禽致病性大肠杆菌菌影负载鸭源鸡杆菌

摘要

目的

研制禽致病性大肠杆菌菌影负载鸭源鸡杆菌flfA基因的核酸疫苗，并评估其在鸡体内的免疫保护效果。

方法

以鸭源鸡杆菌的菌毛基因flfA为目的基因，采用携带鸡β肌动蛋白启动子的pCAGGS-HA质粒作为表达载体，构建pCAGGS-flfA真核表达质粒；构建温控质粒PBV-E-SN，并将其转化至对氨苄青霉素敏感的禽致病性大肠杆菌分离株制备菌影；将pCAGGS-flfA质粒装载入菌影制备菌影疫苗，设计菌影负载pCAGGS-flfA质粒组、pCAGGS-flfA质粒组、空菌影组、PBS组及正常对照组。对7日龄雏鸡进行首次免疫，首免2周后二次加强免疫，首免4周后对鸡进行鸭源鸡杆菌攻毒试验，检测疫苗的免疫保护效果。

结果

所构建的真核表达质粒pCAGGS-flfA能在体外细胞中成功表达；构建的禽致病性大肠杆菌菌影菌株在42 ℃热诱导210 min后，裂解率达到99.94%；免疫保护试验结果显示，无论是通过ELISA检测的特异性IgG抗体水平，还是对鸡泄殖腔拭子和咽拭子的排菌情况以及组织脏器中细菌载量的测定，菌影负载pCAGGS-flfA质粒组的免疫保护效果均显著高于其他免疫组，包括单独免疫pCAGGS-flfA质粒组。与单独免疫pCAGGS-flfA质粒组相比，菌影负载pCAGGS-flfA质粒组的免疫保护效果更为优越。

结论

本研究表明菌影作为pCAGGS-flfA的负载载体显著增强了该核酸疫苗的免疫保护效果。

关键词

禽致病性大肠杆菌菌影; flfA基因; 核酸疫苗; 免疫效果

鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis)属于巴氏杆菌科鸡杆菌属，是定殖于禽类上呼吸道和下生殖道的一种常在菌，最近研究表明其也是肠道正常菌群的组成部分之一^[1-3]。作为条件性致病菌，该菌感染蛋鸡后可导致输卵管囊肿、输卵管炎、败血症、卵巢炎和腹膜炎等疾病，进而引发产蛋量下降和死亡率上升，特别是在鸡处于免疫抑制或应激条件下，更易引发呼吸道、生殖道和全身性疾病，加剧其他病原体的感染，对家禽养殖业的经济效益造成严重危害^[1,4-5]。早在2011年，王珊等^[6]对河南、山东和山西等省份进行流行病学调查，发现这些地区部分鸡群的阳性率分别为23.12%、25.27%和52.94%。2023年，张家浩^[7]对新疆部分地区蛋鸡群的鸭源鸡杆菌感染情况进行了调查，发现阿克苏、喀什及和田地区的检出率分别为22.00%、13.79%及9.59%。此外，贵州、辽宁、四川、湖北等地也有鸭源鸡杆菌感染的报道^[8-11]。目前，国内外分离的鸭源鸡杆菌菌株普遍存在多重耐药性问题^[1,12]，且尚无商品化的鸭源鸡杆菌疫苗，给该病的预防与控制带来了很大困难。Kudirkienė等^[13]针对鸭源鸡杆菌的菌毛蛋白FlfA开展了免疫相关研究，证明重组蛋白FlfA不仅能诱导机体产生较高且持久的抗体水平，还能提高对鸭源鸡杆菌感染后的损伤保护作用，从而证实了菌毛蛋白FlfA是鸭源鸡杆菌的重要保护性抗原。

细菌菌影(bacterial ghosts, BG)是通过基因工程、物理或化学方法在细菌包膜上形成跨膜孔道，导致细胞质内容物(包括DNA)通过穿孔膜流失后而形成的细菌空壳，其保留了与活菌表面相似的抗原成分和结构，不仅本身具有良好的免疫效果和低廉的成本，可以作为有效的候选疫苗和佐剂^[14-16]，而且菌影空壳内可装载外源物质，易被免疫细胞识别并捕获，因此可作为蛋白质、核酸、药物和可溶性化合物等物质的递送系统用^[17-18]。

疫苗是预防和控制家禽传染病最重要的手段之一。鉴于鸭源鸡杆菌对养鸡业，尤其是对蛋鸡的危害，以及其易与大肠杆菌、鸡传染性支气管炎病毒等病原体混合感染的特点，研制用于预防和控制该菌感染的疫苗显得尤为必要。因此，本研究以鸭源鸡杆菌菌毛基因flfA为目的基因，选用携带鸡的β肌动蛋白启动子的pCAGGS-HA质粒作为表达载体，构建pCAGGS-flfA真核表达质粒。随后构建温控载体，并将其转化至致病性大肠杆菌分离株以制备菌影，最后将pCAGGS-flfA装载入菌影，探究其对鸡的免疫保护效果，旨在为预防鸭源鸡杆菌感染奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

鸭源鸡杆菌PDS-RZ-1-SLG分离株、对氨苄青霉素敏感的禽致病性大肠杆菌10号分离株均由本实验室分离并保存。pCAGGS-HA质粒为本实验室保存，pBV220质粒由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所惠赠。

1.2 主要试剂

限制性内切酶及T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；细菌基因组DNA抽提试剂盒、质粒提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；胶回收及纯化试剂盒购自Omega Bio-Tek公司；脂质体3000转染试剂盒购自上海碧云天生物技术股份有限公司；血琼脂平板购自郑州人福博赛生物技术有限责任公司；brain heart infusion (BHI)培养基购自BD公司；胎牛血清购自河南润研生物科技有限公司；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的兔抗鸡IgG二抗及山羊抗兔IgG二抗均购自Proteintech公司；抗鸭源鸡杆菌多克隆抗体、pET32a-FlfA纯化蛋白均由河南农业大学传染病教研室制备并保存。

1.3 试验动物

50只1日龄雏鸡购自郑州正德农牧科技有限公司，经泄殖腔和咽拭子检测无G. anatis。

本研究获得了河南农业大学动物伦理委员会批准，批准号为HNND2025011701。

1.4 重组质粒的构建与鉴定

根据GenBank中G. anatis 12656-12的flfA基因序列，利用Primer 5.0软件设计一对特异性引物flfA-F (5′-CCGGAATTCATGAAAAAATTG CTTTTAA-3′)和flfA-R (5′-CGGGGTACCCGGTT ATTCGTATGCGATAGT-3′)用于扩增G. anatis flfA目的基因，在引物的5′端分别引入EcoR I和Kpn I酶切位点，目标基因扩增长度为597 bp。PCR反应体系(25 μL)：2×Taq DNA Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，G. anatis基因组1 μL，ddH₂O补足至25 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40个循环；72 ℃终延伸10 min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶回收目的基因与pMD18T载体连接，转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进一步提取pMD18T-flfA质粒，经EcoR I和Kpn I双酶切、胶回收flfA基因片段，同步对pCAGGS-HA载体进行酶切与胶回收，随后将flfA目的基因经T4 DNA连接酶连接至pCAGGS-HA载体，转化DH5α感受态细胞，均匀涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，置于37 ℃恒温培养箱培养过夜。挑选单克隆菌进一步进行PCR鉴定和双酶切鉴定。

1.5 重组质粒的体外表达

将生长良好的HD11细胞以每孔2×10⁶个细胞接种于6孔细胞培养板中，待细胞长至约90%时，弃去培养基，并用PBS洗涤3次，按照脂质体3000转染试剂盒的说明书将2 μg pCAGGS-flfA重组质粒与2 μg转染试剂分别转染至6孔细胞培养板中的细胞中，在37 ℃细胞培养箱中培养6 h后，弃去培养基，更换为含有2%血清和1%双抗的1640培养基继续培养48 h。弃去培养基，用PBS洗涤细胞3次，并用细胞裂解液在冰上裂解30 min。用细胞刮将细胞刮下，以8 000 r/min离心5 min后，吸出上清液后进行SDS-PAGE，取适量样品进行蛋白电泳转膜。用5%脱脂奶稀释的鸭源鸡杆菌多克隆抗体(1:1 000稀释)，在4 ℃孵育过夜，经3次洗涤后加入HRP标记的羊抗兔多克隆抗体(1:10 000稀释)，在室温下120 r/min孵育1 h，加入ECL显色液进行显影。

1.6 禽致病性大肠杆菌菌影的制备与鉴定

1.6.1 重组质粒pBV-E-SN的构建

参照文献[19]的方法，根据GenBank上噬菌体PhiX174裂解基因E编码的基因序列和金黄色葡萄球菌核酸酶A (SN)编码的基因序列，设计将E基因和SN基因通过3个重复的(Gly-4-Ser)序列(共15个氨基酸)作为Linker连接起来，合成E-SN串联基因并克隆至pBV220载体上构建重组质粒pBV-E-SN，E-SN串联基因的合成及其与pBV220载体的连接由苏州金维智生物科技有限公司完成。

1.6.2 重组菌DH5α溶菌动力学试验

为了验证pBV-E-SN是否能在菌体内正常表达其溶菌功能，选取已合成、连接并转化至大肠杆菌DH5α的重组菌进行试验，挑取转化的单菌落接种于含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中。参照文献[13]的方法，诱导菌影的形成并绘制溶菌动力曲线。同时，在升温诱导前、后分别收集100 μL菌液进行倍比稀释后，取100 μL均匀涂布于含有100 μg/ mL氨苄青霉素的LB平板上进行细菌计数(colony-forming unit, CFU)，根据对诱导前后的菌落计数结果，计算裂解率，如公式(1)所示。

裂解率=(1-诱导后CFU/诱导前CFU)×100%

(1)

1.6.3 禽致病性大肠杆菌菌影的制备及转化

参照文献[19]的方法，将禽致病性大肠杆菌分离株在37 ℃振荡培养至OD₆₀₀值约为0.4，制备电转化感受态细胞。取10 μL经去盐离子处理的重组质粒pBV-E-SN，加入到制备的电转化禽致病性大肠杆菌感受态细胞中，冰浴10 min，将重组质粒和电转化感受态细胞的混合物倒入预先冷却的电转杯中进行电转化，电转化参数设置为电阻200 Ω，电容25 μF，电压设置不同值以摸索最适电压。电转结束后，按照文献[19]的方法处理转化物，并将其涂布在含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，于28 ℃培养24 h至菌落出现，挑取转化子进行菌液PCR鉴定。

1.6.4 禽致病性大肠杆菌菌影的溶菌动力学及裂解率测定

将经划线接种鉴定为阳性的禽致病性大肠杆菌重组菌，28 ℃、200 r/min培养过夜后，按照1.6.2所述方法测定其菌影的溶菌动力学，并根据结果计算裂解率。

1.6.5 禽致病性大肠杆菌菌影扫描电镜观察

将1.6.3中制备的禽致病性大肠杆菌菌影4 ℃、3 000 r/min离心10 min后，用浓度为2.5%的戊二醛溶液在常温固定2 h，经过一系列处理后使用扫描电子显微境观察菌影的形态。

1.7 菌影疫苗的制备与检验

1.7.1 冻干菌影的无菌检测

将禽致病性大肠杆菌菌影进行真空冷冻干燥处理，取5 mg菌影冻干粉重悬于0.01 mol/mL的无菌PBS中，并调整浓度至1.0×10⁸ CFU/mL。将此溶液涂布于含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37 ℃培养48 h。若培养板上无菌落生长，则表明菌影已完全失活，重复3次。

1.7.2 禽致病性大肠杆菌菌影装载pCAGGS-flfA质粒及无菌检验

将菌影冻干粉重悬于含有pCAGGS-flfA质粒(浓度1 mg/mL)的100 μL缓冲液中，加入CaCl₂使终浓度达到50 mmol/L，在37 ℃、200 r/min振荡孵育30 min。菌影重悬液振荡孵育后于4 ℃、8 000 r/min离心5 min，分别收集沉淀和上清，沉淀用PBS缓冲液洗涤3次后，用PBS缓冲液重悬沉淀，-20 ℃保存备用，同时测定上清中质粒DNA的浓度，计算装载率，如公式(2)所示。

装载率=(1-上清中DNA浓度/装载前质粒浓度)×100%

(2)

同时取200 μL制备的菌影装载核酸疫苗，涂布于含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养板上，在37 ℃下培养48 h，以检测是否有细菌生长。

1.8 菌影疫苗对鸡的免疫保护效果

1.8.1 动物分组、免疫及攻毒程序

将50只1日龄雏鸡适应性饲养至1周龄后，随机分为5组，具体分组情况如下：I-Ⅳ组均为10只鸡/组，分别免疫pCAGGS-flfA质粒、BG负载pCAGGS-flfA质粒、BG对照组、PBS作为未免疫攻毒组；V组(control组)为正常饲养组，通过肌内注射进行免疫，具体免疫程序与剂量见表1。首免后2周进行2次加强免疫，首免4周后对鸡攻毒，攻毒参照文献[14]的模型并稍作改动，通过肌内注射途径将鸭源鸡杆菌PDS-RZ-1-SLG株以1×10⁹ CFU/只感染试验鸡，观察鸡在7 d内的发病情况，并通过排菌及脏器载菌率评价保护效果。

表1  动物免疫和攻毒分组方案

Table 1  Experimental scheme for animal immunization and challenge

组别Group	免疫物 Immune substance	鸡只数量 Number of chickens	免疫剂量 Immunization dose	免疫途径 Route of vaccination	攻毒毒株 Challenge strain	攻毒剂量 Challenge dose (CFU)	攻毒途径 Route of challenge
I	pCAGGS-flfA质粒 pCAGGS-flfA plasmid	10	100 µg	肌内注射 Intramuscular injection	G. anatis	1×109	肌内注射Intramuscular injection
II	BG装载pCAGGS-flfA质粒BG loading pCAGGS-flfA plasmid	10	1×108 CFU (100 µg)	肌内注射 Intramuscular injection	G. anatis	1×109	肌内注射Intramuscular injection
III	空菌影 Empty bacterial ghosts	10	1×108 CFU	肌内注射Intramuscular injection	G. anatis	1×109	肌内注射Intramuscular injection
Ⅳ	PBS	10	100 µL	肌内注射Intramuscular injection	G. anatis	1×109	肌内注射Intramuscular injection
V	PBS	10	100 µL	肌内注射Intramuscular injection		/

/表示V组不做攻毒处理。

/ indicates that group V will not undergo poison attack treatment.

1.8.2 排菌检测

首免4周后攻毒，随后每24 h采集各组鸡的咽拭子和泄殖腔拭子，每份拭子加入500 μL含有30%甘油的无菌PBS中，充分涡旋振荡后冻存于-80 ℃，后期使用PCR检测病毒排菌情况，PCR所用引物同1.4的flfA引物。

1.8.3 ELISA检测抗体水平

首次免疫前与免疫后每周翅下静脉采血，分离血清以测定抗G. anatis血清抗体水平，具体操作如下：使用纯化的pET32a-FlfA蛋白作为包被抗原(100 ng/孔)，在37 ℃孵育4 h后，转至4 ℃过夜。使用PBST洗涤3次后，用5%脱脂牛奶(200 μL/孔)在37 ℃下封闭1 h。再次用PBST洗涤3次后，加入100 μL待测血清(1:800稀释)于反应孔中，每个样本设置3个重复孔，在37 ℃孵育1 h；PBST洗涤3次后每孔加入100 μL HRP标记的兔抗鸡IgG二抗(1:8 000稀释)，37 ℃孵育1 h；再次用PBST洗涤3次后在各反应孔中加入100 μL TMB单组分显色液，37 ℃显色15 min；最后在各孔中加入终止液以终止反应，并在酶标仪上测定OD₄₅₀处的吸光度值。

1.8.4 组织脏器中细菌载量检测

攻毒后7 d，对所有存活鸡进行安乐死，并进行剖检，观察并记录临床剖检病变。采集各组鸡的上颚裂、气管、肺脏、脾脏和肝脏。使用荧光定量PCR方法测定各组织中的细菌载量。鸭源鸡杆菌flfA基因的荧光定量PCR方法建立如下：首先根据G. anatis flfA基因设计荧光扩增引物flfA-q-F (5′-ACCTTATGCGGAACAAACT AAAG-3′)和flfA-q-R (5′-CCTGCCGGATTAGT TGCATA-3′)，扩增片段大小109 bp。PCR反应体系：2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL，上、下游引物flfA-q-F 和flfA-q-R (10 μmol/L)各0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH₂O 10.5 μL。PCR反应程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收克隆至pMD18T载体构建pMD18T-flfAq重组质粒，测定质粒浓度为66 ng/µL，根据公式(3)计算重组质粒的拷贝数。

拷贝数(number of copies)=(质粒浓度ng/μL×6.02×1023)/(DNA length×109×660 Da/bp)

(3)

换算得到标准品质粒拷贝数为2.7×10¹⁰ copies/μL。

将pMD18T-flfAq质粒标准品进行10倍倍比稀释，得到浓度1.0×10⁴-1.0×10⁸ copies/μL的系列溶液，以最佳反应条件建立检测鸭源鸡杆菌flfA基因拷贝数的荧光定量PCR标准曲线，扩增引物为flfA-q-F (5′-ACCTTATGCGGAACAA ACTAAAG-3′)和flfA-q-R (5′-CCTGCCGGATT AGTTGCATA-3′)。PCR反应体系(20 μL)：2×Taq DNA Master Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，稀释pMD18T-flfAq模板2 μL，ddH₂O补足20 μL。PCR反应程序：95 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s，53 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，共40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。采集荧光信号得到扩增产物的熔解曲线，以质粒拷贝数的对数为横坐标、相应的循环阈值(C_q)为纵坐标，建立标准曲线。以稀释后的标准质粒为模板和优化过后的反应条件进行荧光定量PCR扩增，每个稀释度重复3次，并绘制荧光定量标准曲线。

为了测定各组织器官中的鸭源鸡杆菌载量，称量0.1 g组织并使用DNA提取试剂盒提取总DNA，使用实时荧光定量PCR方法测定各个器官中的细菌拷贝数。

1.9 数据统计分析

使用统计软件GraphPad Prism 9进行数据分析和绘图，数据以mean±SD表示，并采用t检验分析和单因素方差分析进行数据分析，P<0.05表示有统计学意义(差异显著)。

2 结果与分析

2.1 重组质粒pCAGGS-flfA的成功构建

如图1A所示，通过PCR扩增获得了长度为597 bp的G. anatis flfA基因片段。将其克隆至pMD18T载体中，经EcoR I和Kpn I双酶切鉴定，PCR扩增片段的大小约为597 bp (图1B)，与预期相符。如图1C所示，重组质粒pMD18T-flfA被切成大小约为2 692 bp和597 bp的2个片段，这也与预期结果一致，表明pMD18T-flfA质粒克隆成功。进一步地，将鉴定正确的pMD18T-flfA与pCAGGS-HA载体分别进行EcoR I和Kpn I双酶切，回收目的片段克隆至载体质粒上构建pCAGGS-flfA，该质粒经PCR以及双酶切鉴定，结果如图1D所示，PCR片段大小与上述一致。如图1E所示，经过双酶切处理重组质粒pCAGGS-flfA被切成4 807 bp和597 bp左右2个大小片段，进一步进行序列测定后，证实pCAGGS-flfA构建成功。

图1  重组质粒pCAGGS-flfA的构建与鉴定。A：flfA基因的扩增(泳道M：DL2000 DNA Marker；泳道1-8：目的基因flfA；泳道9：阴性对照)；B：pMD18T-flfA的PCR鉴定(泳道M：DL4500 DNA Marker；泳道1-9：G. anatis flfA基因PCR产物；泳道10：阴性对照)；C：pCAGGS-flfA的PCR鉴定(泳道M：DL5000 DNA Marker；泳道1：未酶切pMD18T-flfA；泳道2：双酶切pMD18T-flfA)；D：pMD18T-flfA的酶切鉴定(泳道M：DL2000 DNA Marker；泳道1-15：G. anatis flfA基因PCR产物；泳道16：阴性对照)；E：pCAGGS-flfA的酶切鉴定(泳道M：DL5000 DNA Marker；泳道1：未酶切pCAGGS-flfA；泳道2：双酶切pCAGGS-flfA)。

Figure 1  Construction and identification of recombinant plasmid pCAGGS-flfA. A: Amplification of flfA gene (Lane M: DL2000 DNA Marker; Lanes 1-8: Target gene flfA; Lane 9: Negative control); B: PCR identification of pMD18T-flfA (Lane M: DL4500 DNA Marker; Lanes 1-9: PCR products of G. anatis flfA gene; Lane 10: Negative control); C: PCR identification of pCAGGS-flfA (Lane M: DL5000 DNA Marker; Lane 1: PMD18T-flfA without enzymatic digestion; Lane 2: Double enzyme digestion of pMD18T-flfA); D: Enzyme digestion identification of pMD18T-flfA (Lane M: DL2000 DNA Marker; Lanes 1-15: PCR products of G. anatis flfA gene; Lane 16: Negative control); E: Enzyme digestion identification of pCAGGS-flfA (Lane M: DL5000 DNA Marker; Lane 1: pCAGGS-flfA not digested; Lane 2: Double enzyme digestion of pCAGGS-flfA).

2.2 pCAGGS-flfA的体外表达

为验证重组质粒pCAGGS-flfA能否正确表达鸭源鸡杆菌FlfA蛋白，将质粒pCAGGS-flfA转染至HD11细胞后进行裂解，收取裂解后上清，用兔抗鸭源鸡杆菌多克隆抗体作为一抗，HRP标记的山羊抗兔IgG作为二抗进行Western blotting检测。如图2所示，可以检测到与鸭源鸡杆菌FlfA蛋白分子量相符的约22 kDa的蛋白条带，表明重组质粒pCAGGS-flfA能够正确表达鸭源鸡杆菌FlfA蛋白。

图2  Western blotting鉴定pCAGGS-flfA体外表达。泳道M：预染蛋白质分子量标准15-150 kDa Marker；泳道1：pCAGGS-flfA体外表达；泳道2：β-actin内参；泳道3：pCAGGS载体体外表达。

Figure 2  Western blotting analysis of pCAGGS-flfA expression in vitro. Lane M: Pre-strained protein molecular weight standards 15-150 kDa Marker; Lane 1: Expression of pCAGGS-flfA in vitro; Lane 2: β-actin internal reference; Lane 3: Expression of pCAGGS in vitro.

2.3 禽致病性大肠杆菌菌影的成功制备

2.3.1 重组质粒pBV-E-SN的构建

将E基因和SNA基因通过15个氨基酸(Gly-4-Ser)的Linker连接起来，合成E-SN基因并将其连接至pBV220载体上，同时将构建好的质粒转化至大肠杆菌DH5α中，筛选出重组质粒pBV-E-SN，进一步经PCR鉴定(图3)、EcoR I和Sal I双酶切鉴定(图4)，获得分别为3 665 bp和770 bp左右2个片段，与预期片段大小一致，同时经序列测定证明pBV-E-SN构建成功。

图3  pBV-E-SN的PCR鉴定。泳道M：DL4500 DNA Marker；泳道1-5：E-SN的PCR产物；泳道6：阴性对照。

Figure 3  PCR identification of pBV-E-SN. Lane M: DL4500 DNA Marker; Lanes 1-5: PCR products of CDS of E-SN gene; Lane 6: Negative control.

图4  pBV-E-SN的酶切鉴定。泳道M：DL10000 DNA Marker；泳道1：Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切pBV-E-SN质粒；泳道2：pBV-E-SN质粒对照。

Figure 4  Enzyme digestion identification of pBV-E-SN. Lane M: DL10000 DNA Marker; Lane 1: The pBV-E-SN plasmid was digested by Sal I and EcoR I; Lane 2: pBV-E-SN plasmid.

2.3.2 重组菌DH5α溶菌动力学检测结果

经验证，pBV-E-SN能在DH5α中正常表达其溶菌功能。将重组菌在28 ℃下培养至OD₆₀₀为0.4后，迅速升温至42 ℃以诱导细菌裂解。在诱导后的30 min内，OD₆₀₀吸光度值短暂上升，随后开始下降，直至诱导210 min之后，OD₆₀₀吸光度值基本保持稳定。相比之下，未诱导的对照组在28 ℃培养过程中，OD₆₀₀吸光度值持续上升(图5)。通过活菌菌落计数测定裂解率，结果显示诱导前细菌菌液的活菌数为4.1×10⁸ CFU/mL，诱导后细菌菌液的活菌数为2.0×10⁵ CFU/mL，重组DH5α经升温诱导后有99.95%的细菌成功裂解。

图5  含有pBV-E-SN的DH5α的裂解动力学曲线

Figure 5  Lysis dynamics curves of DH5α containing pBV-E-SN.

2.3.3 禽致病性大肠杆菌菌影的制备及溶菌动力学测定结果

在电阻200 Ω、电容25 μF、电压1.8 kV的电转参数下，将pBV-E-SN电转入禽致病性大肠杆菌感受态细胞中，挑取并鉴定阳性单克隆，进一步进行溶菌动力学测定。结果显示，将重组禽致病性大肠杆菌在28 ℃下培养至OD₆₀₀为0.4后，迅速升温至42 ℃诱导细菌裂解。在诱导30 min内，OD₆₀₀吸光度值短暂上升，随后开始下降，直至诱导后180 min，OD₆₀₀吸光度值达到最低，而未诱导对照组在培养过程中OD₆₀₀吸光度值持续上升(图6)。通过活菌菌落计数测定裂解率，结果显示诱导前细菌菌液的活菌数为3.4×10⁸ CFU/mL，诱导后细菌菌液的活菌数为2.0×10⁵ CFU/mL，裂解率为99.94%。

图6  含有pBV-E-SN的禽致病性大肠杆菌的裂解动力学曲线

Figure 6  Lysis dynamics curves of avian pathogenic Escherichia coli containing pBV-E-SN.

2.3.4 禽致病性大肠杆菌的菌影扫描电镜观察

在42 ℃诱导培养后，通过扫描电镜观察制备的菌影，可见细菌中央形成了跨膜孔道结构，细菌表面呈现皱缩状态，但整体形态未发生明显改变，仍保持着完整的杆状结构(图7B)。

图7  禽致病性大肠杆菌的菌影扫描电镜图。A：溶菌前正常的大肠杆菌细胞；B：大肠杆菌菌影，黄色箭头指向中间形成的跨膜通道。

Figure 7  Scanning electron micrograph of avian pathogenic Escherichia coli ghosts. A: Normal E. coli cells before lysis mediated by controlled expression of gene E+SN; B: Ghost cells of E. coli, the yellow arrow points to the 1ysis channel formed at the middle portion of bacterial cell.

2.4 菌影疫苗的制备及其对鸡的免疫保护效果

2.4.1 菌影冻干粉与菌影装载DNA疫苗的无菌检测

将禽致病性大肠杆菌菌影冻干粉稀释液及菌影装载的DNA疫苗分别均匀涂布于LB固体培养基上培养，将平板倒置于37 ℃培养箱培养过夜。结果显示，平板上均无活菌生长，证明菌影及其装载的质粒无菌检验合格。

2.4.2 临床症状观察

第2次免疫14 d后，分别对I-Ⅳ组攻鸭源鸡杆菌，在攻毒后7 d内各组均无死亡现象，但Ⅲ组(空菌影组)和Ⅳ组(攻毒对照组)的部分鸡在攻鸭源鸡杆菌后第2天有羽毛松乱、精神不振、拉稀的现象，第4天逐渐恢复正常。其余组与正常对照组无明显临床差异。

2.4.3 排菌检测

在攻毒后1-7 d内每间隔24 h分别收集各组鸡的泄殖腔拭子和咽拭子，以检测各组鸡的排毒情况。攻鸭源鸡杆菌组鸡的排菌情况如表2和表3所示，免疫组的鸡在攻毒2 d、3 d后停止排菌，而未免疫的攻毒组所有鸡持续排菌直至试验结束，对照组的所有拭子样本均为阴性。

表2  泄殖腔拭子中检测的Gallibacterium anatis

Table 2  Detection of Gallibacterium anatis in cloacal swabs

组别 Group	免疫物质 Immune substance	攻毒菌株 Challenge strain	存活数 Survival numbers	排菌 Shedding bacteria (d)
				1	2	3	4	5	6	7
I	pCAGGS-flfA质粒 pCAGGS-flfA plasmid	G. anatis	10/10	0/10	1/10	3/10	0/10	0/10	0/10	0/10
II	BG负载pCAGGS-flfA质粒 BG loading pCAGGS-flfA plasmid	G. anatis	10/10	0/10	1/10	2/10	0/10	0/10	0/10	0/10
III	BG	G. anatis	10/10	0/10	4/10	10/10	10/10	10/10	10/10	10/10
Ⅳ	PBS	G. anatis	10/10	0/10	3/10	10/10	10/10	10/10	10/10	10/10
V	PBS	-	10/10	0/10	0/10	0/10	0/10	0/10	0/10	0/10

I-V：分别代表pCAGGS-flfA质粒组、BG负载pCAGGS-flfA质粒组、BG对照组、未免疫攻毒组、正常对照组；-表示V组不做攻毒处理。

I-V: Representing pCAGGS-flfA plasmid group, BG-loaded pCAGGS-flfA plasmid group, BG control group, non-immune challenge group and normal control group, respectively; - indicates that Group V will not undergo poison attack treatment.

表3  咽拭子中检测的Gallibacterium anatis

Table 3  Detection of Gallibacterium anatis in throat swabs

组别 Group	免疫物质 Immune substance	攻毒菌株Challenge strain	存活数 Survival numbers	排菌 Shedding bacteria (d)
				1	2	3	4	5	6	7
I	pCAGGS-flfA质粒 pCAGGS-flfA plasmid	G. anatis	10/10	0/10	1/10	3/10	0/10	0/10	0/10	0/10
II	BG装载pCAGGS-flfA质粒 BG loading pCAGGS-flfA plasmid	G. anatis	10/10	0/10	1/10	2/10	0/10	0/10	0/10	0/10
III	BG	G. anatis	10/10	0/10	3/10	8/10	10/10	10/10	10/10	10/10
Ⅳ	PBS	G. anatis	10/10	0/10	4/10	8/10	10/10	10/10	10/10	10/10
V	PBS	-	10/10	0/10	0/10	0/10	0/10	0/10	0/10	0/10

I-V：分别代表pCAGGS-flfA质粒组，BG负载pCAGGS-flfA质粒组，BG对照组，未免疫攻毒组，正常对照组；-表示V组不做攻毒处理。

I-V: Representing pCAGGS-flfA plasmid group, BG-loaded pCAGGS-flfA plasmid group, BG control group, non-immune challenge group and normal control group, respectively; - indicates that Group V will not undergo poison attack treatment.

2.4.4 免疫后特异性抗体水平监测

免疫1周龄鸡后，每隔7 d通过翅下静脉采血，分离并收集血清，使用间接ELISA法测定特异性抗体反应。结果如图8所示，首免7 d后，III组(空菌影组)和Ⅳ组(PBS组)抗体升高不明显，与对照组无显著差异；I组与II组2个免疫组的抗体水平逐渐升高，与对照组相比抗体水平均差异极显著，但2个免疫组之间无显著差异；二免后I组和II组抗体水平均快速升高，且随时间延长II组抗体水平显著高于I组，结果说明免疫质粒组的抗体水平显著低于菌影负载质粒组。

图8  抗鸭源鸡杆菌特异性IgG抗体水平。A：折线图；B：柱状图。I-V：分别代表pCAGGS-flfA质粒组，BG负载pCAGGS-flfA质粒组，BG对照组，未免疫攻毒组，对照组。

Figure 8  Serum specific IgG antibody against G. anatis. A: Line figure; B: Bar graph. I-V : Representing pCAGGS-flfA plasmid group, BG-loaded pCAGGS-flfA plasmid group, BG control group, non-immune challenge group and control group, respectively. ***: P<0.001.

2.4.5 荧光定量PCR标准曲线的建立

选取1×10³-1×10⁸ copies/μL稀释度的pMD18T-flfA质粒为模板进行SYBR Green I荧光定量PCR，采用Bio-Rad CFX Maestro 软件对荧光定量结果进行分析，可知标准曲线斜率为-3.063，纵截距为37.947。以拷贝数为x、C_q值为y建立的标准曲线方程为y=-3.063x+37.947，相关系数R²为0.992，扩增效率为112.1%，标准曲线与熔解曲线分别见图9与图10。

图9  Gallibacterium anatis SYBR Green I荧光定量PCR标准曲线

Figure 9  SYBR Green I quantitative real-time PCR stand curve of Gallibacterium anatis.

图10  Gallibacterium anatis SYBR Green I荧光定量PCR熔解曲线

Figure 10  SYBR Green I quantitative real-time PCR melting curve of Gallibacterium anatis.

2.4.6 组织脏器中细菌载量结果

用鸭源鸡杆菌的荧光定量PCR方法测定脾、肝、气管、上颚裂和肺的细菌载量，结果如图11所示。攻毒后，I组(pCAGGS-flfA质粒)与II组(BG负载pCAGGS-flfA质粒) 2个免疫组试验鸡只的肝、气管、上颚裂和肺组织中的细菌拷贝数显著低于III组(空菌影组)及未免疫攻毒Ⅳ组，且质粒免疫组(I组)的细菌拷贝数显著高于菌影负载质粒组(II组)。

图11  各组织器官中鸭源鸡杆菌载量分析。I-V：分别代表pCAGGS-flfA质粒组、BG负载pCAGGS-flfA质粒组、BG对照组、未免疫攻毒组、对照组。

Figure 11  Analysis of the load of G. anatis in various tissues and organs. I-V: Representing pCAGGS-flfA plasmid group, BG-loaded pCAGGS-flfA plasmid group, BG control group, non-immune challenge group and control group, respectively. **: P<0.01; ***: P<0.001.

3 讨论与结论

鸡输卵管炎和输卵管囊肿是产蛋鸡的重要疫病，常导致蛋鸡产蛋量下降，特别是当年生的高产母鸡更多见，这些鸡往往发展为慢性卵黄性腹膜炎，其特征是干酪性输卵管炎、输卵管堵塞和输卵管囊肿^[20-21]。鸭源鸡杆菌是引起这类疾病的一个重要病原，它存在于禽类的上呼吸道和下生殖道中，是一种条件性致病菌。最近的研究还发现，它也是鸡肠道正常微生物群的一部分，但能引起蛋鸡产蛋量下降和病死率增加^[2,22]。研究显示鸭源鸡杆菌在我国鸡群中广泛流行，且存在耐药现象^[1]。此外，该菌还能感染人类，引起菌血症和痢疾^[22]，因此具有公共卫生学意义，应引起足够重视。传染病的防治重在预防，目前针对鸭源鸡杆菌引起的感染还尚无商品化疫苗，因此研究安全、有效的疫苗具有重要意义。

国内外研究均证明鸭源鸡杆菌的菌毛蛋白具有良好的免疫原性，是一种理想的疫苗候选蛋白^[7,14]，细菌菌影不仅本身具有良好的免疫效果和低廉的成本，可以作为有效的候选疫苗和佐剂^[8-10]，还可以作蛋白质、核酸和药物等的递送系统用^[17-18]。同时，考虑到禽致病性大肠杆菌不仅也可以引起鸡卵黄性腹膜炎、输卵管堵塞、输卵管囊，而且往往与鸭源鸡杆菌混合感染，如果用该菌做菌影，可以对同型禽大肠杆菌感染起到预防作用，鉴于此，本研究选择禽致病性大肠杆菌作为菌影制备对象，鸭源鸡杆菌的菌毛基因flfA作为核酸疫苗研究对象，选用携带鸡的β肌动蛋白启动子的pCAGGS质粒作为表达载体^[23]，首先制备了禽致病性大肠杆菌菌影，同时以真核表达载体pCAGGS构建了表达鸭源鸡杆菌菌毛蛋白FlfA的重组表达质粒，然后将重组表达质粒以一定比例装载于禽大肠杆菌菌影中，并对上述装载产物进行免疫效果评价。该研究对减少蛋鸡输卵管炎与输卵管囊肿的发生率及养禽业的生物安全和快速发展具有重要意义，将为蛋鸡输卵管炎和输卵管囊肿的防控奠定基础。

在评价菌影负载pCAGGS-flfA质粒的疫苗对鸭源鸡杆菌的免疫保护效果时，无论是通过ELISA检测的特异性IgG抗体水平，还是对鸡泄殖腔拭子和咽拭子排菌情况以及组织脏器中细菌载量的测定，结果均显示菌影负载pCAGGS-flfA质粒组和单独免疫pCAGGS-flfA质粒组的免疫保护效果均远高于其他免疫组，并且与单独免疫pCAGGS-flfA质粒组相比，菌影负载pCAGGS-flfA质粒组的免疫保护效果更为显著，说明菌影作为pCAGGS-flfA的负载载体明显增强了该核酸疫苗的免疫保护效果。总体而言，禽致病性大肠杆菌菌影负载pCAGGS-flfA核酸疫苗对鸭源鸡杆菌感染能够提供较好的保护，然而禽致病性大肠杆菌菌影本身作为疫苗对同型细菌感染的保护作用还有待进一步验证。

作者贡献声明

马立静：实验设计和操作、数据收集和处理、论文撰写和修改；彭泽宇：协助实验操作、数据收集和处理；翟金丽：协助实验操作；于静玥：协助实验操作；王增：技术支持；隗梦蝶：协助实验操作；王新卫：论文讨论、技术支持；陈陆：论文讨论、技术支持；杨霞：实验方案的设计、论文讨论、技术支持、论文撰写和修改。

利益冲突

作者声明不存在任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。