摘要
目的
研发一种安全、有效且可鉴别的新型疫苗。
方法
以S2作为亲本株,利用同源重组技术构建S2Δbp26基因缺失株,并对缺失菌株的稳定性、安全性和有效性进行全面评价。
结果
构建了S2Δbp26缺失株,该缺失株在体外连续传代20代后其表型和基因型均未发生改变。小鼠和豚鼠的安全性试验结果表明,缺失株在生物安全性方面与S2疫苗株无显著差异。不同代次的S2Δbp26缺失株和S2亲本株接种豚鼠后,每克脾脏分菌数量均小于2×1
结论
本研究构建的S2Δbp26基因缺失株展现出优异的安全性和免疫保护力,为布鲁氏菌病可鉴别诊断疫苗的研发提供了技术储备。
布鲁氏菌病(brucellosis)是由胞内寄生的布鲁氏菌(Brucella spp.)感染引起的一种具有严重危害的人畜共患传染
疫苗免疫是防控家畜布鲁氏菌病的有效措施之一,全球已有多个国家通过疫苗免疫实现了该病的有效控制。目前我国已批准使用的布鲁氏菌病疫苗共有7种,包括S2株、M5/M5-90株、M5-90Δ26株、A19株、A19ΔVirB12株、Rev.1株和BA0711株。这些均为弱毒活疫苗,对人体具有一定的感染性。S2株是中国兽医药品监察所专家于1952年从进口母猪流产胎儿中分离出的一株猪种布鲁氏菌,经过7年的人工致弱处
BP26蛋白是一个可分泌的周质蛋白,生物信息学建模分析表明,其三级结构呈现为通道状组件,由16个BP26分子构成,其中8个分子连接成环形成八聚体,而2个八聚体相互作用使环中心形成一个大的内腔通道。此结构与参与感染的噬菌体蛋白具有相似性,预示着BP26蛋白可能参与布鲁氏菌的感染过
1 材料与方法
1.1 材料
B. suis S2菌株、粗糙型布鲁氏菌RM6/66株、羊种布鲁氏菌B. melitensis M28株均由国家兽医微生物菌(毒)种保藏中心鉴定保存;同源重组质粒pEX18AP (蔗糖诱导的自杀质粒)由本实验室保存;大肠埃希氏菌DH5α和BL21(DE3)感受态细胞均购自北京索莱宝科技有限公司;小鼠布鲁氏菌病抗体阴性血清、布鲁氏菌病抗体阳性血清、BP26蛋白多抗阳性血清均由本实验室保存;限制性内切酶Kpn I和BamH I均购自NEB公司;胰蛋白胨大豆琼脂培养基(tryptone soy agar, TSA)和胰蛋白胨大豆肉汤培养基(tryptone soy broth, TSB)均购自BD公司;质粒小量提取试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自Omega公司;细菌基因组提取试剂盒购自西安天隆科技有限公司。6-8周龄的雌性BALB/c小鼠及350-400 g雌性豚鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
1.2 引物设计与合成
布鲁氏菌S2染色体I基因组在NCBI网站的序列号为CP006962,其上包含bp26基因(BSS2_I1433)。根据基因序列设计上、下游同源臂引物(D-S2-Bp26F-F/R和D-S2-Bp26R-F/R)、鉴定筛选引物(YZ1-Bp26-F/R)以及bp26基因载体鉴定引物(18Ap-F/R),所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列见
Primers name | Primer sequences (5′→3′) | Restriction sites | Lenth of products |
---|---|---|---|
D-S2-Bp26F-F | GGGGTACCTCAACGAGGCAGATTATGG | Kpn I | 523 |
D-S2-Bp26F-R | AAGCGGGTTATGTCAGG | - | |
D-S2-Bp26R-F | AACCCGCTTGCCCTTTGCCACCTGAT | - | 506 |
D-S2-Bp26R-R | CCGGATCCGCTCAAATCGTTCGTCGTT | BamH I | |
YZ1-Bp26-F | GCAGCCTCATTTTCCACAA | - | 441 |
YZ1-Bp26-R | ACCGCCCTGATTAACACC | - | |
18Ap-F | CTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC | - | 1 193 |
18Ap-R | TATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGA | - |
1.3 同源重组质粒pEX18AP-bp26-DFR的构建
取保存的冻干B. suis S2菌株溶解后,于TSA平板上划线,37 ℃培养48 h后挑取复苏的单菌落,接种于15 mL TSB培养基培养至对数期。使用细菌基因组提取试剂盒提取S2基因组。以该基因组为模板,分别使用引物D-S2-Bp26F-F/R和D-S2-Bp26R-F/R,通过PCR扩增bp26基因的上、下游片段。PCR反应体系(50 µL):2×PrimeSTAR Max Premix 25 µL,上、下游引物(10 µmol/L)各1 µL,S2 DNA模板1 µL,ddH2O 22 µL。PCR反应条件:95 ℃预变性5 min;98 ℃变性10 s,60 ℃退火5 s,72 ℃延伸5 s,30个循环;72 ℃终延伸10 min。切取目的产物大小位置的琼脂糖电泳凝胶后,按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书对扩增产物进行纯化回收。以胶回收纯化后的DNA产物为模板,通过PCR扩增将上、下游同源臂进行融合。PCR反应体系(50 µL):2×Premix Ta
将pEX18AP质粒和bp26基因的上、下游融合片段在37 ℃用Kpn I和BamH I内切酶双酶切4 h。胶回收纯化质粒和片段的酶切产物,在16 ℃用连接酶连接2 h后,转入DH5α感受态细胞中。提取质粒,得到同源重组质粒pEX18AP-p26-DFR。
1.4 布鲁氏菌S2Δbp26缺失株的构建与筛选
取10 μL同源重组质粒pEX18AP-bp26-DFR,加入90 μL制备的布鲁氏菌S2株感受态细胞中混匀,以2 200 V、200 Ω的条件进行电转。电转后迅速向电击杯中加入1 mL无抗TSB,轻柔吹打混匀后将所有液体移入无菌EP管中,于37 ℃、180 r/min复壮培养12 h。将复壮的菌液在常温下以8 000 r/min离心8 min后重悬菌体,在含氨苄青霉素的TSA培养基上37 ℃培养48 h,进行第1次单交换筛选。同时,在含氨苄青霉素的TSA培养基和5%蔗糖的无抗性TSA培养基上随机选择长出的单菌落进行37 ℃双划线培养48 h。挑取仅在含氨苄青霉素的TSA培养基上生长的单菌落,在TSB培养基中培养24 h。以相同方式离心重悬菌体并进行1 000倍稀释,将稀释液在含5%蔗糖的TSA培养基上37 ℃培养24 h,挑取单菌落后同样进行双划线培养。再次挑取仅在含5%蔗糖的TSA培养基上生长的单菌落使用YZ1-Bp26-F/R引物进行PCR扩增鉴定。PCR反应体系(25 µL):2×Premix Taq™ 12.5 µL,上、下游引物(10 µmol/L)各1 µL,灭活菌液模板1 µL,ddH2O 9.5 µL。PCR反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30个循环;72 ℃终延伸10 min。将鉴定阳性的菌株命名为S2Δbp26,并连续培养至第20代,每隔5代以相同体系及步骤进行PCR验证,并将各代次菌株均于-80 ℃保存。
1.5 生长曲线测定及表型鉴定结果
取S2和S2Δbp26缺失株分别接种于无抗性TSB培养液中,在37 ℃、200 r/min培养24 h后进行平板计数。将菌液稀释至2.7×1
1.6 安全性试验
按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版
按照WOAH Terrestrial Manual 2022 Chapter 3.1.
1.7 毒力试验
按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版
1.8 残余毒力试验(50%痊愈时间)
按照WOAH Terrestrial Manual 2022 Chapter 3.1.
1.9 免疫保护力试验
将36只6周龄的雌性BALB/c小鼠随机平均分为6组,每组6只。按照WOAH Terrestrial Manual 2022 Chapter 3.1.
1.10 统计学分析
使用SPSS 17.0软件中的独立样本t-检验方法,分析试验组和对照组之间的平均差异。P<0.05被认为具有显著差异。
1.11 动物实验的场所和伦理审查说明
所有涉及布鲁氏菌疫苗株的操作(安全性试验、毒力试验、残余毒力试验)均在中国兽医药品监察所ABSL-2实验室内进行;涉及布鲁氏菌强毒株的操作(免疫保护力试验)在中国兽医药品监察所ABSL-3实验室内进行。
本研究方案已通过中国兽医药品监察所实验动物福利伦理审查委员会的审查,实验动物福利伦理审查编号分别为中监所(福)2023第00243号、中监所(福)2023第00244号、中监所(福)2023第00245号、中监所(福)2023第00246号。
2 结果与分析
2.1 同源重组质粒pEX18AP-bp26-DFR的构建与鉴定结果
以提取的S2基因组为模板,通过PCR扩增得到523 bp的上游同源臂和506 bp的下游同源臂;以上、下游同源臂为模板,通过连接PCR扩增获得1 020 bp的融合片段,并将该融合片段克隆至pEX18AP载体中。经过Amp抗性筛选、PCR鉴定和双酶切验证,获得阳性重组质粒,命名为pEX18AP-bp26-DFR。阳性重组质粒的双酶切验证结果如

图1 pEX18AP-bp26-DFR重组质粒PCR鉴定结果
Figure 1 PCR identification results of recombinant plasmid pEX18AP-bp26-DFR. Lane M: 10000 bp DNA Marker; Lane 1: Double digested band of pEX18AP-bp26-DFR.
2.2 布鲁氏菌S2Δbp26缺失株的筛选与遗传稳定性鉴定结果
将同源重组质粒pEX18AP-bp26-DFR电转化至S2菌株中,最终获得无Amp抗性,且能在含蔗糖培养基上生长的bp26基因缺失株,命名为S2Δbp26。采用引物YZ1-Bp26-F和YZ1-Bp26-R对5个S2Δbp26阳性克隆进行PCR鉴定。结果如

图2 布鲁氏菌S2Δbp26缺失株PCR鉴定结果
Figure 2 PCR identification result of bp26 gene deletion strain of Brucella S2. Lane M: 2000 bp DNA Marker; Lanes 1-5: Identification of bp26 gene deletion strain of Brucella S2 strain; Lane 6: S2 strain.
为了验证S2Δbp26的遗传稳定性,选取S2Δbp26缺失株的1号克隆进行连续传代,并每隔5个代次采用引物YZ1-Bp26-F和YZ1-Bp26-R进行PCR验证。

图3 布鲁氏菌S2Δbp26缺失株PCR筛选结果
Figure 3 PCR identification result of bp26 gene deletion strain of Brucella S2 strain in different generations. Lane M: 2000 bp DNA Marker; Lane 1: Identification of bp26 gene deletion strain of Brucella S2 strain; Lanes 2-5: S2Δbp26 deletion plants were obtained in the 5th, 10th, 15th, and 20th generations; Lane 6: S2 strain.
2.3 生长曲线测定与表型鉴定结果
在TSB正常培养环境和初始菌株浓度相同的情况下,每隔2 h对S2株和S2Δbp26缺失株在600 nm处的吸光度进行测量。结果表明,在各个不同时间点,2个菌株的生长趋势基本一致,见

图4 细菌生长曲线测定
Figure 4 The growth curve of Brucella strains.
根据脂多糖是否含有完整的O链可将布鲁氏菌分为光滑型和粗糙型。使用结晶紫对细菌进行染色时,光滑型细菌不着色,保持白色菌落形态;而粗糙型细菌则被染成紫色。在吖啶黄试验中,光滑型细菌不形成沉淀,保持浑浊状态;而粗糙型细菌则因自凝现象形成沉

图5 不同布鲁氏菌菌株的结晶紫染色结果
Figure 5 The crystal violet staining results of Brucella strains. A: Rough RM6/66 strain; B: Smooth S2 strain; C: S2Δbp26-F1; D: S2Δbp26-F5; E: S2Δbp26-F10; F: S2Δbp26-F15; G: S2Δbp26-F20.

图6 不同布鲁氏菌菌株的吖啶黄凝集试验
Figure 6 The results of acridine yellow coagulation test of Brucella strains.
2.4 安全性试验结果
根据《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版
2.5 毒力试验结果
分别对接种S2株和S2Δbp26缺失株各代次15 d后的豚鼠脾脏质量和分菌情况进行评估,结果见

图7 豚鼠脾脏质量
Figure 7 Spleen weight of Guinea pigs.
Strains | Bacterial load of spleen (CFU/g) |
---|---|
S2 |
3.56×1 |
S2Δbp26-F1 |
7.95×1 |
S2Δbp26-F5 |
2.19×1 |
S2Δbp26-F10 |
1.30×1 |
2.6 残余毒力试验结果
使用S2株和S2Δbp26-F1株接种6周龄BALB/c雌性小鼠,分别在接种后的第3周、第5周、第7周和第9周扑杀小鼠并无菌取脾脏,称重后进行研磨涂板。统计每周扑杀时脾脏无菌的小鼠数量,并根据WOAH Terrestrial Manual 2022 Chapter 3.1.
Strains | Inoculation dose (CFU/mice) | Recovery rate (%) | RT50 (weeks) | |||
---|---|---|---|---|---|---|
3 weeks | 5 weeks | 7 weeks | 9 weeks | |||
S2 |
1×1 | 26 | 89 | 98 | 99 | 4.08 |
S2Δbp26-F1 |
1×1 | 56 | 95 | 98 | 99 | 2.62 |
2.7 免疫保护力试验结果
为探究bp26基因缺失对菌株免疫保护能力的影响,使用S2株和S2Δbp26-F1株免疫6周龄BALB/c雌性小鼠,免疫30 d后用M28强毒株进行攻毒。攻毒后第15天和第45天小鼠脾脏载菌量结果如

图8 攻毒后小鼠脾脏载菌量
Figure 8 The bacteria in the spleen of the vaccined mice in different days. A: The splenic bacteria load of mice on days 15; B: The splenic bacteria load of mice on days 45. **: P<0.01.
3 讨论与结论
从布鲁氏菌病疫苗生产的批签发数据来看,S2疫苗株是我国使用最为广泛的一种疫苗,其安全性和免疫保护能力均表现良好,可用于接种猪、牛和羊,其是全球唯一可用于免疫猪的布鲁氏菌病弱毒疫苗。S2疫苗株能通过口服免疫途径为猪、牛和羊提供有效的免疫保护,其优势在于口服免疫不会导致母畜流产。因其低残留毒力、高安全性、接种便利以及高效的保护力,S2疫苗在中国及其他国家被广泛应用于家畜的布鲁氏菌病免疫接种。然而,尽管S2疫苗在控制布鲁氏菌病方面取得了显著成效,但它也存在一定的局限性,即其完整的脂多糖结构会干扰感染动物与免疫动物的血清学诊
BP26蛋白是布鲁氏菌的一种优势抗原,在布鲁氏菌中高度保守,并能刺激保护性T细胞产生迟发型变态反应。张瑞
在原有布鲁氏菌病疫苗株基础上,通过缺失免疫原性蛋白编码基因构建新型基因缺失疫苗,是目前研发鉴别诊断疫苗的一种有效思路。例如,由天康生物股份有限公司和新疆畜牧科学院兽医研究所联合研发的布氏病菌活疫苗A19-Δvirb12疫苗,以及中国农业科学院哈尔滨兽医研究所开发的M5-90Δ26疫苗,均是在原有的A19疫苗和M5-90疫苗基础上,通过缺失免疫原性蛋白构建而成的。其中,M5-90Δ26疫苗与本研究中使用的缺失株缺失的是同一基因。上述2种疫苗均已获得新兽药证书,并已开始在我国应用于家畜布鲁氏菌病的防控工作
在本研究中,为了破解S2疫苗难以进行血清学鉴别诊断的难题,对S2疫苗株的bp26基因进行了缺失,成功构建了S2Δbp26缺失株。与亲本菌株S2相比,该缺失株在体外培养条件下的生长速度无显著差异。体外连续传代结果显示,构建的缺失株基因型和表型均具有良好的稳定性。随后,按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版
作者贡献声明
刘世博:文章撰写、数据分析、安全性试验;唐新月:缺失株构建、缺失株表型鉴定、安全性试验、残余毒力试验;张晓茜:安全性试验、免疫保护力试验;张莹辉:安全性试验、残余毒力试验;靳继惠:免疫保护力试验;孙伟峰:残余毒力试验;彭小薇:试验指导、文章修改;李俊平:试验设计、试验指导、文章修改。
利益冲突
作者声明不存在任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。
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