一株蛙源几丁质分解菌

摘要

目的

从两栖动物肠道中分离并筛选能够有效分解几丁质的菌株，研究其发酵条件、酶学特性，并进行细菌全基因组测序及功能分析。

方法

对高原林蛙肠道内容物进行筛选，分离出1株具有产几丁质酶能力的菌株，并进行形态学和分子生物学鉴定；通过单因素试验和响应面试验对产酶条件进行优化，并研究其酶学性质；开展全基因组测序，鉴定几丁质酶基因家族。

结果

筛选到1株可有效产几丁质酶的菌株JD-3，经鉴定为麦芽香肉食杆菌(Carnobacterium maltaromaticum)。最佳产酶条件为：发酵时间2.47 d，发酵温度31.4 ℃，初始pH 4.9，接种量4%，酶活性达到12 mU/mL。酶学性质分析表明，该酶的最适反应温度为20 ℃，pH 3.0，在室温、酸性条件下表现出良好的稳定性。全基因组分析显示，JD-3基因组全长为4 195 636 bp，包含6个环状重叠群(contig)、63个tRNA基因、19个rRNA基因和3 864个蛋白质编码序列(coding sequence, CDS)。在基因组中鉴定出2个几丁质酶基因，均属于GH18家族，系统发育分析将其归为2个不同的类别。

结论

从高原两栖动物肠道中分离出1株具有常温耐酸特性的几丁质分解菌，经形态学和系统发育鉴定为麦芽香肉食杆菌，这为动物消化系统微生物资源的开发利用提供了新思路。

关键词

高原林蛙; 肠道微生物; 几丁质分解菌; 产酶条件优化; 细菌全基因组

几丁质(chitin)是由N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylgluco-samine, GlcNAc)单元通过β-1,4-糖苷键连接而成的多聚物，在自然界中的含量仅次于纤维素^[1]，广泛分布于水生和陆地生态系统^[2]。几丁质酶(chitinase)属于糖苷水解酶(glycoside hydrolases, GH)，能够催化几丁质脱去N-乙酰氨基葡萄糖，从而分解几丁质^[3]。根据其作用机制的不同，几丁质酶可分为内切型几丁质酶(endochitinase, EC 3.2.1.14)和外切型几丁质酶(exochitinase, EC 3.2.1.29)。内切型几丁质酶在几丁质链的中间部位随机断裂β-1,4糖苷键，生成多种长度的低聚糖；而外切型几丁质酶则从几丁质链的末端开始，依次移除几丁二糖单元^[4]。内切几丁质酶主要来源于GH18和GH19这2个糖苷水解酶家族，外切几丁质酶则主要来源于GH18和GH20糖苷水解酶家族^[5]。几丁质酶广泛分布于细菌、真菌、病毒、动物和高等植物等多种生物体中^[6]，在降解农业、水产业中的几丁质废弃物，调控病原真菌，增强作物抗病力等方面具有重要应用价值^[7]。

动物消化道内寄居着复杂且稳定的微生物群落^[8]。这些微生物在生物降解、为宿主提供必需营养成分等方面起着重要作用^[9-10]，同时还具备疾病防治、生态平衡维持等多种功能^[11-12]。Dar等^[13]成功从褐云玛瑙螺(Achatina fulica)肠道中分离出32株纤维素降解菌；Saranya等^[14]揭示了皱纹螺旋粉虱(Aleurodicus rugioperculatus Martin)肠道细菌群落的功能及在宿主营养供应方面的重要作用。食虫动物消化系统演化出了专门的几丁质降解机制，使其能够高效分解富含几丁质的昆虫外骨骼^[15]，不仅提高了食虫动物的营养获取效率，也为微生物在工业应用中的潜力提供了新的视角。Macdonald等^[16]在节尾猴(Callimico goeldii)的粪便中筛选出了能够降解几丁质的细菌，包括纤维微菌属(Cellulosimicrobium)、节杆菌属(Arthrobacter)、葡萄球菌属(Staphylococcus)等。Zhang等^[17]研究发现，两栖动物肠道中的普雷沃氏菌属(Prevotella)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)等细菌对食物的消化与吸收、肠道调控至关重要；Lombardo^[18]研究发现，两栖动物肠道中存在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等真菌，帮助宿主分解纤维素和其他难以消化的物质；Dhole等^[19]在黑眶蟾蜍(Duttaphrynus melanostictus)的肠道中成功分离出几丁质分解菌；Xu等^[20]基于16S rRNA基因测序，在饰纹姬蛙(Microhyla fissipes)肠道中也筛选到几丁质分解菌。然而，关于两栖动物肠道微生物筛选并纯化几丁质分解菌的报道仍较少，这限制了对几丁质分解菌资源的开发利用。进一步探索两栖动物肠道中几丁质分解菌的筛选和应用，不仅有助于揭示其生物学机制，也为生物技术的应用提供了新的视角。

高原林蛙(Rana kukunoris)隶属于蛙科(Ranidae)林蛙属(Rana)，是青藏高原广泛分布的两栖动物^[21]，分布于海拔2 000-4 000 m的地区^[22]，主要以蜉金龟科(Aphodiidae)小型昆虫为食^[21]。在消化过程中，高原林蛙需分泌几丁质酶消化昆虫的几丁质外壳。因此，几丁质分解菌可能是高原林蛙肠道中的关键微生物。本研究分离纯化高原林蛙肠道中的几丁质分解菌，筛选产酶能力较高的菌株进行全基因组测序，并鉴定几丁质酶基因，以期为几丁质酶资源的开发提供理论依据，并为两栖动物肠道微生物资源的开发利用提供例证。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株分离自青海省西宁市大通县向化乡北川河源湿地(37.105 9°N，101.463 5°E，3 100 m)。采集高原林蛙6只，双毁髓处死后取高原林蛙肠道内容物，迅速放入液氮中，运送到青海民族大学实验室，置于-80 ℃冰箱中保存备用。动物实验通过青海民族大学科技伦理审查（批准号为：2024-015）。

1.2 溶液及培养基

5%胶体几丁质溶液：称取20 g几丁质粉末，加入250 mL的85%的磷酸，在一定时间内完全溶解后，将酸解后的液体倒入预冷的2.5 L蒸馏水中，搅拌均匀，4 ℃静置过夜；8 000 r/min离心10 min，将上清液倒出，加入预冷的蒸馏水重悬，再静置，多次反复，直到悬浊液pH为6.5；定容至400 mL，121 ℃灭菌后置于4 ℃保存备用。

初筛培养基(g/L)：胶体几丁质10.00，K₂HPO₄ 0.70，KH₂PO₄ 0.30，MgSO₄·7H₂O 0.50，ZnSO₄ 0.01，琼脂20.00，pH自然。121 ℃灭菌20 min。

复筛培养基(发酵培养基) (g/L)：胶体几丁质10.00，K₂HPO₄ 0.70，KH₂PO₄ 0.30，MgSO₄·7H₂O 0.50，ZnSO₄ 0.01，pH自然。121 ℃灭菌20 min。

LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.00，NaCl 5.00，酵母膏5.00，pH 7.0-8.0。121 ℃灭菌20 min。

1.3 菌株筛选

1.3.1 初筛

取0.1 g高原林蛙肠道内容物加入25 mL富集培养基中，30 ℃、160 r/min培养3 d，富集后的样品梯度稀释至10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7浓度，并涂布于初筛培养基上，30 ℃倒置培养至培养基表面菌落生长。挑选能产生透明圈的菌落，多次分离纯化，直至能在培养基表面形成单菌落。

1.3.2 复筛

将初筛得到的菌株接种于发酵培养基中，30 ℃、180 r/min培养3 d。随后采用3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylicacid, DNS)比色法测定粗酶液的酶活性，选取酶活性高的菌株进行下一步鉴定。

1.4 酶活性测定

测定方法参照沈愿愿^[23]的方法进行。酶活力单位(U)定义为：在温度为37 ℃的条件下，每分钟催化产生1 μmol还原糖所需的酶量为1个酶活力单位。同时，以N-乙酰氨基葡萄糖制作标准曲线。

1.5 菌种鉴定

将分离纯化出来的单菌落接种到已灭菌的LB培养基中，30 ℃倒置培养48 h，观察菌落特征，进行革兰氏染色，利用光学显微镜观察菌株染色状况。采用扫描电子显微镜观察细胞形态。

采用DNA试剂盒提取菌株的全基因组DNA作为模板，使用细菌16S rRNA基因通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)对待测菌株的16S rRNA基因序列进行PCR扩增。PCR反应体系(25 μL)：2×phanta Max Mix (p515) 12.5 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各1 µL，DNA模板0.5 µL，ddH₂O 10 µL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35次循环；72 ℃终延伸5 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将获得的序列通过BLAST与GenBank中的已知序列进行比对，并利用MEGA v.11.0基于最大似然法构建菌株系统发育树，以确定菌株的属种。

1.6 产酶条件优化

初始发酵培养条件：初始pH 7.0，温度30 ℃，转速160 r/min，装液量100 mL (250 mL三角瓶)，接种量5%。单因素试验：在初始培养条件下，分别考察发酵时间(1、2、3、4和5 d)、发酵温度(26、28、30、32和34 ℃)、接种量(2%、4%、6%、8%和10%)以及培养基的初始pH (4.0、5.0、6.0、7.0和8.0)对产几丁质酶活性的影响，培养72 h后测定几丁质酶活性。

在单因素试验的基础上，选取发酵时间、发酵温度、初始培养基pH作为主要的3个影响因子，以这3个因子为自变量，几丁质酶酶活性(Y)为响应值，采用Design-Expert v.11.0设计3因素3水平的Box-Behnken (BB)响应面试验，BB试验因素与水平见表1。

表1  Box-Behnken试验因素与水平

Table 1  Box-Behnken design factors and levels

Levels	Factors
	T/℃	t/d	pH
-1	30	1	4.0
0	32	2	5.0
1	34	3	6.0

1.7 几丁质粗酶液酶学性质探究

选用优化后的培养条件：培养温度32 ℃，培养基初始pH 5.0，培养时间2 d，产酶发酵培养基初始接种量4%。

1.7.1 最适温度及稳定性

通过在不同温度(20-60 ℃)下测定酶活性，确定几丁质粗酶的最适温度。同时，将粗酶液在不同温度下预先孵育2 h后测定酶活性，以评估其稳定性。

1.7.2 最适pH及稳定性

通过在不同pH体系(pH 3.0-8.0)下测定酶活性，确定几丁质粗酶的最适pH。同时，将粗酶液在不同pH体系(pH 3.0-8.0)中于4 ℃放置2 h后测定酶活性以评估其pH稳定性。

1.8 反应进程曲线及动力学参数测定

在最适温度和最适pH条件下，将1 mL几丁质粗酶液与1 mL 1%几丁质胶体混合，分别在10、20、30、40、50、60、90、120、150、180 min的时间点反应1 h后，按照DNS比色法测定反应体系中的还原糖含量，并绘制反应进程曲线。

为测定几丁质粗酶的反应动力学参数，记录酶在不同浓度几丁质胶体中的初始反应速度。根据上述实验所获得的最佳反应温度和最佳反应pH，将几丁质粗酶与不同浓度(0.25%、0.5%、1%、2%、4%)的几丁质胶体分别反应1 h，采用DNS比色法测定几丁质粗酶酶活性和各体系中的还原糖含量。通过Lineweaver-Burk双倒数作图法进行动力学参数模型测定，计算米氏常数(K_m)和最大反应速度(V_max)值。

1.9 菌株全基因组测序及分析

将菌株接种在LB液体培养基中，30 ℃、160 r/min培养24 h后，置于冷冻离心机中4 ℃、10 000 r/min离心10 min，去除上清液，迅速将菌体置于液氮中保藏，并通过干冰运输至上海凌恩生物科技有限公司进行测序。采用三代测序搭建框架和二代测序进行补洞纠错的方法完成菌株JD-3全基因组的测序，使用Flye软件拼接，获得完整的细菌基因组完成图。利用QUAST和TABLET软件^[24]对拼接结果进行评估。采用Prodigal v.2.6.3软件预测编码基因序列。

1.10 几丁质酶基因家族鉴定

使用HMMER v.3.4.0软件筛选出符合条件的几丁质酶蛋白。对筛选得到的几丁质酶家族蛋白序列构建最大似然进化树，bootstrap值设定为1 000，其他参数保持默认，以探讨其系统发育关系。利用基因组Gff注释文件，通过比对获得几丁质酶家族蛋白的定位信息，使用TBtools软件进行染色体定位图的绘制和共线性分析，并通过MEME软件预测保守结构基序。

2 结果与分析

2.1 高原林蛙肠道产几丁质酶菌株的筛选

利用几丁质酶筛选培养基，从高原林蛙肠道中分离得到6株几丁质分解菌(图1A)。在30 ℃培养4 d (图1B)，计算D/d值判断菌株产几丁质酶活性。结果发现，6株菌均能产几丁质酶，其中菌株JD-3形成的透明圈最大，表明菌株JD-3产几丁质酶的能力最强。通过摇瓶复筛测定菌株的几丁质酶活性，菌株JD-3的几丁质酶活性较强，初始酶活性达到0.010 U/mL。对JD-3菌株进行单菌落分离。

图1  产几丁质酶菌株的筛选

Figure 1  Screening of chitinase-producing strains. A: Preliminary screening results; B: Growth results of strain cultured in culture medium for 4 d.

2.2 JD-3菌株的鉴定

将菌株JD-3接种至LB平板上，于30 ℃恒温培养3 d后，观察到菌落形状为圆形，无色透明，黏稠且易挑起，革兰氏染色为阳性，扫描电镜观察显示菌体呈短棒状(图2)。

图2  菌株JD-3的扫描电镜图

Figure 2  Scanning electron microscopy (SEM) of strain JD-3.

将菌株JD-3的16S rRNA测序结果上传至NCBI进行BLAST比对，发现其与麦芽香肉食杆菌(Carnobacterium maltaromaticum) TMW 2.1581的比对率为100%。[核酸序列数据存储在国家微生物科学数据中心，链接为https://nmdc.cn/resource/genomics/sequence/detail/NMDCN0007N9M，编号为NMDCN0007N9M]。使用MEGA 11.0软件构建系统发育树(图3)，结果显示，菌株JD-3与麦芽香肉食杆菌(Carnobacterium maltarom)、乳酸肉食杆菌(Lactobacillus carnis)、栖鱼肉食杆菌(Carnobacterium piscicola)聚为一支，并与鸡肉杆菌(Carnobacterium gallinarum)形成姊妹群，再与广布肉毒杆菌(Carnobacterium divergens)聚类。综合菌株JD-3的形态学鉴定及16S rRNA基因序列分析，最终将其鉴定为麦芽香肉食杆菌(Carnobacterium maltaromaticum)。

图3  菌株JD-3基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树

Figure 3  Phylogenetic tree of strain JD-3 based on the 16S rRNA gene sequence. The evolutionary history was inferred using the maximum likelihood method based on the Kimura 2-parameter model. The bootstrap consensus tree inferred from 1 000 replicates is taken to represent the evolutionary history of the taxa analyzed.

2.3 菌株JD-3产酶条件的优化

随着发酵时间的延长，菌株JD-3产生的几丁质粗酶酶活性在第2天时达到最大值0.020 U/mL，随后逐渐下降(图4A)，表明菌株JD-3的最适产酶发酵时间为2 d。当培养基的初始pH为6.0时，几丁质粗酶活性达到最大值后急剧下降(图4B)，表明菌株JD-3在弱酸性环境中产几丁质酶的活性较高。在初始接种量为4%的条件下，几丁质粗酶酶活性达到最大值0.012 U/mL (图4C)，表明菌株JD-3的最佳接种量为4%左右；当发酵温度达到32 ℃时，几丁质粗酶酶活性达到最大值，为0.012 U/mL。随着发酵温度的继续升高，几丁质粗酶的酶活性开始下降(图4D)，说明JD-3的最适发酵温度为32 ℃。

图4  单因素试验对几丁质粗酶酶活性的影响

Figure 4  Effect of single factor experiment on the activity of chitin crude enzyme. A: Fermentation time; B: Initial pH; C: Initial inoculum size; D: Fermentation temperature. The different lowercase letters in the picture indicate significant differences among treatments at P<0.05.

在单因素试验的基础上，确定发酵温度(A)、发酵时间(B)、培养基初始pH (C)为主要影响因子，以这3个影响因子为考察因素，几丁质酶酶活性(Y)为响应值，采用Design-Expert v.11.0设计3因素3水平的Box-Behnken响应面试验，对数据进行拟合分析，得到的二次多项回归方程为：Y=0.011 4+0.000 4A+0.001 0B+0.000 4C-0.000 3AC-0.000 5BC-0.000 6A²-0.001 3B²-0.003 1C²。所建立的模型极显著(P<0.01)，失拟项模型不显著(P=0.839 5)；该模型的决定系数R²=0.977 7，调整决定系数R_adj²=0.949 0，说明该方程对试验拟合性较好。在一次项中，A对结果影响极显著(P<0.01)；在二次项中，A、B、C均达到了显著水平(P<0.05)；在交互项中AB、AC、BC均未达到显著水平。根据各因素的F值大小可以得出：各因素对酶活性水平的影响由大到小依次是：B>C=A (发酵时间>发酵温度=培养基初始pH)。经软件优化，菌株的最佳培养条件为：发酵温度31.4 ℃，培养基初始pH 4.9，发酵时间为2.47 d (图5)。

图5  双因素交互关系的响应曲面图

Figure 5  Response surface diagrams of the interactions between two factors. A: Temperature and pH; B: Temperature and time; C: Time and pH.

2.4 菌株JD-3粗酶液的酶学性质测定

菌株JD-3在最优培养条件下产生的几丁质粗酶活性随温度变化展现出不同的趋势。随着温度的升高，酶活性逐渐下降，在20 ℃时为最大值0.013 U/mL，随温度继续升高而逐渐降低，当温度超过50 ℃时，几丁质酶的活性显著下降，表明其在较低温度下具有较高的活性。结合菌株的培养条件推测几丁质酶在20 ℃内可能达到最大活性(图6A)。在温度稳定性方面，酶活性在20 ℃时最高，在30 ℃时显著下降，而在60 ℃时活性降至20 ℃时的1/7左右，表明菌株JD-3所产的几丁质酶在30 ℃以下具有较好的热稳定性，60 ℃时酶活性基本丧失(图6B)。此外，菌株JD-3产生的几丁质酶在偏酸性范围内活性相对稳定，最大值出现在pH 3.0 (图6C)。当菌株JD-3所产的几丁质酶在pH 3.0-4.0时，几丁质酶活性基本稳定，在偏碱性环境下，酶活性降低了近50% (图6D)。这表明该酶在强酸性环境中较为稳定，而在弱酸性或碱性环境下稳定性明显降低。

图6  酶学性质研究

Figure 6  Study on enzymatic properties. A: Temperature; B: Temperature stability; C: pH; D: Acid-base stability. The different lowercase letters in the picture indicate significant differences among treatments at P<0.05.

2.5 反应进程曲线及动力学参数的测定

在最适反应条件下，几丁质酶的反应进程曲线如图7A所示。在0-240 min内，酶的反应速率保持相对稳定，同时葡萄糖浓度持续上升；240-360 min内，反应速率开始下降，这可能是由于底物浓度降低，反应接近饱和状态；400 min后，反应趋于饱和，葡萄糖浓度不再变化，反应速率降至0，反应基本结束。通过底物浓度倒数与反应初始速度倒数绘制的Lineweaver-Burk曲线如图7B所示，计算得出该酶促反应的K_m=8.07 mg/mL，V_max=12.610 μg/(mL·h)，K_m值较小，表明该酶对几丁质胶体具有较强的亲和力。

图7  反应进程曲线(A)及Lineweaver-Burk曲线(B)

Figure 7  Reaction proceeding curve (A) and Lineweaver-Burk curve (B).

2.6 全基因组分析

为获取高质量的细菌全基因组序列，本研究采用三代PacBio测序结果构建框架，并用二代Illumina测序数据进行补洞和纠错。共获得370 Mb的Illumina二代测序数据和460 Mb的PacBio三代测序数据(原始数据存储在国家微生物科学数据中心，链接为https://nmdc.cn/resource/genomics/sra/detail/NMDC40066841，编号为NMDC40066841)。C. maltaromaticum JD-3菌株全基因组全长为4 195 636 bp，包含6个contig (图8A)。预测到3 864个蛋白质编码序列(coding sequency, CDS)，总长度约为3.5 Mb，平均长度为913.8 bp，占基因组序列的85%。预测到63个转运RNA基因，呈现长链或经典三叶草结构。预测到19个核糖体RNA，包括7个5S rRNA基因、6个16S rRNA基因、6个23S rRNA基因。基于rRNA基因构建的系统发育树显示，核糖体RNA在种内相对保守(图8B)。通过TRF软件对基因组进行重复序列预测，共识别出181个重复序列(表2)，其中130个位于contig 1上，总长度为16 kb，占全基因组的0.3%。

图8  菌株JD-3全基因结构注释

Figure 8  JD-3 gene structure annotation. A: Characterization and characteristics of the JD-3 genome (Orbital 1 represents the contig length, orbital 2 represents the gene density, orbital 3 represents the gene G+C content, orbital 4 represents the gene G+C offset, and orbital 5 represents the N base content in the gene); B: Phylogenetic tree based on predicted ribosomal RNA.

表2  基因组中的重复序列分布

Table 2  Distribution of repetitive sequences in the genome

Sequence index	Sequence description	Number of repetitive sequences
1	Contig 1 pilonontig 1 pilon	130
2	Contig 2 pilonontig 1 pilon	7
3	Contig 3 pilonontig 1 pilon	34
4	Contig 4 pilonontig 1 pilon	2
5	Contig 5 pilonontig 1 pilon	6
6	Contig 6 pilonontig 1 pilon	2

2.7 几丁质酶基因家族鉴定

在细菌全基因组中，鉴定出2个属于GH18家族的几丁质酶家族基因，命名为gh18和gh19。这些基因分布在contig 1的特定区域(图9A)。将几丁质酶基因序列与NCBI数据库进行比对，共发现10个保守基序(图9B)。gh18和gh19属于不同的类别，其中gh18包含10个保守基序，而gh19包含7个保守基序(图9C)。系统发育分析表明，gh18和gh19基因均与麦芽香肉食杆菌几丁质酶基因聚为一支。然而，它们在结构基序上存在较大差异，推测它们在几丁质分解的不同阶段发挥作用。

图9  几丁质酶基因家族鉴定

Figure 9  Chitinase gene family identification. A: Chromosome distribution of chitinase gene family; B: Ten motif sequences predicted by chitinase gene family; C: Phylogenetic map of conserved motifs of 3-20 chitinase gene family.

3 讨论

3.1 几丁质分解菌的分离鉴定及功能分析

几丁质分解菌的研究始于20世纪初，最初主要集中在从土壤、废弃物和水体中筛选产酶微生物^[25]。目前已确认能够分解几丁质的微生物种类繁多，广泛分布于芽孢杆菌属(Bacillus)、盐单胞菌属(Halomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、肠杆菌属(Enterobacter)，以及链霉菌属(Streptomyces)、曲霉属(Aspergillus)、白僵菌属(Beauveria)、木霉属(Trichoderma)等多个属种^[26-30]。几丁质分解菌不仅在生态系统中发挥着分解几丁质的关键作用，还影响昆虫与哺乳动物消化^[31-32]。然而，针对食虫动物，特别是两栖动物肠道微生物中几丁质分解菌的研究较少^[33]。对饰纹姬蛙16S rRNA基因和宏基因组测序显示，丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)和瘤胃菌科(Ruminococcaceae)与几丁质分解有关^[20]，对中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)皮肤和肠道微生物组成分析发现，其皮肤微生物中以柄杆菌科(Caulobacteraceae)和鞘氨醇单胞菌科(Sphingomonadaceae)为主，肠道内容物则以考克斯氏体科(Coxiellaceae)和支原体科(Mycoplasmataceae)为主，高海拔环境和动物个体特征可能会共同影响两栖动物微生物组成^[34]。本研究从青藏高原东部地区广泛分布的高原林蛙肠道内容物中获得麦芽香肉食杆菌，发现其能有效分解几丁质。肉食杆菌属作为一种广泛分布的微生物类群，通常生长在温度较低的环境中。Nicholson等^[35]从西伯利亚地区冻土中分离出的6种优势菌均为肉食杆菌属；Kosiorek等^[26]在南北极土壤及类似物质中分离出10株嗜冷肉食杆菌。杨福梅等^[36]从昆明轿子雪山自然保护区一只麂子肩部肌肉组织中分离得到1株麦芽香肉食杆菌，表明肉食杆菌能够适应低温环境。Leisner等^[37]发现，在115株来自29种乳酸菌的菌株中，只有肉食杆菌属的广布肉杆菌(C. divergens)和麦芽香肉杆菌(C. maltaromaticum)能够水解α-几丁质，进一步证实了C. maltaromaticum JD-3菌株几丁质分解能力。Li等^[38]发现麦芽香肉食杆菌通过促进肠道维生素D的产生，抑制雌性小鼠结直肠癌的发生，表明该菌在肠道菌群中具有巨大的开发潜力。以上研究为动物消化系统来源的资源微生物开发提供了新的研究视角，拓宽了我们对麦芽香肉食杆菌功能多样性的认知，揭示了高原两栖动物在低温环境下消化分解几丁质的原因，为几丁质分解菌的挖掘和应用开辟了新途径。

3.2 C.maltaromaticum JD-3产酶条件及酶学性质分析

为评估C. maltaromaticum 菌株JD-3对几丁质的分解能力，本研究对其产酶条件进行了系统的优化。单因素试验结果显示，发酵温度、时间和培养基初始pH对C. maltaromaticum JD-3几丁质酶活性的影响尤为显著。在最优条件下，C. maltaromaticum JD-3所产的几丁质酶活性为12 mU/mL，不及盐单胞菌(Halomonas)等高产几丁质酶微生物^[26]。微生物种属的遗传差异导致的几丁质酶分子结构和催化机理的差异、培养基成分的复杂性、细胞生长过程中生物量的动态积累以及环境参数的交互影响，都可能是导致酶活性差异的关键因素^[39]。然而，C. maltaromaticum JD-3在20 ℃和pH 3.0条件下展现出较强的几丁质分解能力，表明该菌株在常温、酸性环境下具有独特的产酶优势。这种产酶模式可能与其栖息地的低温和消化系统酸性环境密切相关。Dwyer等^[30]的研究证实，酸性几丁质酶在低pH条件下对未经处理的底物具有出色的分解效果，显示出了其在工业应用领域的巨大潜力。高原林蛙是变温动物，生活在青藏高原高海拔水体环境中，能够在较低温度下消化昆虫几丁质外壳。这种环境适应性赋予了C. maltaromaticum JD-3在工业应用中的潜力，尤其在食品加工过程中几丁质废弃物的处理和资源回收利用方面^[40]。C. maltaromaticum JD-3几丁质酶在室温酸性环境下的稳定性和活性，为开发新型几丁质酶制剂提供了重要参考。未来，我们将继续探索其在不同环境条件下的应用潜力，为几丁质生物分解和资源回收提供创新解决方案。

3.3 C.maltaromaticum JD-3全基因组测序及分析

Dang等^[41]从西南印度洋深海沉积物中分离出一株几丁质分解菌C6131，鉴定为海生微菌(Marinimicrobium sp.)，基因组测序发现，该菌株基因组相对较小，长度为4 207 651 bp，G+C含量为58.50%，含3 471个CDS序列；González-Gragera等^[42]从大西洋鲑(Salmo salar)肠道中分离得到一株耐冷C. maltaromaticum CM22，其基因组大小为4.08 Mb，G+C含量为33.59%，含有62个tRNA 基因、10个rRNA基因和3 797个CDS序列。相比之下，C. maltaromaticum JD-3菌株基因组全长为4 195 636 bp，G+C含量为34.41%，含有63个tRNA基因、19个rRNA基因以及3 864个CDS序列，这一差异暗示C. maltaromaticum JD-3菌株可能拥有相对复杂的基因组结构，包含更丰富的基因家族和功能多样性。C. maltaromaticum JD-3菌株G+C含量与C. maltaromaticum CM22接近，但与Marinimicrobium sp. C6131存在较大差异。这种G+C含量的差异暗示菌株在进化过程中倾向于适应不同的环境压力，体现了不同的生存策略。

几丁质酶基因家族根据氨基酸序列的相似性被划分为不同的家族，其中GH18和GH19是最重要的几丁质酶家族。GH18家族的成员通常表现出内切酶活性，能够随机切割几丁质链，而GH19家族成员通常具有外切酶活性，从几丁质链的非还原端开始切割^[43]。GH18家族通过底物结合、活性位点构象变化、催化位点结构调整以及产物移位促进几丁质的降解^[44]，在古细菌、原核生物和真核生物中广泛分布，在组织分解与重塑、营养摄取、病原入侵及免疫反应调节等多个生理过程中发挥重要作用^[45]。本研究成功预测了2个GH18几丁质酶家族成员，并发现这2个基因均位于contig 1上，通过对gh18和gh19基因序列分析，分别筛选到10个和7个保守基序，说明本次筛选得到的几丁质酶具有多样化功能，或能分解不同类型几丁质。未来可进一步对C. maltaromaticum JD-3几丁质酶家族开展筛选鉴定，并基于定向进化方法筛选出产酶能力更强的菌株。

综上所述，菌株JD-3拥有更复杂的基因组结构，可能具有更广泛的代谢能力和环境适应性。基因组的测定为C. maltaromaticum JD-3的深入研究提供了数据支持，也为两栖动物肠道微生物在几丁质分解和资源回收等领域的应用提供了理论依据。

4 结论

从高原林蛙肠道内容物中分离出一株可分解几丁质的菌株JD-3，鉴定为麦芽香肉食杆菌(C. maltaromaticum)。该菌在常温酸性环境中酶活性最高，证实其在极端环境中的适应性。全基因组测序发现C. maltaromaticum JD-3基因组结构复杂，含有2个GH18几丁质酶基因。研究结果丰富了对肉食杆菌属分解几丁质功能的认识，为阐释其分解几丁质提供了数据支撑，也为蛙源微生物资源在生物分解和资源回收领域的应用提供了理论基础。

作者贡献声明

王蕊：论文撰写和修改，数据处理和分析；林星荣：实验执行，数据收集和处理分析；王婉婷：协助实验操作，参与论文讨论；沈迎芳：实验构思和设计，参与论文讨论和修改；张湑泽：实验构思和设计，论文撰写和修改，数据处理和分析。

利益冲突

作者声明不存在任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。