芬氏另枝菌促进炎症性肠病发展及其机制

摘要

目的

探究芬氏另枝菌(Alistipes finegoldii)对炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)的影响，并进一步阐明其潜在的相关致病机制。

方法

6周龄的雄性C57BL/6J小鼠在饮用链霉素3 d后，被随机分为3组：对照组(Control组)、PBS组和给菌组(AF组)。通过灌胃给予芬氏另枝菌(每只1×10⁹ CFU/200 μL)或PBS，持续2周。之后，小鼠饮用含有2.5%葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium, DSS)的水溶液1周以诱导结肠炎模型。评估小鼠的体重下降分数、粪便性状、血便情况、结肠长度，对结肠组织进行HE染色并进行组织病理评分；于实验开始及结束时收集小鼠粪便，进行16S rRNA基因扩增子测序；用实时定量聚合酶链式反应(qPCR)检测结肠组织相关肠屏障蛋白和炎症因子的mRNA表达。

结果

AF组小鼠的体重下降分数、疾病活动度指数评分、结肠缩短程度及组织病理评分均高于PBS组。肠屏障的紧密连接蛋白Occludin、Claudin 5的mRNA表达相较于PBS组下降，而炎症因子IL-17A的mRNA表达则升高。AF组相较于PBS组的肠道菌群α多样性降低；β多样性分析显示两组间肠道菌群多样性存在显著性差异。线性判别分析效应大小(linear discriminant analysis effect size, LEfSe)分析发现，给菌组与PBS组之间存在显著差异的细菌类群: 在纲水平上，芽孢杆菌纲 (Bacilli)；在目水平上，丹毒丝菌目(Erysipelotrichales)；在科水平上，丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)、海生线状菌科(Marinifilaceae)；在属水平上，气杆菌属(Odoribacter)、杜博斯氏菌属(Dubosiella)；在种水平上，纽约杜博斯氏菌(Dubosiella newyorkensis)，在给菌组中显著高于PBS组。

结论

芬氏另枝菌能够促进炎症因子的分泌，损害肠黏膜通透性，改变肠道菌群的结构和多样性，从而加剧肠炎的发展。

关键词

炎症性肠病; 肠道菌群; 芬氏另枝菌; 肠道屏障

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一种病因尚不明确的肠道慢性炎症性疾病，临床上最常见的2种亚型为克罗恩病(Crohn’s disease, CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)。尽管IBD的确切病因在很大程度上仍不清楚，但近年来的研究表明，个体遗传易感性、外部环境因素、肠道微生物菌群以及免疫反应均参与了IBD的发病机制^[1-3]。IBD的发生常伴有肠道黏膜屏障的损害，特别是上皮细胞的紧密连接结构受损^[4]。当肠道屏障被破坏后，致病微生物进入黏膜，进而引发炎症细胞的募集和大量炎症因子的分泌，从而进一步加剧黏膜损伤^[5-6]。

肠道微生物菌群是一个与宿主共同进化的复杂群落，具有多种功能，包括协助代谢营养物质、调节免疫反应和抵御病原体入侵^[7]。然而，当肠道细菌与宿主免疫反应之间的正常平衡关系失调时会导致肠道炎症的发生。事实上，越来越多的证据表明，肠道菌群在肠道疾病的发病过程中扮演着至关重要的角色，甚至可能是核心因素^[4,8-9]。

肠道菌群失调与IBD之间的关系是动态的、复杂的，并且相互作用、互为因果^[10]。一方面，IBD发生时肠道的屏障功能受损，形成肠漏，导致有害微生物过多地进入黏膜固有层，这些有害微生物的大量定殖会抑制其他共生菌的生长，从而导致肠道菌群的失调^[11]。另一方面，肠道菌群失调又会进一步加剧肠道的免疫耐受紊乱，使机体的免疫反应过度激活^[12]。同时，肠道菌群失调还会引起肠道代谢物的改变，而这些代谢物的变化也影响着IBD的进程，例如通过抑制胆汁酸的代谢和某些短链脂肪酸的合成来加重IBD的发生^[13-14]。

芬氏另枝菌(Alistipes finegoldii)是另枝菌属的一种细菌，常定殖于人的消化道中。此外，Shkoporov等^[15]指出在阑尾炎、腹腔脓肿和直肠脓肿等样本中也可分离出该菌株。关于A. finegoldii在IBD中的作用存在相互矛盾的研究结论。Dziarski等^[16]的研究显示，芬氏另枝菌在结肠炎中具有抗炎作用；而另一些研究则发现，A. finegoldii在IBD和结直肠癌中促进了炎症和肿瘤的发展^[17-18]。前期，我们在结直肠癌患者的粪便样本中发现并分离了多株A. finegoldii，并在体外实验中检测了其促进免疫细胞分泌炎症因子的情况，本研究中将进一步探讨A. finegoldii对IBD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择6周龄、雄性野生型无特定病原体(specific-pathogen-free, SPF)级C57BL/6J小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，饲养于军事医学研究院实验动物中心。动物实验通过伦理委员会审核，伦理编号：IACUC-DWZX-2024-012。

1.2 主要试剂

RNA提取试剂盒FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2、逆转录试剂盒Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix和HiScript III RT SuperMix for qPCR试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；链霉素和粪便隐血定性检测试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium salt, DSS)购自MP公司；哥伦比亚血平板购自Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 实验分组

小鼠混养1周后，随机分为3组：Control组、PBS组和AF组，每组12只。先饲喂含有链霉素的饮用水3 d便于灌胃细菌定殖，之后AF组给予芬氏另枝菌灌胃(每只小鼠每天1×10⁹ CFU/200 μL)，Control组和PBS组给予相同体积的PBS溶液，灌胃2周。灌胃结束后，AF组和PBS组饲喂2.5% DSS的饮用水，Control组正常饮水，每天测量小鼠的体重、记录小鼠粪便性状，方法参考文献[8]。疾病活动指数(disease activity index, DAI)评分细则见表1，小鼠处死后结肠组织送至武汉赛维尔生物科技有限公司进行HE染色及病理评分，病理评分细则见表2。

表1  疾病活动指数评分

Table 1  Disease activity index

Score	Percentage of weight loss (%)	Faecal viscosity	Blood feces
0	<1	Dry, hard	Negative occult blood test
1	1-5	Wet, hard
2	5-10	Soft, sticky	Positive occult blood test
3	10-20	Soft, loose
4	>20	Loose stool	Blood feces

表2  病理评分

Table 2  Histopathologic scores

Score	Mucosal damage	Inflammatory cell infiltration
0	Normal	No infiltration
1	Mild loss of crypts	Sporadic infiltration
2	Moderate loss of crypts	Submucosal infiltration increased
3	Severe loss of crypts	Submucosal nest-like infiltration
4	Full-layer erosion and ulceration	Transmural infiltration

1.4 细菌培养

本研究所用芬氏另枝菌来自课题组前期从结肠癌患者粪便中分离，使用哥伦比亚血平板培养，放置在厌氧箱(80% N₂+10% H₂+10% CO₂)中，37 ℃培养48 h。在血平板上加入适量PBS溶液，用涂布棒把菌落刮去，收集菌液，于4 ℃、5 000 r/min离心8 min后重悬，调整浓度为5×10⁹ CFU/mL的细菌悬液用于灌胃。

1.5 小鼠粪便收集

在实验起点和终点分别收集小鼠粪便于1.5 mL的无菌EP管中，之后迅速转移到-80 ℃冰箱中保存。实验中涉及的引物序列如表3所示。

表3  小鼠肠道紧密连接蛋白和炎症因子引物的序列

Table 3  Sequences of mouse intestinal tight junction proteins and inflammatory factor primers

Primers name	Primer sequences (5′→3′)
Gapdh-F	ATCACTGCCACCCAGAAGACTG
Gapdh-R Occludin-F	ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG CTGCTGCTGATGAATATAATAG
Occludin-R	CCTCTTGATGTGCGATAA
Claudin 5-F	GCTCTCAGAGTCCGTTGACC
Claudin 5-R	CTGCCCTTTCAGGTTAGCAG
IL-17A-F	TTTAACTCCCTTGGCGCAAAA
IL-17A-R	CTTTCCCTCCGCATTGACAC
TNF-α-F	CCCTCACACTCAGATCATCTTCT
TNF-α-R	GCTACGACGTGGGCTACAG

1.6 统计学分析

连续变量的组间比较在满足正态性条件时，采用mena±SD表示，使用独立样本t检验；否则使用秩转换的非参数检验(Mann-Whitney U检验)。本研究的统计分析均采用双侧检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。作图时，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.000 1。

2 结果与分析

2.1 芬氏另枝菌加重了DSS诱导的急性结肠炎

DSS诱发的结肠炎是模拟IBD的常用动物模型。使用DSS诱导的急性结肠炎小鼠模型，研究了Alistipes finegoldii对结肠炎的影响及其作用机制。用链霉素处理无特异性病原体的C57BL/6J小鼠，以促进A. finegoldii在肠道的定殖，然后用A. finegoldii灌胃(图1A)。通过连续监测并记录每组的体重、粪便稠度和粪血情况，发现与对照组和PBS组相比，A. finegoldii灌胃组的小鼠体重下降程度和疾病活动度指数显著升高(P<0.05，P<0.001，图1B、1C)。处死小鼠后发现，A. finegoldii 灌胃组的小鼠结肠长度较PBS组明显缩短(P<0.05，图1D、1E)。这些结果表明A. finegoldii加重了DSS诱导的急性结肠炎。

图1  芬氏另枝菌加重了DSS诱导的急性结肠炎。A：给小鼠饲喂含有2 mg/mL链霉素的饮用水3 d，然后灌胃0.2 mL PBS或0.2 mL 1 ×10⁹ CFU的芬氏另枝菌2周，再喂食水或2.5% DSS 7 d；B：小鼠体重变化；C：DAI评分；D：代表性结肠图像；E：小鼠结肠长度。

Figure 1  Alistipes finegoldii exacerbates DSS-induced acute colitis. A: Mice were given 3 days of water containing 2 mg/mL streptomycin, followed by 2 weeks of gavage of 0.2 mL of PBS or 0.2 mL of 1×10⁹ CFU of Alistipes finegoldii, followed by 7 days of water or 2.5% DSS; B: Mouse body weight change; C: DAI score; D: Representative colon image; E: Length of mouse colon.

2.2 芬氏另枝菌损害了肠道黏膜屏障

肠黏膜的炎症和结构破坏是炎症性肠病的病理特征，对小鼠结肠进行HE染色后观察发现，PBS组和AF组肠组织黏膜均可见大范围溃疡，黏膜上皮及隐窝结构消失，并伴有大量淋巴细胞、粒细胞浸润。根据黏膜损伤和炎性细胞浸润情况的组织病理评分显示，AF组小鼠结肠炎症程度更高(P<0.05，图2A、2B)。肠上皮屏障是抵御管腔病原体和抗原的第一道防线，肠道屏障受损是IBD的重要发病机制。Occludin和Claudin是2种重要的紧密连接膜蛋白，它们的正常表达和功能对于维持细胞间的紧密连接结构和生理功能至关重要。通过测定小鼠肠组织中Occludin和Claudin的表达水平可以评估肠道的黏膜屏障功能。研究发现，AF组小鼠较PBS组Occludin和Claudin 5的表达均出现下调(P<0.05，P<0.01，图2C、2D)。同时，检测了组织内炎症因子的表达情况，发现两组TNF-α的表达差异不明显(图2E)，而AF组IL-17A的表达较PBS组出现明显的上调 (P<0.05，图2F)。以上结果表明，A. finegoldii能够损伤肠道黏膜屏障，促进炎症因子的分泌，从而加重肠道炎症的进展。

图2  芬氏另枝菌损害肠道黏膜屏障、促进炎症因子的分泌。A：代表性的HE染色图像，比例尺：100 μm；B：HE染色的组织学评分；C、D：小鼠肠道组织中紧密连接蛋白(Occludin、Claudin 5)的表达；E、F：炎症因子TNF-α和IL-17A在小鼠肠道组织中的表达。

Figure 2  Alistipes finegoldii impairs the intestinal mucosal barrier and promotes the secretion of inflammatory factors. A: Representative image of HE staining, scale bar: 100 μm; B: Histological scoring of HE staining; C, D: Expression of tight junction proteins (Occludin, Claudin 5) in mouse intestinal tissue; E, F：Expression of inflammatory factors TNF-α and IL-17A in mouse intestinal tissues.

2.3 芬氏另枝菌改变了肠道菌群的结构

2.3.1 肠道菌群门和属水平丰度以及菌群多样性变化

肠道菌群在炎症性肠病的发病机制中发挥着重要作用。16S rRNA基因测序技术的进步使得对肠道菌群的研究更加便利。收集小鼠实验终点时的粪便进行16S rRNA基因测序，以探究A. finegoldii灌胃后小鼠肠道菌群的变化。在门水平上，相较于对照组，PBS组和AF组的拟杆菌门(Bacteroidota)、放线菌门(Actinobacteriota)丰度均有所下降，其中AF组下降的程度更大，而疣微菌门(Verrucomicrobia)、变形菌门(Proteobacteria)的丰度则有所上升，AF组上升的程度更大(图3A)。在属水平上，乳杆菌属(Lactobacillus)、宿主关联乳杆菌属(Ligilactobacillus)、肠杆状菌属(Enterorhabdus)的丰度均有所下降，AF组下降的程度更为显著；罗姆布茨菌属(Romboutsia)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、拟杆菌属(Bacteroides)、杜博西氏菌属(Dubosiella)的丰度有所上升，AF组上升的程度更大(图3B)。α多样性用于分析样本组内的微生物群落多样性，通过组内样本的多样性分析(α多样性)可以反映微生物群落的丰富度和多样性，常用的判断指标包括Chao1指数、观测物种指数(observed OTUs)、Shannon指数和Pielou均匀度指数。通过分析发现AF灌胃组的Chao1指数(P=0.014)，Shannon指数(P=0.001 6)均显著低于PBS组(图3C、3D)。β多样性则用于对不同组间的微生物群落构成进行比较分析，通过β多样性指数组间差异分析、主成分分析(principal component analysis,PCA)和主坐标分析(principal co-ordinates analysis, PCoA)，结果显示对照组、PBS组和AF组的肠道菌群组成结构差异明显(图3E)。

图3  芬氏另枝菌灌胃后改变了肠道菌群的组成。A：门水平相对丰度的前10个物种；B：属水平相对丰度最高的20个物种；C：Shannon指数；D：Chao1指数；E：PCoA分析。

Figure 3  Alistipes finegoldii altered the composition of the intestinal flora after gavage. A: Top 10 species in relative abundance at the phylum level; B: Top 20 species in relative abundance at the genus level; C: Shannon index; D: Chao1 index; E: PCoA analysis.

2.3.2 差异细菌分析

为进一步识别肠道菌群中的差异物种，进行了线性判别分析效应大小(linear discriminant analysis effect size, LEfSe)分析。LEfSe分析能够基于LDA效应大小发现组间在不同菌群、不同种属水平上存在统计学差异的生物标志物，即确定组间具有显著差异的物种。结果显示(图4A、4B)，在纲水平上，芽孢杆菌纲(Bacilli)；在目水平上，丹毒丝菌目(Erysipelotrichales)；在科水平上，丹毒丝菌科(Erysipelotichaceae)和海生线状菌科(Marinifilaceae)；在属水平上，气杆菌属(Odoribacter)和杜博斯氏菌(Dubosiella)；在种水平上，纽约杜博斯氏菌(Dubosiella newyorkensis)等，AF组中显著高于PBS组。

图4  差异细菌分析。A：对组间存在显著差异的物种进行LEfSe分析；B：系统发育树图。

Figure 4  Differences in bacterial analysis. A: LEfSe analysis of species with significant differences among groups; B: Phylogenetic tree.

3 讨论与结论

IBD的病因涉及多方面因素，包括宿主的遗传易感性、肠道微生物群、其他环境因素和宿主免疫系统。目前，越来越多的研究证明肠道微生物在IBD中发挥重要作用^[19]。肠道微生物群复杂而庞大，它们提供了丰富的潜在病原微生物、代谢产物和抗原，可激活宿主的先天性和适应性免疫反应，对宿主免疫系统的建立以及宿主对微生物群落的免疫耐受性起着重要作用。在正常状态下，宿主的免疫系统和肠道菌群处于一种动态平衡状态，这种平衡的失调会导致多种疾病的发病，如肠道疾病、系统性自身免疫疾病和癌症^[20]。许多研究表明，肠道微生物群紊乱会诱发和促进IBD的发生和发展。与健康人相比，IBD患者通常表现出微生物群失衡，肠道微生物群多样性降低，其特征是厚壁菌门丰度降低，拟杆菌门和放线菌门丰度升高^[7]。此外，Th17细胞和Treg细胞分别介导宿主体内促炎和抗炎细胞因子的释放，Th17细胞和Treg细胞之间的平衡对维持正常的肠道免疫功能至关重要。研究表明，肠道微生物群失调导致肠杆菌科等致病菌的丰度上调，产生更多的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)并激活炎症信号转导通路，使得Th17细胞和Treg细胞比例失调，Th17细胞占优势，导致促炎因子IL-17释放增加，从而诱发肠黏膜炎症反应^[21-22]。肠道屏障包括生物屏障、物理屏障、化学屏障和免疫屏障^[23]。肠道共生菌定殖于黏膜上皮层表面，形成微生物屏障，可抵抗病原微生物的入侵，并通过定殖抵抗或调节肠道先天性免疫反应来保护宿主的健康^[24]。肠道微生物群失调可导致机会性病原体相对增加和肠道微生物屏障功能受损，增加肠道通透性，促进机会性病原体入侵，从而诱发结肠炎症反应^[25]。紧密连接蛋白是肠道物理屏障的重要组成部分，通过加强细胞间的连接(包括黏附连接蛋白和紧密连接蛋白)在维持屏障完整性方面发挥着至关重要的作用。当肠道菌群失调时，会损害肠道上皮细胞的形态、结构和更新，从而造成紧密连接蛋白的功能异常，导致肠道黏膜通透性增加，加重肠道炎症^[26]。

芬氏另枝菌是另枝菌属的一种，其在肠炎中的作用既往研究结果差异巨大。本研究通过DSS诱导的急性肠炎小鼠模型，研究芬氏另枝菌对肠炎的影响。结果表明，给予芬氏另枝菌灌胃后小鼠的体重下降程度和疾病活动度较PBS组明显升高，结肠长度较PBS组明显缩短(P=0.019)，结肠组织病理评分也显示炎症程度更高，提示芬氏另枝菌加重了肠道炎症；检测肠道黏膜紧密连接蛋白的基因表达发现，芬氏另枝菌灌胃后，紧密连接蛋白Occludin和Claudin 5的表达较PBS组下降，表明肠道屏障功能受损；检测相关炎症因子的表达发现，芬氏另枝菌灌胃后IL-17A的表达升高，说明芬氏另枝菌促进了炎症因子的分泌。粪便16S rRNA基因测序结果显示，芬氏另枝菌灌胃后，菌群的组成发生改变，小鼠肠道菌群的丰富度和多样性较PBS组均出现下降，菌落结构存在明显差异。具体而言，芬氏另枝菌灌胃后乳杆菌属(Lactobacillus)、宿主关联乳杆菌属(Ligilactobacillus)、肠杆状菌属(Enterorhabdus)等益生菌的丰度下降，而罗姆布茨菌属(Romboutsia)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、拟杆菌属(Bacteroides)、杜博西氏菌属(Dubosiella)的丰度升高。比较芬氏另枝菌组和PBS组发现，主要的差异细菌包括芽孢杆菌纲(Bacilli)、丹毒丝菌目(Erysipelotrichales)、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)、臭气杆菌属(Odoribacter)、海生线状菌科(Marinifilaceae)、杜博斯氏菌属(Dubosiella)、纽约杜博斯氏菌(Dubosiella newyorkensis)；PBS组的主要差异细菌为梭菌纲(Clostridia)、鼠杆状菌科(Muribaculaceae)、大肠杆菌-志贺氏菌(Escherichia-Shigella)、颤螺菌科(Oscillospiraceae)。这些差异细菌的作用并不完全相同。例如，Schaubeck等^[27]发现，在发生TNF驱动的类似克罗恩病(CD)的跨壁炎症的小鼠中，丹毒丝菌的丰度显著增加。Shi等^[28]发现海生线状菌会影响细胞周期的信号从而加重DSS诱导的TLR2-KO小鼠的肠道炎症。Lima等^[29]发现用免疫球蛋白A包被的内脏臭气杆菌(Odoribacter splanchnicus)移植给肠炎患者后可改善结肠炎症。Zhang等^[30]发现纽约杜博斯氏菌(Dubosiella newyorkensis)能够通过产生短链脂肪酸(如丙酸和l-赖氨酸)调节Treg/Th17平衡，改善黏膜屏障损伤。由此可见，芬氏另枝菌对小鼠肠炎的影响并非通过单一的菌属(如致病菌或益生菌)的改变，而是通过多种细菌之间的协同作用影响肠道炎症。本研究与Dziarski等^[16]的研究方法最大的不同在于灌胃细菌的剂量。本研究中芬氏另枝菌的灌胃剂量为每只小鼠每天1×10⁹ CFU/200 μL，而Dziarski等的剂量为2×10⁸ CFU/200 μL，隔天灌胃。因此，本研究中芬氏另枝菌的灌胃剂量远高于Dziarski等的研究，而实验结果的差异很可能是由于灌胃剂量不同所致。

综上所述，芬氏另枝菌能够损害肠道屏障，促进肠道炎症因子的分泌，降低肠道菌群的多样性，从而加重小鼠的肠道炎症。然而，本研究尚未深入探讨芬氏另枝菌与宿主免疫系统之间的相互作用，相关问题仍需进一步研究。

作者贡献声明

郝自创：完成实验并编写论文；李东：参与协助实验操作；童江辉：参与协助实验操作；覃小铭：参与协助实验操作；张欢：参与协助实验操作、数据分析和论文讨论；王雅婧：参与协助实验操作；杨瑞馥：参与实验方案的设计并对论文撰写和修改提出相关意见；谭亚芳：参与实验方案的设计并对论文撰写和修改提出相关意见；毕玉晶：参与实验的研究构思和设计，并参与文章的修改；智发朝：参与实验的研究构思和设计，并参与文章的修改。

利益冲突

作者声明不存在任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。