甘草治疗耐甲氧西林表皮葡萄球菌感染的活性成分筛选及作用机制

摘要

目的

筛选甘草中治疗耐甲氧西林表皮葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis, MRSE)感染的活性成分，并研究其潜在的抗菌作用机制。

方法

采用半数稀释法测定甘草中药理成分对MRSE的抗菌活性；利用微生物粘着碳烃化合物法、结晶紫染色法、扫描电子显微镜和一体化细胞成像仪等技术，评估药物抵抗MRSE感染的抗菌表型；采用GC-MS进行代谢组学分析，并用试剂盒测定胞内氧化脱氢酶的活性，采用染料标记法评价细胞膜的损伤与流动性，并通过大蜡螟幼虫感染生存率试验评估体内抗菌效率。

结果

甘草中的甘草查尔酮A、甘草查尔酮C和光甘草定等成分对MRSE表现出高效抗菌活性，其中甘草查尔酮A抑制MRSE的效果最为显著，其最小抑菌浓度为6.0 μg/mL，最小杀菌浓度为12.0 μg/mL。代谢组学分析显示，甘草查尔酮A主要影响MRSE的代谢、次生代生物合成以及ABC转运等生物途径，阻碍鸟氨酸、赖氨酸和烟酸的生物合成，并确认1,3-二棕榈酸甘油酯(1,3-dipalmitin)在胞内积累。表型实验结果证实，甘草查尔酮A可导致MRSE的三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle, TCA)循环通量下调，胞内ATP水平降低；抑制生物被膜的形成和胞内蛋白质的表达，阻止MRSE细菌黏附HaCaT细胞；破坏MRSE细胞膜的结构，导致细胞塌陷变形甚至破裂，并提高了MRSE感染后大蜡螟幼虫的存活率。

结论

甘草查尔酮A的暴露改变了MRSE细胞的糖、脂质和氨基酸代谢，影响生物被膜、蛋白等次生代谢物的合成与细胞膜的结构，导致MRSE的ATP生成减少、转运蛋白功能失常以及黏附与感染能力下降等抗菌表型。

关键词

甘草; 甘草查尔酮A; 耐甲氧西林表皮葡萄球菌; 代谢组学; 代谢途径; ABC转运

豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)、光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.)的干燥根和根茎，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效，常用于治疗脾胃虚弱、倦怠乏力、心悸气短、咳嗽痰多、脘腹及四肢挛急疼痛、痈肿疮毒，还可缓解药物毒性及烈性^[1]。现代药理学研究证实，甘草的主要药理成分包括三萜类和黄酮类，以光甘草定、甘草酸和甘草次酸为主的三萜类成分，具有抗癌、抗病毒、免疫调节等药理作用^[2]；以2-苯基色原酮为母核的黄酮类成分则具有较强的抗氧化功能和抗菌抑菌作用。甘草作为一种药食同源的中药材，不仅在中医领域有着广泛的应用，还常作为食品添加剂使用，展现了其在保健和疾病预防治疗方面的多重功效。

细菌耐药已经成为威胁人类健康的全球性公共问题。据世界卫生组织报告，每年全球约有170万人死于细菌耐药，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)、多重耐药铜绿假单胞菌(multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa)、抗万古霉素屎肠球菌(vancomycin-resistant Enterococcus faecium)等耐药细菌正在全球范围内造成严重的健康问题^[3-4]。例如，住院患者和免疫力低下人群易感染的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)也在向多药耐药方向不断演化，调查显示临床分离的S. epidermidis菌株中有80%以上对青霉素、氨苄西林、头孢唑林和头孢菌素耐药^[5-6]。有效治疗多耐药耐甲氧西林表皮葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis, MRSE)感染的抗生素正不断减少，不受控制的MRSE感染正威胁着住院患者和免疫力低下人群的健康和生命。

由于临床上治疗MRSE感染越发困难，研究人员正试图发现新型抗菌药物或开发更有效的抗菌策略来应对MRSE的演化和发展。以往的研究表明，甘草在耐药菌治疗方面具有确切的疗效，如甘草的80%甲醇提取物对多种MRSA菌株(KCCM 11812、40510、40512)具有抗菌活性^[7-9]，甘草中的光甘草醇、甘草查尔酮A、甘草查尔酮C、甘草查尔酮E等异戊烯基查尔酮成分对MRSA表现出高效的杀伤作用^[10]。然而，关于甘草治疗MRSE感染的研究报道较少，其抗MRSE感染的药理学成分与作用机制尚不清楚。本研究根据甘草的有效成分对多药耐药细菌的抗菌特性，推测甘草中的戊烯基查尔酮能高效杀伤多药耐药的S. epidermidis，并通过实验加以验证。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE，RP62A/ATCC 35984)购自广东省微生物菌种保藏中心^[11]，并通过划线法进行纯化；HaCaT细胞来源于本课题组的传代培养，大蜡螟幼虫购自上海爬缘生物有限公司，长约2-3 cm，重约400-500 mg，颜色均匀，无暗点或灰色斑纹；CAMHB肉汤培养基和M-H固体培养基购自广东环凯微生物科技有限公司；甘草素、异甘草素、甘草苷和甘草查尔酮A由课题组前期分离得到并通过核磁共振确认结构；其他甘草成分购自四川省维克奇生物科技有限公司；甲氧西林、克拉霉素、头孢氨苄、庆大霉素、万古霉素为分析纯；蛋白提取试剂盒购自上海贝博生物科技有限公司；微生物分解代谢物控制蛋白(catabolite control protein A, CcpA) ELISA试剂盒购自江苏晶美生物科技有限公司；胞浆异柠檬酸脱氢酶(cytosolic isocitrate dehydrogenase, ICDHc)活性检测试剂盒、NAD-苹果酸脱氢酶(NAD-dependent malate dehydrogenase, NAD-MDH)活性检测试剂盒、柠檬酸(citric acid, CA)含量检测试剂盒、顺乌头酸酶(aconitase, ACO)活性检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；ATP检测试剂盒购自上海碧云天生物技术股份有限公司。

紫外可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限责任公司；微生物培养箱、超净工作台、超微量分光光度计、一体化细胞成像分析仪购自ThermoFisher Scientific公司；高压蒸汽灭菌锅购自上海旻泉仪器有限公司；恒温摇床购自上海贝英实业有限公司；扫描电镜购自Hitachi High-Tech Scientific Solutions公司；气相色谱质谱联用仪购自Agilent公司；多功能酶标仪购自BioTek公司。

1.2 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定

参考文献[12]方法测定最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration, MBC)来评价甘草的主要成分对MRSE的抑菌活性。将药物用4倍质量的DMSO溶解至200.0 mg/mL，以半数连续稀释法将药物分散于CAMHB培养基中，并在接下来的实验中使用0.1% DMSO作为对照。将对数生长期的MRSE用CAMHB培养基重悬后稀释，取100 µL菌悬液接种于96孔板上，并用不同浓度的药物处理，使得最终菌悬液浓度约10⁶ CFU/mL，药物浓度范围为1.0-100.0 μg/mL。在37 ℃条件下培养24 h后，无明显细菌生长的最低浓度为MIC浓度。为测定MBC，从未见细菌生长孔中取100 µL，接种于M-H琼脂板上，37 ℃孵育72 h后测定活菌数量。MBC定义为能够杀灭99.9%细菌的最低药物浓度。

1.3 药物对MRSE的抑制与杀灭作用

分别用0.5×MIC、1×MIC、2×MIC的药物浓度处理对数生长期的MRSE (1×10⁶ CFU/mL)，然后在37 ℃条件下监测24 h内OD₆₀₀值，分析药物作用下MRSE的生长。再分别用不同浓度的药物处理对数生长期的MRSE (1×10⁶ CFU/mL)，每2 h取100 μL菌液进行倍比稀释后均匀涂布在M-H琼脂板，37 ℃孵育72 h，测定活菌数，绘制药物对MRSE杀灭曲线。

1.4 代谢组学分析

代谢物的制备及GC-MS分析按照文献[13]进行。对数生长期的MRSE (OD₆₀₀值为0.2)在37 ℃下暴露于0.5×MIC的药物中4 h后，4 ℃、4 000×g离心6 min收集菌体，用预冷的PBS离心洗涤2次，将0.5×MIC组和对照组的样品加入-80 ℃的预冷甲醇中，使用超声波系统破碎细胞(50%超声强度，超声2 s、间隔3 s，共10 min)。细胞破碎后再次离心取上清液，加入内标物核糖醇后真空干燥。干燥后的样品使用MSTFA进行衍生化处理，然后12 000×g离心10 min，取上清液在24 h内通过气相色谱质谱联用仪进行检测。

在峰识别和解卷积后，使用NIST数据库(https://www.nist.gov/srd/nist-standard-reference-database-1a)和Fiehn数据库(https://fiehnlab.ucdavis.edu)鉴定代谢物。使用内标物核糖醇对质谱数据进行归一化处理，以便后续分析。基于与对照组相比的多重变化，使用Student’s t检验的P值和校正后的调整P值来选择差异代谢物，并执行主成分分析(principal component analysis, PCA)进行主成分分析。将差异代谢物映射到KEGG数据库(https://www.kegg.jp/)使用MBROLE 2.0中的富集分析模块富集代谢途径。

1.5 分析细菌的TCA循环水平

对数生长期的MRSE (OD₆₀₀值为0.2)在37 ℃下暴露于0.5×MIC的药物中4 h后，4 ℃、4 000×g离心6 min收集菌体，并用预冷的PBS离心洗涤2次。按蛋白提取试剂盒的说明书抽提给药组与对照组的细菌蛋白。使用试剂盒测定ICDHc、NAD-MDH、ACO的活性，以及CcpA、CA和ATP的含量。

1.6 生物被膜与Zeta电位分析

采用结晶紫染色法评价MRSE生物被膜的形成^[14]。将对数生长期的MRSE在CAMHB培养基中重悬至OD₆₀₀值为0.2，用0.5×MIC和1×MIC的药物在37 ℃孵育12 h。孵育结束后丢弃上清，用PBS冲洗孔板3次以去除浮细胞，然后将孔板置于50 ℃烤箱中1 h。加入200 μL 1%结晶紫溶液对剩余生物被膜染色20 min后，去除多余结晶紫溶液。冲洗并干燥后，用30%醋酸溶液提取结晶紫20 min，测定OD₅₇₀值。此外，采用BCA蛋白测定法评价MRSE蛋白质的生物合成^[15]，将对数生长期的MRSE在CAMHB培养基中重悬至OD₆₀₀值为0.2，在0.5×MIC和1×MIC的药物中37 ℃孵育4 h。4 ℃、4 000×g离心6 min收集菌体，用预冷的PBS再次离心洗涤2次后，加入溶菌酶至终浓度为10 μg/mL，37 ℃孵育45 min。冰浴超声破碎后，以8 000×g离心5 min，取上清用BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度。

1.7 HaCaT细胞模型评价细菌黏附力

1.7.1 药物处理MRSE与荧光标记

参考文献[16]方法，评估药物对MRSE黏附感染宿主细胞的影响。将对数生长期的MRSE在CAMHB培养基中重悬至OD₆₀₀值为0.2，用0.5×MIC和1×MIC的药物在37 ℃孵育4 h。4 ℃、4 000×g离心6 min收集菌体后用无菌PBS重悬，定量至1.0 mL (OD₆₀₀值为1.0)，加入CFDA-SE染色储存液至终浓度为2 μmol/L，混匀后置于37 ℃孵育30 min。用预冷的1% FBS/HBSS液体洗涤3次后，定量至1 mL备用。

1.7.2 MRSE黏附HaCaT细胞

在预定时间内，将HaCaT细胞以每孔5×10⁵个细胞的比例接种于12孔板中，在含10% FBS的DMEM双抗培养基中，37 ℃、5% CO₂下培养24 h直至细胞融合。在接种细菌前再让细胞成熟24 h。用1% FBS/HBSS液体洗涤HaCaT细胞2次后，按MOI为100:1的比例加入CFDA-SE染色的MRSE菌，37 ℃孵育2 h。孵育完成后，用1% FBS/HBSS溶液轻轻冲涤3次，并在1% FBS/HBSS液体中保存。选用适用于CFDA-SE染料的绿色荧光通道，在2 h内使用一体化细胞成像仪拍照观察MRSE黏附HaCaT细胞的情况。

1.8 测定药物作用下细菌的DNA、RNA泄漏

收集对数生长期的MRSE在HBSS中重悬至OD₆₀₀值为0.2，用0.5×MIC和1×MIC的药物在37 ℃处理4 h。随后，通过0.22 μm微孔过滤器过滤获得上清液，并使用超微量分光光度计进行分析，以测定DNA和RNA的释放情况。

1.9 测定甘草查尔酮A损伤MRSE细胞膜的程度

将对数生长期的MRSE用CAMHB培养基重悬至OD₆₀₀值为0.2，用0.5×MIC、1×MIC和2×MIC的甘草查尔酮A处理4 h。处理结束后，用PBS洗涤细胞3次，重悬至OD₆₀₀值为1.0，避光加入碘化丙锭(propidium iodide, PI)至终浓度为2 μmol/L，37 ℃避光孵育30 min，用PBS洗涤细胞3次后重悬。采用流式细胞术进行检测：使用未染色细菌作为阴性对照，选用FITC通道检测荧光信号。首先检测阴性对照样本，调节电压使细胞群体位于阴性区；再检测PI染色后的细菌样本，用中位荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI)进行定量，每个样本采集至少20 000个微粒信号。使用FlowJo软件绘制荧光直方图和散点图，确认染色后的细菌由于细胞膜受损而产生强烈荧光，并比较不同实验条件下的MFI值，以定量评估细菌细胞膜受损程度。

1.10 测定甘草查尔酮A对MRSE细胞膜流动性的影响

将对数生长期的MRSE用PBS重悬，加入laurdan染料至终浓度为2 μmol/L，37 ℃孵育10 min。用PBS洗涤菌体2次后重悬至OD₆₀₀值为0.5，再用0.5×MIC、1×MIC和2×MIC的甘草查尔酮A处理35 min，阳性对照组选用苯甲醇。在激发波长350 nm，发射波长440 nm和490 nm的条件下，使用酶标仪测量各组的荧光值。根据公式(1)计算两极分化(generalized polarization, GP)^[17]评价细胞膜的流动性。

GP=(I440-I490)/(I440+I490)

(1)

1.11 扫描电镜分析

按照文献[15]方法，通过扫描电镜观察药物对MRSE形态的影响，将对数生长期的MRSE在CAMHB培养基中重悬至OD₆₀₀值为0.2，用0.5×MIC和1×MIC的药物在37 ℃孵育4 h。4 ℃、4 000×g离心6 min收集菌体后，用无菌PBS洗涤3次，用2.5%戊二醛在4 ℃下固定过夜。随后，样品分别用浓度逐渐增加的乙醇(50%、70%、90%和100%)脱水15 min。脱水后的样品冷冻干燥2 h。最后，用金溅射形成薄层，并用扫描电镜进行观察。

1.12 大蜡螟攻毒保护试验

选用全身乳白色、无明显黑斑且表现出较强活力的大蜡螟幼虫，确保幼虫的大小和体重相近。将40只大蜡螟幼虫随机分为4组：空白组(仅注射无菌PBS溶液)、对照组(不注射任何药物)、万古霉素给药组(注射5.0 mg/kg的万古霉素)、甘草查尔酮A给药组(注射5.0 mg/kg的甘草查尔酮A，n=10)。观察并记录幼虫是否因注射器注射液体而导致死亡。将对数生长期的MRSE用无菌PBS稀释至2.0×10⁷ CFU/mL，然后使用微量注射器在幼虫右腹足注射10 μL MRSE菌液，将幼虫置于一次性培养皿中，在37 ℃培养箱中静置2 h后取出，再由左腹足注射相应的药物溶液。继续在37 ℃培养箱中静置培养72 h，期间每12 h记录1次幼虫的存活情况^[17]。

1.13 统计分析

所有实验至少重复3次，结果以均数(mean)±标准差(SD)表示。采用单因素方差分析(one-way analysis of variance, ANOVA)和Duncan多重极差检验进行统计分析。当P值小于0.05时，认为差异有统计学意义。用星号表示组间差异有统计学意义(*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.000 1)，NS表示P≥0.05。

2 结果与分析

2.1 体外筛选甘草中抗MRSE的活性成分

鉴于甘草的主要药理成分为三萜类和黄酮类化合物，本研究选用甘草酸、甘草次酸等三萜类化合物，甘草素、甘草苷、光甘草定、甘草酮C等异黄酮类化合物，以及异甘草素、异甘草苷、刺甘草查尔酮、甘草查尔酮A、甘草查尔酮C、甘草查尔酮D等查尔酮类化合物为研究对象(图1)，通过半数连续稀释法测定化合物抑制MRSE的MIC，并采用倍比稀释M-H琼脂平板涂布法测定MBC，结果见表1。盐酸克林霉素对细菌的MIC>200.0 µg/mL，硫酸庆大霉素对细菌的MIC>200.0 µg/mL，头孢氨苄对细菌的MIC为62.0 µg/mL，万古霉素对细菌的MIC为1.5 µg/mL，MBC为3.0 µg/mL。受试MRSE菌株(RP62A/ATCC 35984)对大环内酯类、氨基糖苷类、β-内酰胺类抗生素耐药，但对糖肽类抗生素万古霉素敏感。化合物甘草素、甘草苷、光甘草定、甘草酸、甘草次酸、异甘草素、异甘草苷、刺甘草查尔酮等对细菌的MIC>200.0 µg/mL，甘草酮C对细菌的MIC为15.0 µg/mL，甘草查尔耳酮A对细菌的MIC为6.0 µg/mL，MBC为12.0 µg/mL，甘草查尔耳酮C对细菌的MIC为12.5 µg/mL，MBC为37.5 µg/mL，甘草查尔耳酮D对细菌的MIC为50.0 µg/mL。研究结果表明，甘草中的甘草查尔耳酮A对MRSE的抑制活性最强，其次是甘草查尔耳酮C和光甘草定。基于甘草素与异甘草素的分子骨架进行结构-活性分析，发现增加异戊烯基是提升抗MRSE活性的关键；基于黄酮的分子骨架进行结构-活性分析，甘草中查尔酮结构的化合物对MRSE的抑制活性最佳。本研究选用甘草查尔耳酮A进行后续研究。

图1  甘草的主要成分(1-12)的化学结构

Figure 1  Chemical structures of the main components (1-12) of Glycyrrhiza uralensis Fisch.

表1  化合物对MRSE的抑制作用

Table 1  The inhibitory effect of compounds on MRSE

Compounds	MIC (μg/mL)	MBC (μg/mL)
(1) Liquiritigenin	>200.0	-
(2) Licoflavone C	15.0	30.0
(3) Liquiritin	>200.0	-
(4) Isoliquiritoside	>200.0	-
(5) Isoliquiritigenin	>200.0	-
(6) Licochalcone A	6.0	12.0
(7) Licochalcone C	12.5	37.5
(8) Licochalcone D	50.0	-
(9) Echinatin	>200.0	-
(10) Glabridin	11.0	30.0
(11) Glycyrrhetinic acid	>200.0	-
(12) Glycyrrhizic acid	>200.0	-
Methicillin	>200.0
Clarithromycin	>200.0	-
Cefalexin	62.0	-
Gentamicin	>200.0	-
Vancomycin	1.5	3.0

2.2 甘草查尔酮A对MRSE的杀伤或杀灭作用

为了准确评估甘草查尔酮A对MRSE增殖的抑制作用及其杀伤能力，将浓度约为10⁶ CFU/mL的MRSE分别暴露于0.5×MIC、1×MIC、2×MIC的甘草查尔酮A中，并在37 ℃孵育，每2 h测定1次OD₆₀₀值与活细胞数量，结果见图2。细菌生长曲线显示，对照组细菌在2 h后进入对数生长期，表明0.1% DMSO不影响MRSE的生长繁殖。在0.5×MIC的甘草查尔酮A作用下，细菌在6 h后开始加速增殖；在1×MIC的甘草查尔酮A作用下，孵育20 h后细菌才出现增殖趋势；而在2×MIC的甘草查尔酮A作用下，24 h内未观察到细菌生长，表明甘草查尔酮A对MRSE的增殖抑制作用呈剂量依赖性。时间杀伤曲线显示，对照组中初始浓度约10⁶ CFU/mL的MRSE活细胞数量持续增长，当MRSE暴露于0.5×MIC、1×MIC、2×MIC的甘草查尔酮A中时，前4 h内均表现出明显的杀伤或杀灭现象。给药4 h后，在0.5×MIC组的活细胞数量开始上升；在1×MIC组的活细胞数量保持相对稳定；在2×MIC组的活细胞数量则持续减少，进一步证实甘草查尔酮A对MRSE的杀伤作用呈剂量依赖性。

图2  甘草查尔酮A作用下MRSE的生长曲线与时间杀伤曲线。A：不同浓度甘草查尔酮A作用下MRSE细胞在96孔微滴板上的生长曲线；B：不同浓度甘草查尔酮A作用下MRSE细胞的存活数量。

Figure 2  The growth curves and time-killing curves of MRSE in response to licochalcone A. A: The growth curves of MRSE cells in a 96-well microplate treated with various concentrations of licochalcone A; B: The survival count of MRSE cells subjected to different concentrations of licochalcone A.

2.3 甘草查尔酮A影响MRSE的代谢轮廓

根据甘草查尔酮A杀伤MRSE的浓度与时间因素，选用0.5×MIC的甘草查尔酮A处理MRSE，收集菌体并提取代谢物，通过GC-MS进行分析。对照组与0.5×MIC组代谢物的离子流图见图3A，通过分析各鉴定代谢物的峰面积和P值的倍数变化，筛选选出81种差异代谢物。给药组相对于对照组的代谢物偏移图见图3B，代谢物含量差异越大，数值越远离0点。为了鉴定推定的代谢生物标志物，对81种代谢物进行主成分分析，PCA结果显示R²X=0.907，Q²=0.729，对照组和0.5×MIC组之间存在明显分离(图3C)，表明模型具有良好的可预测性。图3D为MRSE差异代谢物的火山图。通过设定|log₂ fold change|>1且P<0.05作为筛选标准，共识别出19个显著差异代谢物，其中12个代谢物在实验组中显著上调，7个代谢物显著下调。

图3  甘草查尔酮A作用下MRSE代谢谱的显著改变。A：对照组与0.5×MIC给药组的离子流图；B：0.5×MIC给药组相对于对照组差异代谢物变化；C：对照组与0.5×MIC给药组的主成分分析(PCA)；D：差异代谢物的火山图。

Figure 3  Significant changes in the MRSE metabolic profile under the influence of licochalcone A. A: Ionic chromatogram of the control group compared to the 0.5×MIC group; B: Alterations in differential metabolites of the 0.5×MIC group relative to the control group; C: Principal component analysis (PCA) of the control and 0.5×MIC group; D: Volcano plot of differential metabolites. UP: Upregulation; DP: Downregulation; NS: No significant change.

2.4 甘草查尔酮A主要影响MRSE的TCA循环、生物合成和ABC转运

为了进一步了解显著性差异代谢物的生物学功能，进行了KEGG通路富集分析，结果如图4B所示。在代谢组学中鉴定的差异代谢物被映射到代谢途径的概述(KEGG数据库中编号：01100)。甘草查尔酮A主要影响MRSE的代谢途径(如三羧酸循环、赖氨酸降解、半乳糖代谢)、次生代生物合成(如鸟氨酸、赖氨酸、烟酸、氨基酰基tRNA)以及ABC转运。在参与富集途径的差异代谢物中L-异亮氨酸、D-甘露糖、鸟氨酸、乳糖、L-赖氨酸、丙氨酰甘氨酸、琥珀酸、1,3-双棕榈酸甘油酯是代谢途径的关键中间体(图4A)，每个差异代谢物至少参与9个代谢途径中的3个。

图4  甘草查尔酮A主要影响MRSE的代谢、生物合成与ABC转运。A：对照组和0.5×MIC组中关键代谢物的峰面积(通过GC-MS代谢组学方法对代谢物峰面积进行定量)；B：显著性差异代谢物的KEGG通路分析。

Figure 4  Licochalcone A primarily influences the metabolism, biosynthesis, and ABC transport of MRSE. A: The peak areas of key metabolites in the control group and the 0.5×MIC group were quantified using a GC-MS-based metabolomics method to assess the peak areas of metabolites (*: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001); B: KEGG pathway analysis for significantly different metabolites are presented.

在好氧菌的代谢途径中，三羧酸循环(TCA)在细菌细胞代谢中占据核心地位，不仅支持细胞的能量需求，还参与多种次生代谢过程以及调控能量代谢和中间代谢产物的供应^[18]。TCA循环为合成各种重要生物分子提供前体物质，包括黏附蛋白的合成和分泌，这些蛋白是细菌黏附宿主细胞表面或生物材料表面的关键因素^[19]。此外，TCA循环和ABC转运蛋白在细胞代谢和物质转运中相互协作，TCA循环提供能量和代谢中间体，而ABC转运蛋白则通过转运这些代谢物和维持细胞的能量供应来支持细胞的整体功能^[20]。根据甘草查尔酮A影响MRSE的代谢轮廓与主要的生物途径，推测甘草查尔酮A可能通过影响MRSE的TCA循环通量，进而影响生物被膜和黏附蛋白等次生代生物合成，并改变细胞膜的物质结构以影响ABC转运，从而杀伤或杀灭MRSE。

2.5 甘草查尔酮A处理影响MRSE的TCA循环通量，减少ATP生成

TCA循环在细菌的代谢、能量生产、环境适应以及致病性方面扮演了多重关键角色。它不仅支持细菌的基本生理功能，还影响其生存和致病能力。通过调控TCA循环，细菌能够有效适应不同的生长环境，提高其生存能力和适应性^[21]。为了更好地了解甘草查尔酮A对MRSE代谢的影响，分析了代谢物的积累以及参与TCA循环的关键酶的活性(图5)。从代谢轮廓分析中发现，甘草查尔酮A处理降低了富马酸、琥珀酸等中间产物的水平，但细胞内柠檬酸(citrate, CA)持续积累(图5D)，提示甘草查尔酮A处理减少了细菌的TCA循环通量。为了进一步研究甘草查尔酮A对细菌TCA循环的影响，测定了NAD-MDH、ACO、ICDHs的活性，以及胞内ATP水平。结果显示，暴露于甘草查尔酮A中的MRSE，胞内ICDHs活性无显著差异，但NAD-MDH活性下降约71.5%，ACO活性下降约77.2% (图5A-5C)，ATP水平下降85.9%。胞内ACO催化活性下调与柠檬酸的积累有直接关系，NAD-MDH和ICDHs活性的变化与柠檬酸的积累间接关联(图5D、5E)，这些结果进一步证实甘草查尔酮A处理减少了细菌的TCA循环通量，导致ATP生成显著下降。

图5  甘草查尔酮A影响MRSE的TCA循环与ATP生成。A-C：对照组和0.5×MIC组TCA循环中NAD-MDH、ACO、ICDHs酶的活性；D、E：对照组和0.5×MIC组胞内柠檬酸(CA)、ATP的含量；F：对照组和0.5×MIC组胞内代谢调控蛋白CcpA的含量。

Figure 5  Licochalcone A influences the TCA cycle and ATP production in MRSE. A-C: The activities of the enzymes NAD-MDH, ACO, and ICDHs in the TCA cycle for both the control group and the 0.5×MIC group; D, E: The levels of intracellular citrate (CA) and ATP in the control group compared to the 0.5×MIC group; F: The concentration of the intracellular metabolic regulatory protein CcpA in both the control and 0.5×MIC groups (**: P<0.01; ***: P<0.001; ****: P<0.000 1).

分解代谢控制蛋白A (catabolite control protein A, CcpA)通过碳代谢物抑制调控TCA循环的活性，使细菌能够根据环境中的碳源可用性动态调整其代谢途径。在高葡萄糖条件下，CcpA抑制TCA循环，使细菌依赖糖酵解和发酵途径生产能量；而在葡萄糖缺乏的情况下，CcpA的抑制作用减弱，允许TCA循环恢复，从而利用其他碳源维持代谢平衡^[22]。此外，CcpA通过调节代谢途径、促进生物被膜形成、改变药物靶点以及调节药物代谢等方式，发展对抗菌药物的耐受性。研究发现甘草查尔酮A处理使MRSE中CcpA的表达相对于对照组上调至3.5倍(图5F)。结合TCA循环通量下调的结果，认为MRSE可能通过调整TCA循环来增强甘草查尔酮A的耐受性。

2.6 甘草查尔酮A抑制细菌的生物合成阻止MRSE黏附细胞

细菌的黏附能力是指其附着在宿主细胞或环境表面的能力，这一过程对细菌的生存和致病至关重要。细菌的黏附能力主要依赖于特定的生物合成途径，包括合成多种黏附蛋白(如纤毛、黏附素、黏附胶)直接参与细菌的黏附过程，产生胞外多糖形成生物被膜以增强其黏附能力，以及生产黏附因子与宿主细胞表面受体结合，启动感染过程。为了评估药物对细菌生物合成与黏附能力的影响，测定了暴露于甘草查尔酮A中的MRSE的生物被膜形成与胞内蛋白质含量，并构建了2D HaCaT细胞感染模型以分析细菌的黏附能力，结果见图6。在结晶紫染色法测定生物被膜形成时，OD₅₇₀值作为细菌生物被膜形成的指标，在0.5×MIC的甘草查尔酮A作用下，生物被膜的形成减少了约51.3%；而在1×MIC的甘草查尔酮A作用下，生物被膜的形成减少了约75.1%，这表明甘草查尔酮A显著降低了MRSE的生物被膜形成能力，且呈剂量依赖性(图6A)。通过BCA蛋白试剂盒测定MRSE胞内蛋白含量发现，在0.5×MIC的甘草查尔酮A作用下，蛋白质合成减少了约25.8%，在1×MIC的甘草查尔酮A作用下，蛋白质合成减少了约42.1%，这表明甘草查尔酮A显著抑制了MRSE的蛋白质合成，且呈剂量依赖性(图6B)。在2D HaCaT细胞感染模型中，绿色荧光代表CFDA-SE标记的MRSE细胞(绿色荧光越强表示MRSE黏附越多，反之则越少)。结果显示，在0.5×MIC和1×MIC的甘草查尔酮A处理后，MRSE黏附HaCaT细胞的能力显著性降低，且呈剂量依赖性(图6C)。研究结果表明，甘草查尔酮A通过抑制细菌的生物合成，有效地阻止了MRSE黏附宿主细胞。

图6  甘草查尔酮A影响MRSE的黏附。A、B：对照组、0.5×MIC组、1×MIC组的生物被膜生成(A)与胞内蛋白含量(B)的变化；C：对照组、0.5×MIC组、1×MIC组的MRSE黏附HaCaT细胞的荧光显微镜图，绿色表示荧光标记的MRSE。

Figure 6  The impact of licochalcone A on the adhesion of MRSE. A, B: Biofilm formation (A) and intracellular protein content (B) in the control group, 0.5×MIC group, and 1×MIC group (***: P<0.001; ****: P<0.000 1); C: Fluorescence microscopy images of MRSE adhesion to HaCaT cells in the control group, 0.5×MIC group, and 1×MIC group, with green indicating fluorescence-labeled MRSE.

2.7 甘草查尔酮A影响细菌细胞膜的结构来扰乱ABC转运

ABC转运体(ATP-binding cassette transporters)是一类嵌入细胞膜磷脂双层中的跨膜蛋白家族，它们利用膜内的ATP来驱动物质转运，包括从环境中摄取营养物质以维持生长繁殖，以及将抗菌物质和其他有害物质从细胞内排除以增强耐受性。ABC转运体的功能直接依赖于膜的结构和环境，胞内ATP的减少会直接影响转运体的运作能力；细胞膜破损可能导致细胞内的物质泄漏，使ABC转运体无法有效地控制细胞内外物质的平衡；细胞膜破损还可能导致转运体无法正确嵌入或维持其功能。细菌细胞膜结构的完整性与通透性，以及胞内ATP水平均涉及ABC转运体的功能以及细胞的整体健康。然而，在细胞膜损伤评估中，细胞膜疏水性与细胞质渗漏是可量化的指标^[23]。评估细菌细胞膜损伤情况发现，经甘草查尔酮A处理的MRSE培养上清液中DNA与RNA含量显著高于对照组(图7A)，而细胞膜疏水率上升(图7B)，且均呈剂量依赖性。研究表明甘草查尔酮A损伤了MRSE的细胞膜，导致细胞膜的结构改变与渗透性增强。

图7  甘草查尔酮A影响细菌细胞膜的结构。A：甘草查尔酮A影响MRSE的DNA与RNA泄漏；B：甘草查尔酮A影响MRSE细胞外膜疏水性改变；C：PI标记甘草查尔酮A损伤MRSE细胞膜；D：甘草查尔酮A影响MRSE细胞膜的流动性；E：甘草查尔酮A影响MRSE细胞的形态。

Figure 7  The effect of licochalcone A on the structure of bacterial cell membranes. A: Licochalcone A affects the leakage of DNA and RNA in MRSE; B: Licochalcone A influences the hydrophobicity of the MRSE cell outer membrane; C: PI labeling of licochalcone A damages the MRSE cell membrane; D: Licochalcone A affects the fluidity of the MRSE cell membrane; E: Licochalcone A impacts the morphology of MRSE cells. **: P<0.01; ***: P<0.001; ****: P<0.000 1.

为了评估暴露于甘草查尔酮A中的MRSE细胞膜的损伤情况，通过PI荧光染料染色试验，进一步评估甘草查尔酮A对MRSE细胞膜完整性的影响。经甘草查尔酮A处理后，流式直方图中的荧光强度显著上升。与对照组相比，经0.5×MIC甘草查尔酮A处理后，PI值显著升高约4倍；经1×MIC甘草查尔酮A处理后，PI值显著升高约10倍(图7C)。结果表明，甘草查尔酮A破坏了MRSE细胞膜的完整性。使用laurdan染料考察甘草查尔酮A对MRSE细胞膜流动性的影响。结果见图7D，与对照组相比，甘草查尔酮A处理菌体0.5 h后，laurdan GP值显著降低，并具有浓度依赖性。结果表明，草查尔酮A可以增强MRSE细胞膜的流动性。通过SEM拍照观察甘草查尔酮A处理后MRSE细胞的超微结构变化(图7E)。对照组MRSE细胞表面完整，胞质丰富且无明显塌陷。然而，甘草查尔酮A处理对MRSE细胞外膜造成了不可逆转的结构性损伤。用0.5×MIC的甘草查尔酮A处理后，部分细菌表面出现波纹和皱缩；暴露于1×MIC的甘草查尔酮A中的细菌，细胞表现出严重的表面塌陷和形态破坏，甚至破碎成碎片。相比之下，暴露于甘草查尔酮A中的MRSE细胞清晰显示出细胞膜损伤，并呈剂量依赖性。研究结果表明，甘草查尔酮A作用于MRSE的细胞膜，杀伤或杀灭细菌。

2.8 甘草查尔酮A降低MRSE对大蜡螟幼虫的杀伤作用

为了评估甘草查尔酮A抑制宿主生物中的MRSE的能力，使用大蜡螟幼虫动物模型，测定了感染MRSE的大蜡螟幼虫的生存率(图8)。在注射MRSE菌液后72 h，攻毒对照组大蜡螟的生存率为10%，而仅注射PBS的空白组在72 h内全部存活，据此判断大蜡螟幼虫攻毒模型建立成功。万古霉素给药组在72 h后的存活率达到90%，而甘草查尔酮A给药组的存活率达到80%。与攻毒对照组相比，甘草查尔酮A治疗组的大蜡螟存活率显著提高，且接近万古霉素的治疗效果，表明甘草查尔酮A对MRSE感染具有一定的体内治疗效果。

图8  甘草查尔酮A对MRSE感染的大蜡螟幼虫生存情况的影响

Figure 8  The effect of licochalcone A on the survival of Galleria mellonella larvae infected with MRSE.

3 讨论与结论

本研究筛选了甘草中黄酮类成分抗MRSE的活性，发现甘草查尔酮A、甘草查尔酮C和光甘草定对MRSE具有良好的抗菌活性，其中甘草查尔酮A的体外抗菌效果最为突出。本研究还描述了在亚致死浓度下甘草查尔酮A对MRSE的抗菌表型和代谢轮廓，以阐明其抗菌机制。代谢组学分析显示，甘草查尔酮A主要影响MRSE的物质代谢、次生代生物合成和ABC转运，这表明甘草查尔酮A可能通过影响细菌的TCA循环通量，进而影响生物被膜与毒力因子等次生代生物合成，同时导致细胞膜损伤，使ABC转运效率降低。抗菌表型研究证实了这一点，甘草查尔酮A损伤MRSE细胞膜导致胞内物质渗漏，生物被膜与蛋白质生物合成减少使细菌黏附HaCaT细胞的能力降低，CA积累与CcpA激活为特征的TCA循环被抑制，最终呈现出细胞膜损伤与流动性增强、ATP减少、转运蛋白功能失常以及黏附能力下降的抗菌表型。大蜡螟幼虫体内细菌感染实验结果表明，甘草查尔酮A能够显著提高其治疗存活率，并对MRSE表现出显著的抑制效果，显示出作为新型抑菌剂的潜力。

比较甘草查尔酮A与已知靶向细菌细胞膜的抗生素的化学结构，发现甘草查尔酮A缺乏一些关键的结构基序，如万古霉素的糖肽骨架、达比霉素的脂肽骨架以及碳青霉烯类的β-内酰胺环，因此推测甘草查尔酮A直接靶向细胞膜的可能性较小。然而，越来越多的证据表明，异戊烯基黄酮类化合物能够通过影响细菌的生物代谢途径来造成细胞膜损伤，如金黄色葡萄球菌暴露于异戊烯基查尔酮甘草查尔酮C、黄腐酚或补骨脂乙素时，会出现细胞质膜分离和细胞包膜破坏^[24]；金黄色葡萄球菌暴露于异戊烯基黄酮光甘草醇、α-倒捻子素和桑辛素时，会介导膜渗透和质子动力耗散^[25]；疥癣链霉菌(Streptomyces scabies)暴露于槐黄烷酮G时，菌丝体会出现扁平和收缩，细胞膜穿孔和撕裂，内容物从分枝菌丝中喷出^[26]。考虑到细胞膜的物质构成涉及糖、脂质和氨基酸的代谢，我们认为改变细胞代谢可能是甘草查尔酮A的潜在抗菌机制。暴露于甘草查尔酮A中的MRSE出现ATP减少、转运蛋白功能失常以及黏附能力下降的抗菌表型，代谢组学分析确认鸟氨酸、异亮氨酸和赖氨酸代谢中断，脂肪酸甘油酯在胞内积累，重塑细胞膜结构的物质代谢与生物合成受阻，从而影响细胞膜的完整性来杀伤细菌。

作者贡献声明

王建超：方案设计、数据处理与分析、数据管理、数据可视化、文稿写作及编辑；洪紫嫣：方案设计、数据管理、实验操作；伍子琦：方案设计、数据管理、实验操作、文稿审查；黄宏辉：方案设计、数据管理、实验操作、文稿审查；杨得坡：方案设计、项目管理、监督指导、文稿审查及编辑；徐新军：数据处理、文稿审查；彭华勇：方案设计、项目管理、监督指导、文稿审查及编辑。

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