能。同样作为转录调控因子的DksA，其突变往往导致转录过程异常，进而破坏基因表达的整体平衡^[17]；而GreA的过表达能够补偿dksA突变带来的这种不平衡，暗示了GreA在转录延伸阶段的作用与DksA在转录起始及早期延伸阶段的调控之间存在某种协同或互补关系。尽管在本研究中greA/B的缺失对STM菌株的生长速度无显著影响，但这并不排除Gre因子在特定环境条件下或特定基因表达背景下发挥关键作用的可能性。细菌作为高度适应性的生物体，其基因表达调控网络往往包含多个层次的备份机制，以确保在面临各种环境压力时能够维持生存和繁殖能力。因此，下一步研究应通过结合不同的实验条件和环境因素以全面评估Gre因子在细菌生长与代谢中的贡献。

生物被膜，作为细菌在生物或非生物表面形成的复杂结构，其内部细菌群体被胞外聚合物基质紧密包裹，这一特性显著增强了细菌的生存、繁殖及致病潜能^[18]。在本研究中，与野生株相比，缺失株STM LT2ΔgreA、STM LT2ΔgreB的生物被膜形成能力出现了不同程度的降低，尤其是STM LT2ΔgreA的生物被膜形成能力受损明显。Gaviria-Cantin等^[11]、Liu等^[19]研究发现，Gre因子的存在与csgD基因的表达水平高度相关，而csgD作为STM生物被膜形成的主要调节因子，能够激活胞外多糖纤维素、卷曲菌毛以及生物膜相关蛋白的生物合成，促使细菌从浮游状态过渡到群体状态转变，从而推动生物被膜的形成；当greA/B基因缺失后，csgD基因的表达受到抑制，进而降低了STM的生物被膜形成能力。此外，STM成功定殖于组织后，会迁移到组织表面形成生物被膜，并借助生物被膜进行大量增殖，同时产生相应的侵入性组织细胞蛋白以发挥致病作用。因此，生物被膜形成能力的降低不仅揭示了细菌群体行为的变化，还从机制上解释了缺失菌株在小鼠感染模型中肝、脾载菌量减少的原因，凸显了生物被膜在细菌致病过程中的重要性。

细菌的黏附性、侵袭力及在小鼠体内的致病性实验结果均表明，greA/B基因的缺失会导致STM致病性降低。Gaviria-Cantin等^[10]的研究进一步揭示了Gre因子缺失导致细菌致病性降低的具体机制：Gre因子的缺失会间接导致STM中SPI-1 (Salmonella pathogenicity island 1)负责编码的效应蛋白(如SipA、HilD、SopE等)表达降低，这些效应蛋白是细菌侵入宿主细胞和细胞内生存的关键毒力因子，其表达水平的降低直接影响了STM的侵袭能力和在宿主内的定殖能力，最终导致了细菌整体毒力的显著下降。此外，STM的基因组结构复杂，携带了大量辅助基因，这些辅助基因包括与细菌致病性相关的不同遗传元件，如基因组岛、质粒和噬菌体^[20]。值得注意的是，这些辅助基因的表达则需要Gre因子的存在^[12]；Gre通过调控辅助基因的表达，间接影响细菌的毒力、生存能力和适应性，进一步证明Gre因子在细菌致病过程中的重要性。

综上所述，greA/greB基因在STM的致病性中发挥重要作用。然而，要深入了解这些基因具体的调节机制，以及greA/B基因之间是否存在协同或拮抗效应，还需要进行更为深入的实验研究。通过对greA/B基因缺失株的生物学特性的探究，为沙门氏菌毒力及致病性研究及沙门氏菌减毒活疫苗的开发提供了实验证据和理论依据。