摘要
目的
尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)是一种能引起植物枯萎病的真菌病原菌,严重危害植物生长,因此采用合适且绿色的生物方法进行防治十分必要。
方法
利用点菌法从红树林土壤中筛选出对尖孢镰孢菌有拮抗作用的海洋芽孢杆菌,并通过生理生化特性和16S rRNA基因序列分析对该芽孢杆菌进行鉴定。提取并探究其抑菌物质对尖孢镰孢菌的体外生物防治活性及作用机制。
结果
从红树林土壤中筛选出一株对尖孢镰孢菌具有强拮抗活性的芽孢杆菌K3。通过生理生化特性和16S rRNA基因序列分析鉴定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。菌株K3分泌的抗真菌物质具有广谱抗菌特性,对细菌和真菌均有效,该物质可能为蛋白或多肽类,具有良好的热稳定性,对尖孢镰孢菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)为1 mg/mL,能够显著抑制孢子萌发,可导致尖孢镰孢菌胞内的电解质、核酸和蛋白外泄。在3×MIC浓度下处理尖孢镰孢菌孢子10 h后,孢子萌发抑制率为49.85%。经处理的尖孢镰孢菌菌丝细胞完整性受损,细胞膜稳态失衡,丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量增加,膜内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化物酶(peroxidase, POD)和过氧化氢酶(catalase, CAT)活性提升。
结论
从海洋源红树林筛选出的贝莱斯芽孢杆菌K3产生的抗真菌物质抑菌谱广,对尖孢镰孢菌有较强抑制活性,具有潜在的商业应用价值。
尖孢镰孢菌是一种能在土壤中传播的植物病原菌,具有在土壤中长期存活的能力,难以被彻底清
红树林是热带和亚热带海岸潮间带特有的木本植物群落,位于陆地与海洋的交界区域,拥有丰富多样的微生物种
本研究旨在从红树林土壤和海泥样本中分离并筛选出一株具有抗尖孢镰孢菌活性的芽孢杆菌菌株,因其在自然界中广泛分布且具有产生多种抗真菌代谢物的能力。采用有机试剂萃取法得到抗菌肽粗提物,并对其抑菌机理进行了初步分析和表征。这些研究不仅丰富了我国海洋源红树林微生物资源库,还为开发新型生物防治方法提供了理论基础和技术支持。
1 材料与方法
1.1 菌株
大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、尖孢镰孢菌、黄曲霉、黑曲霉、产黄青霉、总状毛霉,所有菌株均购自广东省微生物菌种保藏中心。
1.2 主要试剂和仪器
营养琼脂、LB肉汤、PDA、PDB,购自北京陆桥技术股份有限公司;胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶,购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;戊二醛、乙酸乙酯,购自西陇科学股份有限公司;愈创木酚,购自上海麦克林生化科技股份有限公司;丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量检测试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性检测试剂盒、过氧化氢酶( catalase, CAT)活性检测试剂盒,购自北京盒子生工科技有限公司;HBI芽孢杆菌生化鉴定条,购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。
1.3 拮抗菌株的筛选和鉴定
1.3.1 菌株的分离
以采集自广东省湛江市徐闻县、霞山区、麻章区以及广西壮族自治区钦州市钦南区的红树林根部泥土和附近海泥作为样品,每种土样取10 g样品与90 mL无菌水煮沸10 min后,混匀冷却,取上层稀释液做梯度稀释至1
1.3.2 菌株的初筛
采用点菌
1.3.3 菌株的复筛
用牛津杯法确认菌株发酵上清液的抑菌效果。选择抑菌圈直径大于10 mm的拮抗菌株接入50 mL LB培养基中,37 ℃、180 r/min培养12 h得种子液,将种子液按3%比例接入100 mL LB肉汤中,37 ℃、180 r/min培养72 h得发酵液,将发酵液4 ℃、12 000 r/min离心10 min,取其上清液,用0.22 µm水相滤膜过滤除菌。取100 µL 1×1
1.3.4 菌株的鉴定
取复筛后的目标菌株在营养琼脂中纯化出单菌落,观察菌落形态并用HBI芽孢杆菌生化鉴定条鉴定。参考赖崇熙
1.4 拮抗菌株抗真菌物质活性分析
1.4.1 不同提取方法的活性分析
利用有机溶剂萃取法和酸沉淀法初步提取海洋芽孢杆菌的抗真菌物质,确定最佳提取抗真菌物质的方法。有机溶剂萃取法:将发酵上清液与乙酸乙酯等体积混合,置于36 ℃、180 r/min摇床萃取6 h,上层有机相使用旋转蒸发仪于40 ℃下蒸干,下层水相再与乙酸乙酯等体积混合,步骤重复3次,用去离子水收集残留的浓缩成分,用0.22 µm滤膜过滤,使用乙酸乙酯萃取未接菌的LB液体培养基作为实验的空白对照。酸沉淀法:发酵上清液中加入浓盐酸,调pH至2.0,4 ℃过夜,4 ℃、5 000 r/min离心20 min后去除上清,用少量甲醇溶解沉淀,调节pH至7.0,10 000 r/min离心15 min后得到的上清液即为含抗菌物质的甲醇溶液,然后用旋转蒸发仪去甲醇,并用去离子水收集残留的浓缩成分,用0.22 µm滤膜过滤,将复溶液于4 ℃冷藏备用。用1×1
1.4.2 温度和蛋白酶对抗真菌物质稳定性的影响
将1.4.1节最佳方法提取的抗真菌物质浓缩后,将粗提液放入离心管密封,分别置于25、45、75、100、121 ℃孵育30 min,随后将离心管插入冰上降温至4 ℃,采用牛津杯法测定其抗真菌活性,以4 ℃未经加热处理的粗提液作为对照。蛋白酶敏感实验需先将粗提液的pH调整为蛋白酶最适pH,然后分别加入木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶处理粗提液,至酶反应终浓度为10 mg/mL,50 ℃恒温水浴4 h后,调回原粗提液pH。用牛津杯法测定其抗真菌活性,以不加蛋白酶的粗提液作为空白对照。
1.4.3 抑菌谱测定
利用牛津杯法测定抗真菌物质对不同细菌和真菌的抑菌活性。
1.4.4 最小抑菌浓度的测定
测定粗提液对尖孢镰孢菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC),首先将尖孢镰孢菌孢子悬浮液加入灭菌的尚未凝固的PDA培养基中,使其终浓度为1×1
1.5 抗真菌物质作用机理
1.5.1 对尖孢镰孢菌孢子细胞损伤试验
向尖孢镰孢菌孢子悬浮液加入粗提液使其最终浓度为1×MIC和3×MIC,以无菌水为空白对照,在30 ℃、200 r/min条件下培养,每隔30 min取1次样,在10 000 r/min离心15 min,取上清液,用0.22 µm无菌滤膜过滤后用电导率仪测量上清液电导率的变化。
参考李天溪
核酸泄漏度=∆OD260 (前)-∆OD260 (后) | (1) |
蛋白泄漏度=∆OD280 (前)-∆OD280 (后) | (2) |
1.5.2 对尖孢镰孢菌孢子萌发的影响
精确移取10 µL 1×1
孢子萌发率=×100% | (3) |
孢子抑制率=
×100% | (4) |
1.5.3 对尖孢镰孢菌菌丝完整性的影响
取1 mL尖孢镰孢菌孢子悬浮液放入装有5 mL PDB培养基的50 mL离心管中,在30 ℃、180 r/min培养2 d后,分别加入粗提液使培养液终浓度为1×MIC和3×MIC,继续培养24 h后取样观察菌丝形态。取样时去除培养基,并用PBS缓冲液清洗3遍后备用。
将少量菌丝置于1.5 mL EP管中,先用0.01 g/L的碘化丙啶(propidium iodide, PI)溶液在30 ℃下避光染色20 min,然后用PBS缓冲液清洗至无色,最后分散菌丝并制作样本片,以便在荧光显微镜下观察。
1.5.4 对尖孢镰孢菌菌丝细胞死亡的影响
参考刘
1.5.5 对尖孢镰孢菌显微结构的影响
参考赵焕
1.6 对尖孢镰孢菌菌丝膜脂过氧化的影响
取适量备用菌丝,根据丙二醛(malondialdehyde, MDA)测定测试盒说明书配制溶液,参考操作表添加相关试剂,混匀后室温放置10 min,使用酶标仪分别测定波长532、450和600 nm处的吸光度。
1.7 对尖孢镰孢菌的抗氧化酶活性的影响
取适量备用菌丝与提取液混合,利用超声破碎仪进行处理,设定超声功率为200 W、超声时间为3 s,间隔时间为10 s,重复30次后,4 ℃、8 000 r/min离心10 min,获得粗酶提取液,用于测定总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、过氧化物酶(peroxidase, POD)的活性。
1.7.1 总SOD活性测量
根据超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒说明书配制溶液,按操作步骤添加相关试剂,混匀后在室温下放置10 min,使用分光光度计测定波长550 nm处的吸光值。
1.7.2 CAT活性测量
依据过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒说明书进行操作,按操作步骤配制相关试剂,混匀后使用分光光度计测定波长405 nm处的吸光值。
1.7.3 POD活性测定
采用愈创木酚比色法测定样品过氧化物酶(POD)的活性。将80 µL粗酶液与280 µL质量浓度为0.3%的愈创木酚溶液充分混匀后,30 ℃恒温孵育10 min。在酶标板孔中预加30 µL 0.1 mol/L H2O2启动反应体系,随后加入270 µL预反应混合液,立即使用酶标仪在470 nm波长处进行动态监测。设置30 s间隔连续采集10个时间点的吸光度数据(总时长5 min),以蒸馏水作为空白对照。结果计算:以单位时间内吸光度变化0.01个单位定义为1个活性单位(U)。计算
POD活性 | (5) |
式中:∆A470为反应时间内的吸光度变化值;Vt为提取粗酶液的总体积(mL);Vs为反应体系中粗酶液体积(mL);Fw为样品质量(g);t为反应时间(min)。
1.8 数据统计分析
所有实验数据均经过严谨的处理与分析,实验数据通过Origin 8.0软件进行作图,利用IBM SPSS Statistics v26.0软件对实验数据进行单因素方差分析。为确保结果的可靠性,所有实验均进行了3次独立重复检验。实验结果以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 抗真菌海洋芽孢杆菌筛选
从湛江、广西等地采集的红树林海泥土壤样品中通过梯度稀释法和点菌法初步筛选出具有抑菌效果的菌株21株,其中5株菌株(编号K3、K5、J22、N1、N3)对尖孢镰孢菌的抑菌圈直径均大于10 mm,结果如
Strain | The diameter of the bacteriostasis circle (mm) | Screening site |
---|---|---|
A2 | 5.09±1.48 | Qinnan District, Qinzhou City |
Z2 | 3.32±2.09 | Qinnan District, Qinzhou City |
Z3 | 3.52±0.73 | Qinnan District, Qinzhou City |
C2 | 6.02±1.20 | Qinnan District, Qinzhou City |
B4 | 6.54±0.87 | Qinnan District, Qinzhou City |
Y3 | 2.06±1.96 | Qinnan District, Qinzhou City |
J11 | 1.62±0.53 | Mazhang District, Zhanjiang City |
J12 | 4.76±0.88 | Mazhang District, Zhanjiang City |
J22 | 14.2±0.34 | Mazhang District, Zhanjiang City |
J24 | 9.47±2.81 | Mazhang District, Zhanjiang City |
X2 | 5.48±0.45 | Xuwen County, Zhanjiang City |
X3 | 9.22±1.83 | Xuwen County, Zhanjiang City |
M2 | 6.14±0.44 | Xuwen County, Zhanjiang City |
M4 | 7.83±2.47 | Xuwen County, Zhanjiang City |
M5 | 4.48±1.06 | Xuwen County, Zhanjiang City |
N1 | 13.36±1.72 | Xuwen County, Zhanjiang City |
N3 | 15.94±1.67 | Xuwen County, Zhanjiang City |
K1 | 6.68±0.95 | Xuwen County, Zhanjiang City |
K3 | 18.24±1.69 | Xuwen County, Zhanjiang City |
K5 | 12.12±1.33 | Xuwen County, Zhanjiang City |
K7 | 8.64±1.28 | Xuwen County, Zhanjiang City |
采用牛津杯法对抑菌圈直径大于10 mm的菌株发酵上清液进行复筛,结果如
Strain | The diameter of the bacteriostasis circle (mm) |
---|---|
J22 | 12.40±0.42 |
N1 | 10.29±0.26 |
N3 | 11.98±0.17 |
K3 | 13.38±0.29 |
K5 | 9.66±0.35 |
2.2 菌株鉴定
菌株K3的生理生化鉴定结果如
Determination item | Determination result | Determination item | Determination result |
---|---|---|---|
V-P test | - | Gelatin liquefaction test | + |
Citrate test | - | Growth on 7% NaCl | + |
Propionate salt test | - | Growth on pH 5.7 | + |
d-xylose | + | Nitrate reduction test | + |
L-arabinose | + | Starch hydrolysis test | + |
d-mannitol | + | Anaerobic growth | + |
+: Positive reaction; -: Negative reaction.

图1 菌株K3基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树
Figure 1 Phylogenetic tree of strain K3 constructed based on 16S rRNA gene sequences. Numerical values at the nodes represent bootstrap support values; The scale bar indicates a branch length of 0.005 substitutions per site; The numbers in parentheses are GenBank accession numbers.
2.3 抗真菌物质不同提取方法的活性比较
分别采用有机溶剂萃取法和酸沉淀法初步提取K3的抗真菌物质,并测定其抑菌活性。如
Extraction procedure | The diameter of the bacteriostasis circle (mm) |
---|---|
Organic solvent extraction method | 22.27±0.43 |
Acid precipitation method | 7.51±0.15 |
Control | 0.00±0.00 |
2.4 抗真菌物质的热稳定性和酶敏感性的分析结果
不同温度处理后抗真菌物质的稳定性评估结果如

图2 温度(A)和蛋白酶(B)对抗真菌物质稳定性的影响
Figure 2 The influence of temperature (A) and protease (B) on the stability of antifungal substances. The different letters in the figure indicate significant differences (P<0.05). The same as below.
2.5 抑菌谱的分析结果
K3抗真菌物质的抑菌谱测定结果如
Strain | The diameter of the bacteriostasis circle (mm) |
---|---|
Fusarium oxysporum | 33.96±0.34 |
Aspergillus flavus | 21.84±0.57 |
Aspergillus niger | 27.86±0.74 |
Mucor racemosus | 16.94±0.17 |
Aspergillus oryzae | 25.06±0.69 |
Penicillium chrysogenum | 29.86±0.61 |
Staphylococcus aureus | 15.84±0.17 |
Escherichia coli | 14.70±0.13 |
Vibrio parahaemolyticus | 15.11±0.24 |
2.6 最小抑菌浓度的测定结果
如

图3 最小抑菌浓度(MIC)测定结果
Figure 3 Determination results of the minimum inhibitory concentration (MIC) of the crude extract.
2.7 对尖孢镰孢菌细胞损伤的分析结果
抗真菌物质对尖孢镰孢菌孢子细胞的损伤可通过尖孢镰孢菌介质的电导率、胞外核酸和蛋白泄漏程度来衡量。与对照组相比,抗真菌物质处理后,上清液的电导率(

图4 尖孢镰孢菌细胞损伤的测定结果
Figure 4 The analysis results of cellular damage in Fusarium oxysporum. A: Electrical conductivity; B:Nucleic acid leakage degree; C: Protein leakage degree. Different uppercase letters indicate significant differences among crude extract concentrations at the same time point, while different lowercase letters represent significant differences across time points at the same concentration (n=3, P<0.05). The same as below.
2.8 对尖孢镰孢菌孢子萌发的影响结果
如

图5 各时间点尖孢镰孢菌孢子萌发的测定结果
Figure 5 The measurement results of spore germination of Fusarium oxysporum under various treatment durations.
2.9 对尖孢镰孢菌菌丝完整性的影响结果
细胞壁和细胞膜是真菌抵御外界伤害的第一道防御屏障。荧光染料PI是一种常用的细胞核荧光染料,能够嵌入核酸并发出红色荧光,虽然不能透过完整的细胞膜,但可以渗透破损的细胞膜并对细胞核进行染色。因此,PI常被用于检测细胞膜的完整性以及细胞的活性。如

图6 尖孢镰孢菌菌丝完整性的测定结果
Figure 6 The measurement results of hyphal integrity of Fusarium oxysporum.
2.10 对尖孢镰孢菌菌丝细胞死活的影响结果
台盼蓝染色法通过检测细胞膜的完整性来区分菌丝细胞的死活状态。如

图7 尖孢镰孢菌菌丝细胞死活的测定结果
Figure 7 The measurement results of the viability and death of Fusarium oxysporum hyphal cells.
2.11 对尖孢镰孢菌显微结构的影响结果
扫描电镜结果显示(

图8 尖孢镰孢菌超微结构的测定结果
Figure 8 The measurement results of the microscopic structure of Fusarium oxysporum.
2.12 对尖孢镰孢菌丝丙二醛含量的影响结果
丙二醛(MDA)含量是反映机体抗氧化能力和细胞损伤程度的重要指标,可间接反映细胞膜脂质过氧化的强度。如

图9 尖孢镰孢菌菌丝MDA含量的测定结果
Figure 9 MDA contents in Fusarium oxysporum hyphae.
2.13 参与清除ROS的3种抗氧化物酶活测量
超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)可调控细胞内的活性氧(ROS)水平。通过测定这些酶在菌丝体内的活性,探究它们是否协同作用以降低过量的活性氧。如

图10 尖孢镰孢菌抗氧化酶活性的测定结果
Figure 10 The determination results of antioxidant enzyme activity in Fusarium oxysporum. A: SOD activity; B: CAT activity; C: POD activity.
3 讨论
近年来,国内外学术研究揭示了贝莱斯芽孢杆菌的多方面益处,包括其在促进动植物生长发育、抑制病原菌以及激发机体系统性抗性方面的潜
芽孢杆菌属作为生物防治剂的有效性主要依赖于3个关键机制:空间和养分的竞争、产生抗生素、诱导寄主植物防
本研究通过生理生化与16S rRNA基因系统发育分析初步明确了菌株K3是贝莱斯芽孢杆菌,后续将进一步结合gyrB管家基因序列分析完善菌株分子鉴定。更重要的是,针对K3的抗真菌作用机制,我们还将聚焦于活性物质靶向解析和分子互作机制,以明确抗菌物质的具体性质和分子层面抑菌机理。为了充分挖掘贝莱斯芽孢杆菌的生防潜力并评估其商业价值,未来的研究还将扩展至该抗真菌物质在水果保护方面的应用效果评估。通过实验研究,深入了解贝莱斯芽孢杆菌粗提物对水果病害的防控效果,以及其在提升果实品质和延长货架寿命方面的潜力。
4 结论
从海洋红树林土壤中分离的贝莱斯芽孢杆菌K3展现出对尖孢镰孢菌的较强拮抗活性,其具有广谱抑菌特性,对尖孢镰孢菌的拮抗作用与破坏孢子萌发和菌丝完整性受损有关。贝莱斯芽孢杆菌K3表现出作为生物防治药剂候选菌株的巨大潜力,具有很好的商业价值。
作者贡献声明
梁静娴:实验及文章撰写;刘唤明:提出概念和数据分析;邓楚津:数据监管和文章编辑;周春霞:文章编辑和审阅;洪鹏志:文章编辑和审阅。
利益冲突
作者声明不存在任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。
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