肠炎沙门菌

摘要

肠炎沙门菌(Salmonella Enteritidis)是一种重要的食源性病原菌，可引起人和动物的胃肠道感染。iscA是编码铁-硫(Fe-S)簇组装的关键基因之一，参与铁离子的转运和能量代谢，是一种保守的A型铁结合蛋白。

目的

通过构建肠炎沙门菌Z11 ΔiscA突变株，探究IscA在沙门菌感染过程中的作用。

方法

以实验室保存的肠炎沙门菌Z11菌株为研究对象，采用无标记框内缺失突变法构建iscA突变株。分析并比较野生株与突变株在运动性、生物被膜形成能力等方面的差异；分别在小鼠单核巨噬细胞RAW264.7和小鼠模型上探究IscA对肠炎沙门菌毒力的影响。

结果

本研究成功构建了ΔiscA缺失株；与野生株相比，ΔiscA在生长能力和生物被膜形成能力方面无明显差异，表明缺失iscA基因不会影响肠炎沙门菌的正常生长和生物被膜形成；在运动性方面，ΔiscA在6 h时的菌圈直径显著小于野生株，表明iscA基因的缺失降低了肠炎沙门菌Z11的游动能力。在RAW264.7细胞实验中，与野生株相比，ΔiscA缺失株的黏附和侵袭能力均显著降低，分别下降至约37%和20%；并且，ΔiscA缺失株突破细胞屏障进入细胞内的增殖速率也显著低于野生株。小鼠感染实验结果显示，ΔiscA缺失株在空肠和盲肠中的定殖能力显著低于野生株感染组。

结论

基因iscA与肠炎沙门菌的毒力密切相关，其缺失会影响该菌株的运动性、黏附侵袭能力、胞内增殖能力，并且降低其在宿主肠道中的定殖能力，从而进一步影响肠炎沙门菌的感染过程。

关键词

肠炎沙门菌; iscA基因; 运动性：定殖

肠炎沙门菌(Salmonella Enteritidis)是一种重要的人兽共患食源性病原菌，广泛存在于畜禽及其肉制品中，能够通过受污染的食物感染人类，严重威胁公共健康^[1-2]。肠炎沙门菌感染后，通常会导致急性胃肠道疾病，主要表现为腹泻、发烧和腹痛，严重时可导致败血症，甚至危及生命^[3]。感染后，肠炎沙门菌定殖于宿主肠道，通过黏附和侵袭等方式突破宿主肠道屏障，进一步扩散至肠道黏膜下层和淋巴组织，引发典型的胃肠道症状^[4]。在肠炎沙门菌的感染和致病过程中，沙门菌毒力岛1 (Salmonella pathogenicity island 1, SPI-1)和毒力岛2 (Salmonella pathogenicity island 2, SPI-2)发挥着关键作用。SPI-1基因编码的III型分泌系统T3SS1主要促进沙门菌对肠道上皮细胞的黏附和入侵，而SPI-2基因编码的T3SS2则协助病原菌在宿主细胞内的存活和复制，二者协同作用使沙门菌能有效突破宿主免疫防御机制^[5]。随着对沙门菌致病机制的深入研究，发现宿主环境信号，如pH、渗透压、温度和铁离子等，通过调控SPI-1和SPI-2的表达，进而影响沙门菌的感染过程^[6]。

在感染过程中，细菌需应对多种环境应激，主要包括来自反应性化学物质或营养限制的挑战，如活性氧(reactive oxygen species, ROS)、活性氮(reactive nitrogen species, RNS)以及限铁环境等^[7]。为了维持在不同环境条件下的存活，细菌进化出了多个系统以抵御这些化学物质或营养限制。铁-硫(Fe-S)簇结合蛋白在这一过程中发挥了重要作用。Fe-S簇是由铁和硫原子构成的金属簇，广泛存在于各种生物体内，作为多种蛋白质的辅因子参与多种重要的生物学过程，如铁稳态调节、电子转移、代谢催化、固氮、基因表达调控以及活性氧的感应等^[8]。目前，在原核生物中已经鉴定出5种Fe-S簇生物合成系统，即nitrogen fixation (NIF)、iron-sulfur cluster (ISC)、mobilization of SUlFur (SUF)、minimal isc system (MIS)和SUF-like minimal system (SMS)，其中ISC和SUF被认为是主要的合成系统^[9-10]。ISC被认为是大肠杆菌中主要的Fe-S簇生物合成途径，而SUF途径则被视为是替代途径，主要在Fe-S需求提高的条件下发挥作用^[11]。

在大肠杆菌中，ISC铁-硫(Fe-S)簇合成系统主要由高度保守的基因簇iscRSUA-hscBA-fdx组成，该基因簇编码7种蛋白——IscR、IscS、IscU、IscA、HscB、HscA和铁氧还蛋白，它们在Fe-S簇的合成过程中各自发挥着关键作用^[12]。IscS是一种半胱氨酸脱硫酶，负责催化l-半胱氨酸的脱硫反应，从而产生Fe-S簇组装所必需的硫^[13]。IscU则作为支架，帮助结合和组装Fe-S簇，并在组装完成后将其转移到靶蛋白上^[14]。IscA是一种铁结合蛋白，通过运输细胞内的铁和硫来克服铁限制的问题，为IscU中的铁硫团簇组装提供铁^[15]。HscA伴侣蛋白通过识别特定的氨基酸序列与IscU特异性相互作用^[16]。IscR是一个转录抑制因子，通过感知细胞中Fe-S簇的水平来调控ISC基因簇的表达^[17]。当胞内Fe-S簇水平较高时，IscR与Fe-S簇结合形成全酶-IscR，与isc操纵子启动子结合，抑制其转录；当细胞内Fe-S簇水平较低时，IscR不结合Fe-S簇形成脱簇形式，无法结合isc操纵子启动子，此时isc操纵子表达，促进Fe-S簇的合成，以维持细胞内Fe-S簇的稳态^[18-19]。

近年来的研究表明，在志贺氏菌中iscA基因的表达与细菌的毒力和致病性密切相关，缺乏iscA基因的细胞会面临Fe-S簇合成不足的问题，进而导致细胞增殖减缓甚至死亡^[20]。在沙门菌中iscA基因的表达受到环境因素的调控，例如活性氧^[21]和铁离子^[22]。IscR是调控Fe-S簇基因表达的关键调控因子，其可以直接结合到沙门菌毒力岛SPI-1的关键调控因子hilD的启动子上直接调控该基因的表达，进而调控SPI-1的表达^[23]。此外，通过转座子插入突变体文库的筛选发现鼠伤寒沙门菌的iscA基因对其在苜蓿上的定殖具有重要作用^[24]。实验室前期构建了肠炎沙门菌Z11转座子突变体文库，并通过小鼠模型筛选发现，iscA基因插入突变导致其在小鼠肠道中的定殖能力减弱^[25]。这些结果都表明沙门菌的iscA可能在其感染过程中发挥重要作用。本研究选择iscA基因进行后续研究，通过无标记框内缺失法构建ΔiscA突变株，分析其毒力表型、黏附侵袭和胞内增殖能力，以及在小鼠不同脏器中的定殖能力，旨在揭示iscA基因在肠炎沙门菌感染中的功能，为进一步探究其致病机制提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细菌、质粒、引物、细胞和实验动物

肠炎沙门菌(Salmonella Enteritidis) Z11野生株(wild type, WT)由本课题组分离并保存，大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α λpir和X7213 λpir用于质粒pDM4的扩增，本研究所用的菌株和质粒见表1；所用引物均由南京擎科生物科技有限公司合成。小鼠单核巨噬细胞RAW264.7为本实验室保存，需在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，培养条件为37 ℃、5% CO₂。6-8周龄C57BL/6小鼠由扬州大学比较医学中心提供。本研究所有动物实验均获得扬州大学动物伦理委员会的批准(批准号：202104013)。

表1  本研究所用的菌株和质粒

Table 1  The strains and plasmids used in this study

菌株/质粒 Strains/plasmids	说明/用途 Relevant characteristics	来源 Source
Escherichia coli X7213 λpir DH5α λpir	Host for π requiring plasmids, Conjugal donor Host for π requiring plasmids	Laboratory collection Laboratory collection
Salmonella Enteritidis
Z11	Wild type	Laboratory collection
ΔiscA	Z11, in-frame deletion in iscA	This study
ΔiscA::iscA	ΔiscA, complements iscA	This study
ΔiscA::Vector	ΔiscA, complements vector	This study
Plasmids
pDM4	Suicide vector, pir dependent, R6K, SacBR, Cmr	Laboratory collection
pBAD33	Carrying a mob gene in pBAD33, Cmr	Laboratory collection

1.2 培养基

LB固体培养基(g/L)：NaCl 10.0，胰蛋白胨10.0，牛肉膏5.0，琼脂15.0；煌绿琼脂培养基(g/L)：胰酪蛋白胨5.0，蛋白胨5.0，酵母粉3.0，NaCl 5.0，乳糖10.0，蔗糖10.0，亮绿0.012 5，苯酚红0.08，琼脂20.0，pH 6.9±0.2。根据实验需求添加以下成分：氯霉素(Cm，25 μg/mL)、羧苄青霉素(Carb，100 ng/mL)、硫酸庆大霉素(Gm，100 μg/mL、10 μg/mL)、2,6-二氨基庚二酸(mes0-2,6-diaminopimelic acid, DAP，50 μg/mL)。

1.3 主要试剂和仪器

羧苄青霉素、链霉素、硫酸卡那霉素、微孔滤膜、蔗糖、超级感受态制备试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；2,6-二氨基庚二酸(DAP)，Sigma-Aldrich公司；2×Taq MasterMix、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、Sal Ⅰ、Sac Ⅰ限制性核酸内切酶，TaKaRa公司；ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit，南京诺维赞生物科技股份有限公司；DMEM细胞培养基、Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)、胰酶和胎牛血清，Gibco公司；细菌基因组提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、无内毒素质粒大提试剂盒、快速质粒小提试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；

摇床，上海市离心机械研究所有限公司；PCR仪，凝胶成像仪、基础通用电泳仪、琼脂糖凝胶水平电泳槽、全自动细胞计数仪，Bio-Rad公司；超微量紫外-可见光分光光度计、CO₂培养箱，ThermoFisher Scientific公司；恒温金属浴，杭州博日科技有限公司；多功能酶标仪，BioTek公司。

1.4 肠炎沙门菌Z11基因组提取

复苏肠炎沙门菌Z11于添加Carb的LB平板上，37 ℃培养12-16 h，用接种环刮取单菌落于添加Carb的LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min培养12 h，按照细菌基因组提取试剂盒说明书提取肠炎沙门菌Z11基因组总DNA。

1.5 框内无标记缺失突变株构建

构建缺失突变株和回补株所用引物见表2。

表2  Z11ΔiscA缺失突变株和ΔiscA::iscA回补株构建和验证引物

Table 2  Primers used for the construction and verification of the Z11ΔiscA deletion mutant and ΔiscA::iscA complementation strains

Primer name	Primer sequences (5′→3′)
iscA-Up-F	GAGCGGATAACAATTTGTGGAATCCCGGGAAGAGGGTGAAGTAATCCATA
iscA-Up-R	TTTTGTTATGTAACCGTGTTCCGCTGTTATACCGA
iscA-Down-F	AACACGGTTACATAACAAAACCTCAATGTTAACGT
iscA-Down-R	AGCGGAGTGTATATCAAGCTTATCGATACCTCTGGTAACGGAGTGGGTGA
iscA-Out-F	GAACCGTCGCAACCAGAGAG
iscA-Out-R	CGTCTGCGTGACCTTTCTCC
iscA-In-F	AAATTGCAGGCTCTTGCCGT
iscA-In-R	CTGGCCAACCGTGGTAAAGG
iscA-F	AGCGAATTTCGAGCTCGGTACCTTACACGTGGAAGCTTTCGCC
iscA-R	TCCGCCAAAACAGCCAAGCTTACGTCATGAAGTTGCAGATTAAAGTT
pBAD33-F	TCTACTGTTTCTCCATACCCGTTTT
pBAD33-F	TTCTGCGTTCTGATTTAATCTGTAT
Sal I-up	GGTGCTCCAGTGGCTTCTGTTTCTA
Sac I-down	CAGCAACTTAAATAGCCTCTAAGGT

以Z11菌株基因组为模板，分别扩增iscA上下游同源臂(up和down片段)，引物为iscA-Up-F和iscA-Up-R。PCR反应体系(50 µL)：PrimeSTAR Max DNA Polymerase 25 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各2 µL，DNA模板2 µL，ddH₂O 19 µL。PCR反应条件：98 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，30个循环；72 ℃终延伸10 min。使用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit将上下游同源臂插入到Sal Ⅰ和Sac Ⅰ双酶切的pDM4质粒，50 ℃连接15-20 min，42 ℃热转化E. coli DH5α λpir和X7213 λpir感受态细胞。转化后，挑取单菌落进行PCR验证。PCR反应体系(20 µL)：2×Taq MasterMix 10 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各1 µL，DNA模板1 µL，ddH₂O 7 µL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30个循环；72 ℃终延伸10 min。重组质粒通过接合转移方式转化进入Z11菌株，用Sal I-up/Out-F和Sac I-down/Out-F两对引物分别进行PCR扩增验证单交换正确的菌落，并进行蔗糖筛选。单菌落分别用iscA-Out-F/R和iscA-In-F/R引物对进行PCR验证，获得正确的iscA缺失突变株。PCR反应体系(20 µL)：2×Taq MasterMix 10 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各1 µL，DNA模板1 µL，ddH₂O 7 µL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃终延伸10 min。

1.6 回补株构建

以Z11菌株基因组为模板，扩增iscA基因启动子及开放阅读框(open reading frame, ORF)区域。PCR反应体系：PrimeSTAR Max DNA Polymerase 25 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各2 µL，DNA模板2 µL，ddH₂O 19 µL。PCR反应条件：98 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，30个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物通过ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit插入到Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切的pBAD33质粒中。重组质粒通过电转化进入ΔiscA缺失株，PCR验证获得正确的ΔiscA::iscA回补株。PCR反应体系(20 µL)：2×Taq MasterMix 10 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各1 µL，DNA模板1 µL，ddH₂O 7 µL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30个循环；72 ℃终延伸10 min。在培养细菌时，回补株和空质粒回补株需添加氯霉素(25 μg/mL)以维持质粒的稳定性。

1.7 iscA基因缺失对肠炎沙门菌表型的影响

1.7.1 生长曲线测定

复苏Z11、ΔiscA突变株及回补株，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min培养过夜。取1 mL新鲜菌液测OD₆₀₀，并调节OD₆₀₀至0.05，取200 μL菌液加入96孔板中，37 ℃、180 r/min培养，使用酶标仪每隔1 h测定OD₆₀₀值，直至所有菌株达到平台期并记录相关数据(测定24 h)。

1.7.2 运动性测定

复苏Z11、ΔiscA突变株及回补株，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min培养过夜。取1 mL新鲜菌液用PBS洗涤2遍，8 000 r/min离心2 min，用PBS轻轻吹打重悬菌体后测OD₆₀₀值，调节OD₆₀₀至1.0，取2.5 μL菌液分别点在含0.3%琼脂的LB平板上，于37 ℃培养箱中正置培养6 h。观察菌株的形态，并测量菌圈直径。

1.7.3 生物被膜形成能力测定

将过夜培养的菌液用PBS洗涤2遍，8 000 r/min离心2 min，用PBS轻轻吹打重悬菌体后测OD₆₀₀值，调节OD₆₀₀至1.0。取150 μL菌液接入3 mL新鲜LB液体培养基中，静置培养72 h。随后进行结晶紫染色，加入200 μL甲醇固定15 min，加入200 μL结晶紫染色液，静置染色15 min，弃掉液体，用蒸馏水洗去多余染液；加入200 μL 33%冰醋酸，用枪头轻微洗下试管壁的生物膜，取100 μL测量OD₅₉₅处的吸光值。

1.8 细胞感染试验

1.8.1 黏附和侵袭能力测定

复苏实验室冻存的鼠源巨噬细胞RAW264.7于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，37 ℃、5% CO₂条件下培养。感染前1天，将巨噬细胞以5×10⁵/孔接种于24孔板中，37 ℃、5% CO₂培养10-12 h。将培养好的菌液4 500 r/min离心5 min，用DPBS洗涤2遍，测定并调节OD₆₀₀至1.0，取1 mL菌液梯度稀释后计数。以MOI=10感染细胞，37 ℃、5% CO₂培养0.5 h。黏附孔中加入1 mL含有0.2% Triton X-100的PBS裂解细胞10 min，梯度稀释后计数。按照公式(1)计算黏附率。

黏附率=(胞外黏附细菌数/总感染细菌数)×100%

(1)

按照上述方法感染并黏附细胞0.5 h后，用DPBS洗涤3遍，加入含有100 μg/mL庆大霉素的DMEM培养基分别侵袭2、4和6 h。用含有0.2% Trion X-100的PBS裂解细胞10 min，梯度稀释后进行计数。按照公式(2)计算侵袭率。

侵袭率=(胞内侵袭细菌数/总感染细菌数)×100%

(2)

1.8.2 胞内增殖能力测定

复苏实验室冻存的RAW264.7细胞于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中。感染前1天，将巨噬细胞以5×10⁵/孔接种于24孔板中，37 ℃、5% CO₂培养10-12 h；将培养好的菌液4 500 r/min离心5 min，用DPBS洗涤2遍，测定并调节OD₆₀₀至1.0，取1 mL菌液进行梯度稀释后计数。以MOI=10感染细胞，37 ℃、5% CO₂黏附0.5 h后，用DPBS洗涤3遍，加入含有100 μg/mL庆大霉素的DMEM培养基继续培养1 h。弃去培养基后，换用含低浓度庆大霉素(10 μg/mL)的DMEM培养基进行培养，此时记为0 h。分别在0、2、4、6 h取样。用1 mL含有0.2% Trion X-100的PBS裂解细胞10 min，取裂解液梯度稀释后点板计数，采用公式(3)测定细菌胞内增殖情况。

增殖速率=(胞内增殖菌量–初始侵袭细胞菌量)/

初始侵袭细胞菌量×100%

(3)

1.9 小鼠感染试验

将培养好的菌液4 500 r/min离心5 min，用PBS洗涤2遍，测定并调节OD₆₀₀至1.0，随后用PBS稀释为5×10⁶ CFU。以5×10⁶ CFU的剂量对C57BL/6小鼠进行口服感染，并持续观察小鼠的存活、活跃度、进食和炸毛等情况，绘制存活曲线。在感染3 d后剖杀小鼠，取出空肠和盲肠，称重后置于均质管中进行均质处理。将均质液进行10倍梯度稀释，取原液及10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀释倍数的菌液涂布LB平板，37 ℃培养过夜，计算载菌量。

1.10 数据处理与分析

利用GraphPad Prism 6.0对所有数据进行统计分析。实验结果以平均值±标准误(mean±SEM)格式表示，采用t检验进行统计学分析，*表示P <0.05，**表示P <0.01，***表示P <0.001。

2 结果与分析

2.1 肠炎沙门菌Z11ΔiscA突变株及ΔiscA::iscA回补株的构建

基于同源重组原理，构建了肠炎沙门菌Z11 ΔiscA的框内无标记缺失突变株。运用特异性外部引物(iscA-Out-F/R)和内部引物(iscA-In-F/R)对缺失突变株进行验证。结果如图1A所示，外部引物在野生株中扩增的条带大小为1 679 bp，而在缺失突变株中扩增条带大小为1 355 bp，内部引物在缺失突变株中未能扩增出条带，表明缺失突变株构建成功。通过质粒回补方法构建ΔiscA::iscA回补株和空质粒菌株ΔiscA::Vector，结果如图1B所示，基因片段长度为624 bp，表明回补株和空质粒菌株构建成功。

图1  突变株ΔiscA、回补株ΔiscA::iscA和空质粒菌株ΔiscA::Vector的PCR验证。A：突变株ΔiscA的PCR验证[泳道M：DL5000 DNA marker；泳道1：Z11 (Out)；泳道2：Z11ΔiscA (Out)；泳道3：Z11 (In)；泳道4：Z11ΔiscA (In)]；B：回补株ΔiscA::iscA和空质粒菌株ΔiscA::Vector的PCR验证[泳道M：DL2000 DNA marker；泳道1：Z11；泳道2：Z11ΔiscA::Vector；泳道3：Z11ΔiscA::iscA]。

Figure 1  Identification of Z11ΔiscA, complemented strain ΔiscA::iscA and ΔiscA::Vector by PCR. A: Identification of Z11ΔiscA by PCR (Lane M: DL5000 DNA marker; Lane 1: Z11 (Out); Lane 2: Z11ΔiscA (Out); Lane 3: Z11 (In); Lane 4: Z11ΔiscA (In)); B: Identification of complemented strain ΔiscA::iscA and ΔiscA::Vector by PCR (Lane M: DL2000 DNA marker; Lane 1: Z11; Lane 2: Z11ΔiscA::Vector; Lane 3: Z11ΔiscA::iscA).

2.2 iscA基因缺失对肠炎沙门菌表型的影响

2.2.1 iscA基因缺失不影响肠炎沙门菌的生长

在LB培养基中测定肠炎沙门菌Z11和ΔiscA突变株的生长曲线，结果如图2所示，与WT相比，ΔiscA突变株的生长曲线并无显著差异，表明iscA基因的缺失不影响Z11菌株的正常生长。

图2  突变株ΔiscA、回补株ΔiscA::iscA和空质粒菌株ΔiscA::Vector的生长曲线

Figure 2  The growth curves of ΔiscA, complementation strains ΔiscA::iscA and ΔiscA::Vector.

2.2.2 iscA基因缺失降低肠炎沙门菌的运动能力

沙门菌通过鞭毛等运动器官实现快速运动，从而入侵宿主肠道上皮细胞或扩散。本研究探讨了iscA基因缺失对肠炎沙门菌运动性的影响。结果如图3所示，在LB半固体平板上，ΔiscA突变株的菌圈直径明显小于野生株，而回补株的菌圈直径与野生株相近(图3A)。不同菌株的菌圈直径统计结果如图3B所示，ΔiscA的菌圈直径显著低于野生株，而回补株则与野生株相似，表明iscA基因缺失会降低肠炎沙门菌的游动能力。

图3  突变株ΔiscA、回补株ΔiscA::iscA和空质粒菌株ΔiscA::Vector的运动能力测定(n=3)。A：突变株ΔiscA、回补株ΔiscA::iscA和空质粒菌株ΔiscA::Vector在LB半固体平板上的运动能力；B：突变株ΔiscA、回补株ΔiscA::iscA和空质粒菌株ΔiscA::Vector的运动能力柱状图(***：P<0.001)。

Figure 3  Determination of motility of ΔiscA, complemented strain ΔiscA::iscA and ΔiscA::Vector (n=3). A: The swimming ability of ΔiscA, complemented strains ΔiscA::iscA and ΔiscA::Vector on LB semi-solid plates; B: Histogram of the swimming ability of ΔiscA, complemented strain ΔiscA::iscA and ΔiscA::Vector (***: P<0.001).

2.2.3 iscA基因缺失不会影响肠炎沙门菌生物被膜形成能力

对肠炎沙门菌WT和ΔiscA的生物被膜形成能力进行检测，在试管中静置培养72 h后，用结晶紫染色发现ΔiscA缺失突变株的生物被膜形成能力略微下降，但由于试管间差异较大，未达到显著差异，回补株ΔiscA::iscA与WT之间也无显著差异，结果如图4所示。

图4  缺失突变株ΔiscA、回补株ΔiscA::iscA和空质粒菌株ΔiscA::Vector生物被膜形成能力测定(n=3)

Figure 4  Determination of biofilm formation of ΔiscA, complemented strains ΔiscA::iscA and ΔiscA::Vector (n=3).

2.3 iscA缺失降低肠炎沙门菌的黏附侵袭能力

以RAW264.7细胞为模型，评估了iscA基因缺失对肠炎沙门菌黏附和侵袭能力的影响。黏附能力结果如图5A所示，ΔiscA突变株在RAW264.7细胞上的黏附率较野生株降低了15%，差异显著，而回补株ΔiscA::iscA的黏附能力恢复到与野生株相当的水平。侵袭能力结果如图5B所示，ΔiscA缺失突变株的侵袭率下降到20%，显著低于野生株的28%，回补株的侵袭率也恢复到野生株的水平。上述结果表明，iscA基因的缺失显著降低了肠炎沙门菌的黏附和侵袭能力。

图5  缺失突变株ΔiscA、回补株ΔiscA::iscA和空质粒菌株ΔiscA::Vector黏附和侵袭能力测定(n=3)。A：缺失突变株ΔiscA、回补株ΔiscA::iscA和空质粒菌株ΔiscA::Vector在RAW264.7细胞上的黏附能力测定；B：缺失突变株ΔiscA、回补株ΔiscA::iscA和空质粒菌株ΔiscA::Vector在RAW264.7细胞上的侵袭能力测定。

Figure 5  Determination of adhesion and invasion ability of ΔiscA, complemented strains ΔiscA::iscA and ΔiscA::Vector (n=3). A: The adhesion capability of ΔiscA, complemented strains ΔiscA::iscA and ΔiscA::Vector in RAW264.7 cells; B: The invasion capability of ΔiscA, complemented strains ΔiscA::iscA and ΔiscA::Vector in RAW264.7 cells. *: P<0.05.

2.4 iscA缺失影响肠炎沙门菌的胞内增殖

本研究进一步探讨了iscA基因缺失对肠炎沙门菌胞内增殖的影响。将野生株和ΔiscA突变株以MOI=10感染RAW264.7细胞，并在0、2、4、6 h分别取样裂解细胞，测定胞内增殖情况。结果如图6所示，在2 h时，WT和ΔiscA突变株的胞内增殖速率无显著差异；在4 h和6 h时，ΔiscA突变株的增殖速率显著低于WT，而回补株恢复到野生株的水平，表明iscA基因缺失降低了肠炎沙门菌在RAW264.7细胞内的增殖能力。

图6  缺失突变株ΔiscA、回补株ΔiscA::iscA和空质粒菌株ΔiscA::Vector胞内增殖能力测定(n=3)

Figure 6  Determination of the intracellular proliferation ability of ΔiscA, complemented strains ΔiscA::iscA and ΔiscA::Vector (n=3). **: P<0.01.

2.5 iscA基因缺失对肠炎沙门菌毒力的影响

以小鼠为模型，进一步评估了IscA对肠炎沙门菌毒力的影响。将WT和ΔiscA缺失株以5×10⁶ CFU的剂量口服灌胃C57BL/6小鼠，观察发现缺失株感染组小鼠的精神状态和炸毛情况较野生株感染组更好。记录小鼠每天的存活情况并绘制存活曲线，结果如图7所示。在C57BL/6小鼠感染模型中，野生株感染组小鼠的死亡开始于第4天，而缺失株感染组小鼠的死亡推迟至第6天，并且缺失株感染组小鼠在第8天才全部死亡。上述结果表明，ΔiscA缺失突变株可以延缓小鼠的死亡，表明iscA基因的缺失降低了肠炎沙门菌对小鼠的致死率。

图7  小鼠口服感染后的存活率(n=7)

Figure 7  Mouse survival after oral infection (n=7).

2.6 iscA基因缺失对肠炎沙门菌在小鼠肠道定殖的影响

本研究评估了野生株Z11和ΔiscA突变株在C57BL/6小鼠体内的定殖情况。将WT和ΔiscA突变株分别以5×10⁶ CFU的剂量口服灌胃C57BL/6小鼠，在感染3 d后，取小鼠空肠和盲肠组织测定载菌量。结果如图8所示，ΔiscA突变株感染组在空肠(图8A)和盲肠(图8B)中的定殖能力显著低于WT，表明iscA基因缺失降低了肠炎沙门菌在小鼠体内的定殖能力。

图8  缺失突变株ΔiscA在小鼠不同脏器的定殖能力测定。A：缺失突变株ΔiscA和WT野生株在小鼠空肠中的载菌量变化；B：缺失突变株ΔiscA和WT野生株在小鼠盲肠中的载菌量变化。

Figure 8  Determination of colonization ability of ΔiscA in mouse organs. A: Changes in bacterial load of WT and ΔiscA in the jejunum; B: Changes in bacterial load of WT and ΔiscA in the caecum. *: P<0.05.

3 讨论与结论

随着沙门菌感染在全球范围内的广泛流行及其对畜禽养殖业造成的重大影响，沙门菌已成为主要的食源性病原菌之一，其中肠炎沙门菌是人类感染沙门菌病的主要血清型^[26-27]。沙门菌主要通过受污染的食物经口进入宿主体内，在其感染过程中，会面临营养匮乏以及诸多不利的环境因素，如低pH、低浓度的铁离子、活性氮(RNS)和活性氧(ROS)的产生^[28]。研究表明，沙门菌的运动性和生物被膜形成能力在其感染过程中具有重要意义。沙门菌依靠鞭毛的运动性进行游动，能够在宿主的黏膜表面或其他部位定殖；这种运动能力不仅有助于沙门菌寻找有利的感染位点，还能够帮助细菌获取营养物质^[29]。生物被膜的形成不仅帮助沙门菌抵御宿主胃肠道的酸性环境，增强其存活率，还可以通过包裹和隔离作用，使细菌能够有效逃避宿主免疫系统的攻击^[25,30-31]。Fe-S簇系统已被证实能够感知活性氧^[21]和铁离子^[22]等信号，参与调控鼠伤寒沙门菌的毒力。然而，关于Fe-S簇在沙门菌运动性和生物被膜形成中的研究较少。因此，本研究测定了iscA基因缺失对肠炎沙门菌运动性和生物被膜形成能力的影响。结果显示，iscA基因缺失导致肠炎沙门菌的游动能力显著减弱，而生物被膜形成能力则无显著变化，表明IscA会影响肠炎沙门菌的运动能力，但不影响生物被膜形成能力。在大肠杆菌中的研究发现，Fe-S簇装配途径中的iscS、iscU和iscA基因的缺失能够导致生物被膜形成减弱，并且这一作用受到转录抑制因子IscR的调控^[32]。这些结果表明Fe-S簇装配蛋白IscA在不同菌株中对生物被膜形成能力的影响存在一定的差异。

肠炎沙门菌利用鞭毛等运动器官迅速移动到肠道，并通过其特殊的疏水分子黏附在宿主细胞，进而突破肠道上皮细胞屏障，侵袭并扩散至其他脏器，引发全身感染^[33-34]。研究表明，ISC系统在沙门菌侵袭上皮细胞中发挥重要作用，IscR通过抑制SPI-1的关键调控因子HilD的表达，进而下调T3SS基因簇的表达，参与沙门菌致病过程^[23]。IscR是ISC系统的调控因子，能够抑制iscRSUA基因簇的表达^[35]。此外，沙门菌Fe-S簇生物合成蛋白CyaY和YggX对沙门菌在小鼠中的致病性也是至关重要的^[36]。因此，Fe-S簇合成蛋白在沙门菌感染中发挥重要作用。然而，关于IscA蛋白对肠炎沙门菌在细胞和动物水平影响的研究较少。本研究以鼠源RAW264.7细胞为模型，测定了WT和ΔiscA的黏附、侵袭和胞内增殖能力，发现ΔiscA突变株的黏附和侵袭能力较WT显著降低，表明IscA通过影响沙门菌对宿主细胞的黏附和侵袭进一步影响肠炎沙门菌的感染过程。沙门菌被巨噬细胞吞噬后，会在细胞内形成SCV泡，并在其中进行增殖^[34]。本研究也测定了ΔiscA和WT在RAW264.7细胞中的胞内增殖能力，结果显示在4 h后，ΔiscA突变株的增殖速率显著低于WT，表明iscA基因缺失后降低了肠炎沙门菌在RAW264.7细胞内的增殖能力，这可能与细胞内限铁环境有关。

此外，本研究还评估了Z11和ΔiscA在C57BL/6小鼠模型上的毒力和定殖情况。在毒力实验中，发现ΔiscA缺失突变株可以将小鼠的死亡时间延缓至第8天。在定殖实验中，在感染3 d后取空肠和盲肠样本进行载菌量测定，结果显示ΔiscA缺失突变株的载菌量显著低于野生株，说明大部分ΔiscA缺失突变株被宿主的免疫系统清除，表明iscA基因对于肠炎沙门菌在肠道中的定殖能力至关重要。

综上所述，本研究通过基因敲除技术构建了ΔiscA缺失突变株，证明了iscA基因的缺失对肠炎沙门菌Z11在运动性、黏附侵袭、胞内增殖、毒力以及定殖能力的影响，结果表明IscA能够显著影响肠炎沙门菌感染宿主的致病过程，揭示了iscA基因在沙门菌抵御宿主体内不良环境因素从而成功定殖的过程中发挥了调控作用。研究结果为预防和控制沙门菌感染提供了新的思路和方法，有助于深入了解沙门菌的致病机制，为开发新型抗菌药物和疫苗提供理论依据。

作者贡献声明

余逸：设计并执行实验，分析数据和撰写论文；顾丹：设计实验，分析数据和修改论文；焦新安：指导设计实验，修改论文；潘志明：指导设计实验，修改论文等。

利益冲突

作者声明不存在任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。