茶花鸡源罗伊特氏黏液乳杆菌<bold>CHF7-2</bold>的益生特性及全基因组测序分析

徐乐，陈诗宇，王上，张志翔，董斌，林秋叶，曹振辉; XU Le; CHEN Shiyu; WANG Shang; ZHANG Zhixiang; DONG Bin; LIN Qiuye; CAO Zhenhui

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茶花鸡源罗伊特氏黏液乳杆菌CHF7-2的益生特性及全基因组测序分析 PDF

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徐乐 ^1,2
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张志翔 ¹
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董斌 ¹
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林秋叶 ³
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曹振辉 ^1,2
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1. 云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明； 2. 云南省动物营养与饲料重点实验室，云南昆明； 3. 云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明

最近更新：2025-03-07

DOI： 10.13343/j.cnki.wsxb.20240642

CSTR： 32112.14.j.AMS.20240642

目录contents

摘要

目的

解析茶花鸡源罗伊特氏黏液乳杆菌CHF7-2的益生特性和安全性，为开发利用该菌株作为饲用微生态制剂提供理论依据。

方法

通过体外试验检测菌株CHF7-2的黏附性能、产酶性能、抑菌功效和抗氧化活性。利用PacBio Sequel II和Illumina NovaSeq 6000平台对菌株CHF7-2进行全基因组测序，并采用多种生物信息学工具和数据库对其基因组进行注释，从分子层面探究其益生机制和安全性。

结果

体外试验研究表明，菌株CHF7-2展现出良好的益生特性和安全性：具有较强的表面疏水性、自凝聚性和一定的抗氧化能力；能有效抑制大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌ATCC 49521、鸡伤寒沙门氏菌CICC 21510和猪霍乱沙门氏菌CVCC 3383的生长；能够产生蛋白酶和脂肪酶；不产生溶血环，表明其饲用安全性。全基因组测序分析结果显示，菌株CHF7-2的基因组大小为2 116 761 bp，平均G+C含量为38.8%，编码基因数量为2 067个。同时，在CHF7-2基因组中发现了Ⅲ类细菌素EnlA合成基因簇，以及多个与耐酸、耐胆盐、耐热胁迫、耐冷胁迫、黏附、抗氧化和有机酸合成相关的抗应激和益生基因，且基因组中未发现毒力和耐药基因。

结论

罗伊特氏黏液乳杆菌CHF7-2是一株具有潜力的益生菌，有望成为饲用微生态制剂的重要候选菌株。

关键词

罗伊特氏黏液乳杆菌; 全基因组测序; 益生特性; 微生态制剂

茶花鸡，又名傣族鸡，主要分布于云南省西双版纳州的景洪市、勐海县和勐腊县境内，是一种由红原鸡(Gallus gallus)经过长期驯化和选育而成的珍稀热带原始鸡种，具有性早熟、耐粗饲、抗病力强和肉质鲜美等特点，已被列入《国家畜禽遗传资源品种名录》(2021年版)^[

1-2]。其生长环境高温高湿，且遗传背景独特，使得其肠道内蕴含着丰富且独特的微生物资源^{[参考文献 3

百度学术}3]，这些微生物在宿主的营养代谢、生理反应和免疫调控过程中发挥着重要作用^{[参考文献 4-5}4-5]。然而，关于茶花鸡肠道益生菌资源的挖掘，尤其是菌种全基因组测序(whole genome sequencing, WGS)分析鲜见相关报道。

本研究所用的菌株CHF7-2，是从西双版纳勐海县曼贺纳村散养的茶花鸡粪便中分离得到的，通过16S rRNA基因序列分析将其鉴定为罗伊特氏黏液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)，在pH 2.0的MRS肉汤培养基和含有0.3%胆盐的MRS肉汤培养基中分别孵育2 h后，其存活率均超过60%，并且对多种β-内酰胺类和氨基糖苷类抗生素敏感，因此被认为是一株具有潜力的益生菌株^[

6]。罗伊特氏黏液乳杆菌属于芽孢杆菌门(Bacillota)乳杆菌科(Lactobacillaceae)粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)，是几乎所有脊椎动物肠道内的天然优势乳酸菌^{[参考文献 7

百度学术}7]。研究表明，罗伊氏黏液乳杆菌在宿主体内可通过增强肠道物理屏障、分泌细菌素抑制病原菌定殖、重塑宿主肠道微生物群落来降低炎症因子产生，进而维护宿主肠道稳态和机体健康^{[参考文献 7-9}7-9]。自2013年起，罗伊特氏黏液乳杆菌已被列入我国《饲料添加剂品种目录》^{[参考文献 10

百度学术}10]，并在2022年国家卫生健康委员会更新的《可用于食品的菌种名单》^{[参考文献 11

百度学术}11]中同样被包含。目前，它已被广泛应用于医药、食品和饲料行业。

然而，随着罗伊特氏黏液乳杆菌在不同物种中被不断鉴定，通过传统方式全面分析其益生、安全等生物学特性变得愈发困难。当前，高通量测序技术的快速发展已成为解决这一问题的关键手段。对益生菌的研究也已深入到基因组学层面，能够检测菌株的耐药和毒力基因，对其安全性进行全面评估，同时快速挖掘益生基因，从而筛选出潜在的益生菌株^[

12]。基于此，本研究结合传统试验手段和细菌全基因组测序技术，探究菌株CHF7-2的黏附性能、抗菌作用、抗氧化活性、产酶性能、溶血活性，并挖掘其潜在的益生功能基因。同时，通过比较基因组学分析，比较CHF7-2与NCBI GenBank数据库下载的27株罗伊特氏黏液乳杆菌的遗传进化关系，以及不同鸡源罗伊特氏黏液乳杆菌对碳水化合物的利用情况，旨在为开发利用菌株CHF7-2作为畜禽养殖微生态制剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株

罗伊特氏黏液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri) CHF7-2为本课题组邹建华等^[

6]采用1%碳酸钙-MRS琼脂培养基，从散养茶花鸡粪便中自主分离获得。大肠杆菌(Escherichia coli) K88、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC 49521、鸡伤寒沙门氏菌(Salmonella gallinarum) CICC 21510、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis) CVCC 3383和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus) GG (LGG)为云南农业大学益生菌课题组保藏。其中，鼠李糖乳杆菌为《GB 4789.35—2023食品微生物学检测乳酸菌检测》^{[参考文献 13

百度学术}13]指定的参照菌株，据此本研究利用LGG作为测定CHF7-2产酶特性和抑菌能力的对照菌株。

1.2 主要试剂和仪器

MRS培养基、LB培养基、哥伦比亚血平板，广东环凯微生物科技有限公司；总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)检测试剂盒、羟自由基清除能力检测试剂盒、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)自由基清除能力检测试剂盒、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)含量检测试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性检测试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；土壤/粪便基因组DNA提取试剂盒(磁珠法)，天根生化科技(北京)有限公司。

产蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶发酵培养基参照Fitri等^[

14]的方法配制；产淀粉酶培养基参照Kanpiengjai等^{[参考文献 15

百度学术}15]的方法配制。

离心机、NanoDrop，ThermoFisher Scientific公司；Qubit荧光计，Invitrogen公司；PacBio Sequel II测序平台，PacBio公司；Illumina NovaSeq6000测序平台，Illumina公司。

1.3 菌株CHF7-2的黏附性能检测

采用微生物黏附碳氢化合物法^[

16] (microbial adhesion to hydrocarbons, MATH)测定菌株CHF7-2的表面疏水性。参考文献[17]测定CHF7-2的自聚集性，以及与病原菌E. coli K88、S. aureus ATCC 49521、S. gallinarum CICC 21510和S. choleraesuis CVCC 3383的共聚集性。3项指标的计算如公式(1)-(3)所示。

疏水性=(1-A₁/A₀)×100%

(1)

自聚集性=(1-A₂/A₀)×100%

(2)

共聚集性={[(A₂+A₃)/2-A₄]/(A₂+A₃)/2}×100%

(3)

式中：A₀为初始菌液的OD₆₀₀值，A₁为与二甲苯混匀后菌液的OD₆₀₀值，A₂为初始菌液静置3 h后上清液的OD₆₀₀值，A₃为病原菌液静置3 h后上清液的OD₆₀₀值，A₄为混合静置5 h后上清液的OD₆₀₀值。

1.4 菌株CHF7-2的产酶性能检测

将活化后的CHF7-2和L. rhamnosus GG菌液分别按1%的体积分数接种于蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶发酵培养基中，培养48 h后检测胞外酶活性，具体方法参照《饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定分光光度法》(GB/T 28715—2012)^[

18]、对硝基苯酚法^{[参考文献 19

百度学术}19]、3,5-二硝基水杨酸法^{[参考文献 20

百度学术}20]和《饲用纤维素酶活性的测定滤纸法》(GB/T 23881—2009)^{[参考文献 21

百度学术}21]。

1.5 菌株CHF7-2的抑菌作用检测

将活化后的CHF7-2和L. rhamnosus GG菌液分别按1%的体积分数接种于MRS肉汤中，37 ℃静置培养16 h后调整OD₆₀₀为0.8，2 800×g离心10 min收集上清。分别吸取37 ℃过夜培养的E. coli K88、S. aureus ATCC 49521、S. gallinarum CICC 21510、S. choleraesuis CVCC 3383菌液20 μL，与LB固体培养基(20 mL、50 ℃)剧烈混合后倾注入培养皿中。使用直径为8 mm牛津杯打孔，将CHF7-2与LGG上清液注入琼脂孔中(100 μL/孔)，37 ℃培养24 h，使用游标卡尺测量抑菌圈直径。

1.6 菌株CHF7-2的抗氧化活性检测

按照试剂盒说明书的方法，检测菌株CHF7-2的胞外产物、胞内产物的总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)、羟自由基清除能力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)自由基清除能力、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)含量以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性。

1.7 菌株CHF7-2的溶血试验

采用滤纸片扩散法测定CHF7-2的溶血能力，将无菌滤纸片紧贴于哥伦比亚血琼脂平板，分别吸取20 μL活化后的CHF7-2菌液和强溶血性的金黄色葡萄球菌液(阳性对照)滴于滤纸片上，37 ℃培养24 h，根据菌落周围是否产生溶血圈判断CHF7-2的溶血能力。

1.8 菌株CHF7-2的全基因组测序分析

1.8.1 菌株CHF7-2基因组提取与测序

将活化后的CHF7-2菌液按1%的体积分数接种于MRS肉汤中进行扩大培养(37 ℃、16 h)，2 800×g离心10 min收集菌体，并用无菌PBS缓冲液洗涤菌体3次。使用土壤/粪便基因组DNA提取试剂盒(磁珠法)提取菌株CHF7-2的高质量基因组DNA。对提取后的核酸采用NanoDrop、Qubit及琼脂糖凝胶电泳检测其浓度和完整性。DNA浓度和完整性达标后，使用BluePippin全自动核酸片段回收系统回收大片段DNA，构建测序文库。完成DNA文库制备后，使用Qubit及Agilent 2100检测文库浓度和大小以确保质量合格，随后采用PacBio Sequel II和Illumina NovaSeq 6000平台进行测序。

1.8.2 CHF7-2基因组序列分析

使用Hifiasm v0.12软件对PacBio Sequel II三代平台数据(长度≥2 000 bp)进行组装(k-mer值设置为51，其他参数均为默认值)，并采用Circlator v1.5.5软件进行环化和调整起始位点。此外，通过Pilon v1.22软件利用Illumina NovaSeq 6000二代测序平台数据进一步纠错，以获得更高准确度的基因组信息。分别利用Rfam v14.1数据库和软件Prodigal v2.6.3、Infernal v1.1.3、tRNAscan-SE v2.0进行编码基因和非编码RNA的预测，并使用Circos v0.66软件绘制CHF7-2的基因组圈图。随后，基于基因本体(gene ontology, GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)数据库，对预测基因进行功能注释。

1.8.3 CHF7-2毒力和抗生素耐药基因检索分析

基于毒力因子数据库(virulence factor database, VFDB) 2022^[

22]和抗生素耐药性综合数据库(the comprehensive antibiotic resistance database, CARD) v3.2.2^{[参考文献 23

百度学术}23]对CHF7-2基因组中可能携带的毒力和抗生素耐药基因进行注释。参照我国农业农村部发布的《直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南》^{[参考文献 24

百度学术}24]的要求，在序列比对时，设置序列相似性≥80%，序列覆盖度≥70%，E-value值<10^-5。

1.9 比较基因组分析

1.9.1 平均核苷酸一致性(average nucleotide identity, ANI)计算

为进一步分析菌株CHF7-2的遗传进化关系，选取27株不同来源且已完成全基因组测序的L. reuteri (表1)，菌株的全基因组数据均来源于NCBI的GenBank数据库。随后，使用FastANI v1.33软件计算菌株CHF7-2与其他L. reuteri菌株间的ANI值，并利用TBtools v2绘制热图。

表1 27株罗伊特氏黏液乳杆菌基因组信息

Table 1 Genomic information of 27 strains of Limosilactobacillus reuteri

Strains	Genome size (Mb)	G+C content (%)	Origin	GenBank ID
L. reuteri FN041	2.4	38.5	Homo sapiens	GCA_024652885.1
L. reuteri M2021619	2.2	39.0	Homo sapiens	GCA_021459965.1
L. reuteri 03	2.3	39.0	Homo sapiens	GCA_030517815.1
L. reuteri MD IIE-43	2.2	39.0	Homo sapiens	GCA_002007085.2
L. reuteri subsp. reuteri DSM 20016	2.0	39.0	Homo sapiens	GCA_000016825.1
L. reuteri ATCC PTA 4659	2.1	39.0	Homo sapiens	GCA_030418275.1
L. reuteri strain reuteri	2.0	39.0	Homo sapiens	GCA_009184725.1
L. reuteri SD-LRE2-IT	2.3	39.0	Homo sapiens	GCA_020023775.1
L. reuteri DS0384	2.2	39.0	Homo sapiens	GCA_021398615.1
L. reuteri VHProbi M07	2.0	39.0	Homo sapiens	GCA_021228055.1
L. reuteri CNEI-KCA3	2.1	39.5	Gallus gallus	GCA_013694365.1
L. reuteri AM_LB1	2.3	39.0	Gallus gallus	GCA_025369755.1
L. reuteri 3632	2.5	38.5	Gallus gallus	GCA_020978285.1
L. reuteri P43	2.1	39.0	Gallus gallus	GCA_033570435.1
L. reuteri SKKU-OGDONS-01	2.3	39.0	Gallus gallus	GCA_003316935.1
L. reuteri 19-E-6	1.9	39.0	Sus scrofa	GCA_020412465.1
L. reuteri ZLR003	2.2	38.5	Sus scrofa	GCA_001618905.1
L. reuteri AN417	2.2	39.0	Sus scrofa	GCA_013348825.1
L. reuteri 121	2.3	39.0	Sus scrofa	GCA_001889975.1
L. reuteri YSJL-12	2.2	39.0	Sus scrofa	GCA_006874665.1
L. reuteri RE225	2.3	38.5	Mus	GCA_030721705.1
L. reuteri M1	2.3	39.0	Mus	GCA_030345055.1
L. reuteri Byun-re-01	2.2	39.0	Mus	GCA_003316895.1
L. reuteri LL7	2.4	39.0	Peromyscus leucopus	GCA_007633215.1
L. reuteri YLR001	2.4	38.5	Bos mutus	GCA_018884225.1
L. reuteri 1B	2.3	39.0	Equuscaballus	GCA_013487925.1
L. reuteri BRD_L17	2.0	39.0	Canis lupus familiaris	GCA_026183435.1

1.9.2 泛-核心基因集构建

通过Prokka v1.14.6^[

25]和Roary v3.13.0^{[参考文献 26

百度学术}26]软件分析CHF7-2与表1中的27株L. reuteri的基因差异，以大于95%的氨基酸一致性为标准统计核心基因数目，泛-核心基因趋势图使用R v4.3.0软件绘制。

1.9.3 系统发育树构建

通过Roary v3.13.0^[

26]软件获得CHF7-2与表1中的27株L. reuteri的核心基因序列，随后使用MEGA 11软件中的邻接(neighbor-joining, NJ)法构建系统发育树(bootstrap值设置为1 000)^{[参考文献 27

百度学术}27]，系统发育树的可视化使用iTol v5 (https://itol.embl.de/)^{[参考文献 28

百度学术}28]完成。

1.9.4 碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes, CAZy)注释

将CHF7-2与表1中的5株鸡源L. reuteri基因组序列上传至dbCAN (http://bcb.unl.edu/dbCAN/)进行注释，统计注释信息并利用TBtools v2绘制热图，以比较不同菌株对碳水化合物的利用差异。

1.10 数据统计及分析

采用SPSS 20.0软件对试验数据进行统计学分析，两组之间的显著性通过t检验进行评估，多组之间使用单因素方差分析(one-way ANOVA)，并依据Duncan氏法进行多重比较检验以确定组间差异性。试验数据以平均值±标准差(mean±SD)表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 菌株CHF7-2的黏附性能

由表2可知，菌株CHF7-2的表面疏水性和自聚集性分别达到了(72.46±0.68)%和(85.61±0.46)%。此外，CHF7-2与4株肠道病原菌(E. coli K88、S. aureus ATCC 49521、S. Gallinarum CICC 21510、S. choleraesuis CVCC 3383)的共聚性分别达到了(18.95±0.15)%、(52.84±0.16)%、(15.65±0.16)%和(13.22±0.10)%。

表2 菌株CHF7-2的表面疏水性、自聚集性以及与病原菌的共聚集性

Table 2 Surface hydrophobicity, self-coagulation and copolymerization with pathogenic bacteria of strain CHF7-2

Item	Result (%)
Hydrophobicity	72.46±0.68
Self-coagulation	85.61±0.46
Copolymerization with E. coli K88	18.95±0.15b
Copolymerization with S. aureus ATCC 49521	52.84±0.16a
Copolymerization with S. gallinarum CICC 21510	15.65±0.16c
Copolymerization with S. choleraesuis CVCC 3383	13.22±0.10d

Data is presented as mean±SD (n=3) and values with different superscript letters are significantly different (P<0.05).

2.2 菌株CHF7-2的产酶性能

如图1所示，菌株CHF7-2具有分泌酸性蛋白酶和脂肪酶的能力，但无淀粉酶和纤维素酶活性。相比之下，菌株LGG仅能合成酸性蛋白酶，且其活性显著低于CHF7-2 (P<0.05)。在发酵培养48 h后，菌株CHF7-2分泌的酸性蛋白酶活性为(18.25±2.11) U/mL，脂肪酶活性为(2.42±0.13) U/mL。

图1 菌株CHF7-2的产酶性能

Figure 1 Enzyme production performance of strain CHF7-2. Data is presented as mean±SD (n=3); * indicates P<0.05.

2.3 菌株CHF7-2的抑菌性能

如图2所示，菌株CHF7-2对E. coli K88、S. aureus ATCC 49521、S. gallinarum CICC 21510和S. choleraesuis CVCC 3383均具有抑菌能力，抑菌圈直径分别为(17.33±0.22) mm、(18.69±0.22) mm、(19.11±0.44) mm和(20.69±0.50) mm，均超过了参考菌株鼠李糖乳杆菌GG (LGG)对4种致病菌的抑菌效果。

图2 菌株CHF7-2的抑菌效果。A：菌株CHF7-2的抑菌效果观察；B：测定菌株CHF7-2抑菌效果时获得的抑菌圈直径(n=3)。

Figure 2 The antibacterial effect of strain CHF7-2. A: Observation of antibacterial effect of strain CHF7-2; B: The diameters of the antibacterial zones obtained when measuring the antibacterial effect of strain CHF7-2 (n=3).

2.4 菌株CHF7-2的抗氧化活性

由图3可知，菌株CHF7-2的胞外产物与胞内产物均具有不同程度的抗氧化能力。其中，胞外产物的总抗氧化能力、SOD活性、GSH含量、DPPH自由基清除率以及羟自由基清除率分别为16.38 μmol/mL、11.33 U/mL、104.91 μg/mL、68.67%和18.48%，均显著高于胞内产物的相应值0.85 μmol/mL (P<0.01)、2.21 U/mL (P<0.01)、20.86 μg/mL (P<0.01)、12.75% (P<0.01)和6.17% (P<0.05)。

图3 菌株CHF7-2胞外产物及胞内产物的抗氧化活性

Figure 3 Antioxidant activity of extracellular and intracellular products of strain CHF7-2. Data is presented as mean±SD (n=3). A: Total antioxidant activity; B: Superoxide dismutase activity; C: Glutathione content; D: DPPH free-radical scavenging rate; E: Hydroxyl radical scavengingrate. *: P<0.05; **: P<0.01.

2.5 菌株CHF7-2的溶血活性

通过以下标准判断菌株的溶血活性：菌落周边出现草绿色溶血环为α-溶血；菌落周边出现较宽的透明圈为β-溶血；菌落周边不出现溶血环为γ-溶血。如图4所示，菌株CHF7-2表现为γ-溶血，阳性对照金黄色葡萄球菌则呈现出β-溶血活性。

图4 菌株CHF7-2的溶血活性

Figure 4 Hemolytic property of strain CHF7-2. S. aureus ATCC 49521 was used as a positive control.

2.6 菌株CHF7-2的全基因组基本特征

利用三代PacBio Sequel II和二代Illumina NovaSeq 6000测序平台对菌株CHF7-2进行全基因组测序，结果显示菌株CHF7-2的基因组序列全长为2 116 761 bp，平均G+C含量为38.8%，由1个染色体和2个质粒构成。编码基因数量为2 067个，其中2 045个位于染色体上，12个和10个分别位于质粒1和质粒2上。所有编码基因的总长度为1 840 680 bp，平均长度为890 bp，编码区占据了基因组总长度的86.96%。此外，非编码RNA含有18个rRNA、70个tRNA以及54个其他类型的非编码RNA (other ncRNA)。菌株CHF7-2的基因组圈图如图5所示，其基因组序列已提交至GenBank数据库，登录号为PRJNA1067331。

图5 菌株CHF7-2的基因组圈图。第1圈：基因组大小；第2圈：基因组正链基因；第3圈：基因组负链基因；第4圈：重复序列；第5圈：tRNA和rRNA (蓝色为tRNA，紫色为rRNA)；第6圈：G+C含量(浅黄色部分表示该区域G+C含量高于基因组的平均G+C含量，蓝色部分则表示该区域G+C含量低于基因组的平均G+C含量)；第7圈：GC-skew (深灰色代表G含量大于C的区域，红色代表C含量大于G的区域)。

Figure 5 Loop diagram of strain CHF7-2 genome. Round 1: Genome size; Round 2: Positive-strand genes in the genome; Round 3: Negative-strand genes in the genome; Round 4: Repeat sequence; Round 5: tRNA and rRNA (Blue represents tRNA, purple represents rRNA); Round 6: G+C content (The light yellow part indicates that the G+C content in this region is higher than the average G+C content of the genome, while the blue part indicates that the G+C content in this region is lower than the average G+C content of the genome); Round 7: GC-skew (Dark gray represents areas with G content greater than C, while red represents areas with C content greater than G).

2.7 基因组功能注释

2.7.1 GO数据库注释结果

基于GO数据库，获得了菌株CHF7-2基因组中编码基因的标准化功能描述信息。注释结果如图6所示，共计1 656个基因得到注释，占全部编码基因的80.12%，与生物学过程(biological process, BP)、细胞组分(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF)相关的基因数分别为1 210、810和1 365个。其中，在生物学过程中，主要涉及的功能包括代谢过程(metabolic process，917个基因)、细胞过程(cellular process，792个基因)、单有机体过程(single-organism process，562个基因)。在细胞组分方面，主要涉及的功能有膜(membrane，475个基因)、膜组成(membrane part，456个基因)、细胞(cell，437个基因)。在分子功能中，主要的功能单位包括催化活性(catalytic activity，983个基因)、结合活性(binding activity，771个基因)和转运活性(transporter activity，130个基因)。

图6 菌株CHF7-2基因组的GO功能分类

Figure 6 GO functional classification of strain CHF7-2 genome.

2.7.2 KEGG数据库注释结果

KEGG数据库可用于分析物种基因组中各基因表达产物的功能及代谢途径。菌株CHF7-2的KEGG注释结果如图7所示，共计1 084个基因被注释到新陈代谢、遗传信息处理和环境信息处理这3大类KEGG一级功能类别中，占全部编码基因的52.44%。其中，参与新陈代谢(metabolism)的基因所占比例最高，其次是遗传信息处理(genetic information processing)，而参与环境信息处理(environmental information processing)的基因数量最少。在参与新陈代谢的基因中，注释到氨基酸生物合成(biosynthesis of amino acids)的基因数最多(62个基因)，其次是嘌呤代谢(purine metabolism，60个基因)、碳代谢(carbon metabolism，51个基因)和嘧啶代谢(pyrimidine metabolism，47个基因)。在参与遗传信息处理的基因中，注释到核糖体的基因数目最多(55个基因)。在参与环境信息处理的基因中，与ABC转运蛋白相关的基因数量最多(43个基因)。

图7 菌株CHF7-2基因组的KEGG代谢通路分类

Figure 7 KEGG metabolic pathway classification of strain CHF7-2 genome.

2.8 细菌素合成基因簇分析

利用在线软件BAGEL4对菌株CHF7-2的抑菌物质信息进行挖掘，其基因组中共鉴定出2个可能与Ⅲ类细菌素Enterolysin A (EnlA)生物合成相关的基因簇(EnlA-1和EnlA-2)，核心肽相似率分别为31.58%和39.04%。对相似度较高的EnlA-2基因簇进行注释(图8)，该基因簇位于菌株CHF7-2基因组的1 497 513-1 517 945 bp，核心肽Enterolysin A位于1 505 219-1 507 960 bp。orf00001编码聚(核糖醇磷酸酯) β-N-乙酰葡糖胺基转移酶[poly(ribitol-phosphate)beta-N-acetylglucosaminyltransferase]；orf00002编码糖基转移酶GlyA (glycosyltransferase GlyA)；orf00003编码dTDP-鼠李糖基转移酶RfbG (dTDP-rhamnosyl transferase RfbG)；orf00004编码假定O-抗原转运蛋白(putative O-antigen transporter)；orf00005编码UDP-吡喃半乳糖变位酶(UDP-galactopyranose mutase)；orf00010编码十一异戊烯磷酸半乳糖磷酸转移酶(undecaprenyl-phosphate galactose phosphotransferase)；orf00011编码假定糖基转移酶(putative glycosyltransferase) CsbB；orf00013编码调节蛋白(regulatory protein) RecX；orf00018编码假定核糖核酸酶样蛋白(putative ribonuclease-like protein) YfkH；orf00020编码内膜转运蛋白(inner membrane transporter) YjeM，可能与细菌素分泌有关。

(待续)

2.9 益生特性相关基因分析

对菌株CHF7-2的益生特性相关基因进行挖掘，结果显示，其基因组中包含16个耐酸基因、1个耐胆盐基因、3个黏附相关基因、7个抗氧化相关基因、6个核黄素生物合成相关基因、1个乙酸生物合成相关基因、6个耐热胁迫基因和1个耐冷胁迫基因(表3)。

表3 菌株CHF7-2具有的益生特性相关基因

Table 3 Genes related to probiotic characteristics of strain CHF7-2

Gene ID	Gene name	Gene product
Acid resistance
GE000509	arcA	Arginine deiminase
GE000477	arcC	Carbamate kinase
GE000510	argR	Transcriptional regulator of arginine metabolism
GE000785	argG	Argininosuccinate synthase
GE000786	argH	Argininosuccinate lyase
GE000561	gadA/B	Glutamate decarboxylase
GE000562	gadC	Glutamate: GABA antiporter
GE000525	atpB	F-type H⁺-transporting ATPase subunit a
GE000526	atpE	F-type H⁺-transporting ATPase subunit c
GE000527	atpF	F-type H⁺-transporting ATPase subunit b
GE000528	atpH	F-type H⁺-transporting ATPase subunit delta
GE000529	atpA	F-type H⁺/Na⁺-transporting ATPase subunit alpha
GE000530	atpG	F-type H⁺-transporting ATPase subunit gamma
GE000531	atpD	F-type H⁺/Na⁺-transporting ATPase subunit beta
GE000532	atpC	F-type H⁺-transporting ATPase subunit epsilon
GE000191	nhaC	Na⁺:H⁺ antiporter, NhaC family
Bile salt resistance
GE000784	cbh	Choloylglycine hydrolase
Production of adhesion molecules
GE001572	efg	Elongation factor G
GE001943	ltaS	Lipoteichoic acid synthase
GE001415	mgs	1,2-diacylglycerol 3-alpha-glucosyltransferase
Oxidative resistance
GE000418	trxR	Thioredoxin reductase (NADPH)
GE000602	trxA	Thioredoxin 1

2.10 毒力和耐药基因检索分析

随着益生菌资源的不断发掘，其安全性问题日益受到关注。本研究将菌株CHF7-2的基因组通过VFDB和CARD数据库对基因组进行了毒力和抗生素耐药基因的检索分析。结果显示，菌株CHF7-2的基因组中不存在毒力因子和耐药基因，因此可以认为菌株CHF7-2是安全的，适用于畜禽养殖等行业的微生态制剂开发。

2.11 平均核苷酸一致性(ANI)分析

ANI分析是通过比较两两基因组之间的同源序列，在全基因组水平上评估不同物种的亲缘关系，通常认为ANI值大于95%为同种^[

29]。本研究选取了表1中的27株不同来源的L. reuteri与菌株CHF7-2进行比较。如图9所示，菌株CHF7-2除与4株猪源L. reuteri、1株人源L. reuteri和1株鼠源L. reuteri的ANI值小于95.00%，与其余菌株的ANI值均大于95.00%，与模式菌株DSM 20016^T的ANI值达到95.38%。值得注意的是，菌株CHF7-2与分离自人源的MD IIE-43菌株具有最高的同源性，其ANI值达到98.01%。因此，上述结果表明菌株CHF7-2属于L. reuteri。

图9 28株罗伊特氏黏液乳杆菌的ANI分析结果

Figure 9 Results of ANI analysis of 28 strains of Limosilactobacillus reuteri.

2.12 泛-核心基因集构建

菌株CHF7-2与表1中27株L. reuteri的泛基因集包含10 069个基因，其中核心基因有1 023个，特有基因高达7 373个。由图10可知，随着L. reuteri基因组数量的增加，泛基因数量呈现增加趋势，而核心基因数量趋于稳定，该现象证实L. reuteri的基因组呈现开放式基因组特征。

图10 泛基因集和核心基因集曲线

Figure 10 Pan-core gene family curve.

2.13 核心基因构建系统发育树

本研究基于菌株CHF7-2与表1中的27株L. reuteri的1 129个核心基因构建系统发育树。如图11所示，28株L. reuteri共分为3大分支，分别命名为分支I、II和III。其中，分支I由3株鼠源L. reuteri (M1、RE225、Byun-re-01)和1株鸡源L. reuteri (SKKU-OGDONS-01)组成，而L. reuteri标准株DSM 20016^T(人源)位于分支III，且与另外4株人源L. reuteri (VHProbi M07、ATCC PTA 4659、reuteri、SD-LRE2-IT)的遗传进化距离较近。值得注意的是，菌株CHF7-2与3株鸡源L. reuteri (CNEI-KCA3、3632、P43)均位于分支II，并且与CNEI-KCA3的遗传进化距离最近，形成一个独立的进化小分支。可见，相同来源的L. reuteri分离株因生存环境相似，其基因组差异较小，因此在系统发育树上存在一定的聚集性。

图11 基于核心基因构建的系统发育树

Figure 11 Phylogenetic tree constructed based on core genes.

2.14 CAZy注释结果

本研究从基因组层面探究了包括菌株CHF7-2在内的6株鸡源L. reuteri (CHF7-2、CNE1-KCA3、AM_LB1、3632、P43和SKKU-OGDONS-01)对碳水化合物的利用潜力。结果表明，6株L. reuteri共注释到4类碳水化合物活性酶，分别为糖苷水解酶类(glycoside hydrolases, GHs)、糖苷转移酶类(glycosyl transferases, GTs)、辅助模块酶类(auxiliary activities, AAs)和碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding modules, CBMs)，其中包含15个GHs家族、11个GTs家族、2个CBMs家族和1个AAs家族(图12)。GHs和GTs的数量最为丰富，共占据全部碳水化合物活性酶的96.90%。在GHs中，GH73家族和GH25家族占据主导地位，它们在6株鸡源L. reuteri中的平均拷贝数分别约为5个和3个；在GTs中，GT4和GT2占据主导地位，它们在上述L. reuteri中的平均拷贝数分别约为6个和7个。

图12 六株鸡源罗伊特氏黏液乳杆菌CAZy数据库注释结果

Figure 12 Annotation results of CAZy database for six chicken-derived Limosilactobacillus reuteri strains.

3 讨论与结论

大量研究表明，生长环境和遗传背景均可影响鸡肠道微生物群落的形成和发育，进而塑造出特定的宿主-微生物共生关系^[

30-31]。云南省是我国地方鸡种质资源最为丰富的省份之一，挖掘其肠道益生菌资源并阐释其益生机制，对于开发地方鸡源微生态制剂、促进养禽业健康发展具有重要意义。本课题组邹建华等^{[参考文献 6

百度学术}6]从茶花鸡粪便中分离得到菌株CHF7-2，经过生理生化试验和16S rRNA基因序列鉴定，确定其为罗伊特氏黏液乳杆菌(L. reuteri)，在前期筛选阶段已发现该菌株具有较强的消化液耐受性和抗生素敏感性等益生特性。基于此，本研究首先探究了CHF7-2的表面疏水性、自聚集性及与肠道病原菌的共聚集性，这些指标与菌株的黏附特性密切相关，是其发挥益生作用的重要前提^{[参考文献 32

百度学术}32]。本研究结果显示，CHF7-2的表面疏水性和自聚集性分别高达72.46%和85.61%，且与4株病原菌的共聚集性均超过13.00%，表明该菌株具有较强的组织黏附能力，可竞争性抑制肠道病原菌的定殖。抑菌试验显示，菌株CHF7-2的上清液对4株肠道致病菌均具有抑制活性。通过BAGEL4软件对其抑菌物质进行挖掘，发现CHF7-2的基因组中存在2个Ⅲ类细菌素Enterolysin A (EnlA)的合成基因簇。EnlA是最早在屎肠球菌(Enterococcus faecalis) LMG 2333中发现的细胞壁降解细菌素，其水解位点位于肽聚糖短肽的l-丙氨酸和d-谷氨酸之间，以及短肽的l-赖氨酸和肽间桥的d-天冬氨酸之间^{[参考文献 33-34}33-34]。细胞壁的破坏使得细胞易受渗透压等外力损伤，进而加速细菌死亡。据此推测，CHF7-2可能通过合成并分泌细菌素EnlA来抑制肠道致病菌。值得注意的是，定殖于肠道内的乳酸菌能够释放抗氧化物质，减少氧化应激引起的肠道损伤，进而维护动物肠道和机体的健康^{[参考文献 35

百度学术}35]。本研究证实菌株CHF7-2的胞外产物具有较强的总抗氧化能力、SOD和GSH活性，以及对DPPH自由基和羟自由基的清除作用，显示出其作为抗氧化剂的潜力。在产酶特性研究中发现，CHF7-2的胞外分泌物具有酸性蛋白酶和脂肪酶活力，但无淀粉酶和纤维素酶活性，这可能会限制其单独作为饲料发酵菌剂的使用。Petrova等^{[参考文献 36

百度学术}36]指出，仅有少量乳酸菌具备分解淀粉的能力，这类乳酸菌被称为淀粉水解乳酸菌(amylolytic lactic acid bacteria, ALAB)，可产生α-淀粉酶、支链淀粉酶、普鲁兰酶。对于纤维素降解过程则主要涉及3类酶：外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和β-葡聚糖酶^{[参考文献 37

百度学术}37]，而在菌株CHF7-2的基因组中未发现上述酶基因。此外，参照《直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南》的要求，对菌株CHF7-2的安全性进行检测，结果显示其无溶血活性，且基因组中无毒力和耐药基因，表明其不具有产生机会性毒力及耐药基因转移的风险。

全基因组测序有助于了解目标菌株的基因组结构及基因功能^[

38]。本研究采用三代PacBio Sequel II和二代Illumina NovaSeq 6000平台对菌株CHF7-2进行全基因组测序分析。其基因组序列全长为2 116 761 bp，平均G+C含量为38.8%，与模式菌株(L. reuteri subsp. reuteri) DSM 20016^T高度相似^{[参考文献 39

百度学术}39]。基于GO功能注释的结果显示，与代谢过程相关的基因数量最多(917个)。KEGG通路注释发现，参与新陈代谢的基因所占比例最高，这与GO功能注释的结果相一致，表明菌株CHF7-2具有较强的营养物质吸收和能量代谢能力，能够适应不同的生存环境。值得注意的是，乳酸菌作为发酵剂使用时会积累大量乳酸，从而对菌体产生酸胁迫。若将其用于动物饲喂，则需抵御pH低于3.0的胃部环境。因此，酸胁迫是乳酸菌发挥益生作用所面临的严峻挑战之一。Wu等^{[参考文献 40

百度学术}40]研究表明，乳酸菌可通过F型质子泵以及Na⁺/H⁺反转运蛋白驱动ATP水解，将H⁺排出胞外以维持胞内pH稳态，从而实现耐酸机制。此外，乳酸菌还可利用谷氨酸脱羧酶将胞内谷氨酸转化为偏碱性的γ-氨基丁酸，此过程会消耗胞内H^+[41]。精氨酸脱氨基酶途径也是乳酸菌抵御酸胁迫的重要方式，该过程利用精氨酸脱亚氨酶和氨基甲酸激酶，催化精氨酸转变为NH₃和CO₂，NH₃结合H⁺以升高胞内pH值^{[参考文献 42

百度学术}42]。菌株CHF7-2的基因组中存在Na⁺/H⁺反转运蛋白和完整的F型质子泵编码基因(nhaC、atpA-atpH)；谷氨酸脱羧酶和γ-氨基丁酸反转运蛋白基因(gadA/B、gadC)；精氨酸脱亚氨酶、氨基甲酸激酶和精氨酸代谢相关基因(arcA、arcC、argR、argG、argH)。动物体消化道中，除胃酸外，胆盐也可破坏乳酸菌细胞结构，导致细胞死亡，而菌株CHF7-2的基因组中具有胆酰甘氨酸水解酶基因(cbh)，可编码胆盐水解酶^{[参考文献 43

百度学术}43]，从而实现对胆盐的抗性。本研究同时发现，菌株CHF7-2的基因组中存在潜在的黏附基因：延伸因子G (efg)、脂磷壁酸合成酶(ltaS)和1,2-二酰基甘油3-α-葡糖基转移酶(mgs)。延伸因子G是一种乳酸菌表面蛋白，可与纤维蛋白原、胶原蛋白和黏蛋白特异性结合^{[参考文献 44

百度学术}44]，而这些蛋白又是肠道上皮细胞必不可少的成分^{[参考文献 45-47}45-47]，因此延伸因子G可参与CHF7-2对肠道的黏附。脂磷壁酸作为革兰氏阳性菌细胞壁的组分，其脂质部分可与上皮细胞纤维连接蛋白受体结合，进而介导黏附过程^{[参考文献 48

百度学术}48]，而ltaS和mgs均为脂磷壁酸合成的关键基因。此外，乳酸菌在成功定殖于动物肠道后或在发酵、保藏过程中会受到氧化胁迫，只有具有较强的抗氧化能力才能最大限度地发挥益生作用。本研究分析显示，菌株CHF7-2的基因组中存在谷氨酸-半胱氨酸连接酶(gshA)、谷胱甘肽还原酶(gsr)、葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(g6pd)等与谷胱甘肽代谢相关的基因。同时，菌株CHF7-2的基因组中还存在硫氧还蛋白系统相关基因：硫氧还蛋白还原酶(trxR)和硫氧还蛋白1 (trxA)。其中，谷胱甘肽系统广泛存在于乳酸菌中，谷胱甘肽除直接作为抗氧化剂中和活性氧(reactive oxygen species, ROS)外，还可作为多种抗氧化和解毒酶的辅因子参与抗氧化过程^{[参考文献 49-50}49-50]。硫氧还蛋白系统则通过将电子提供给硫醇依赖性过氧化物酶，从而快速完成对ROS的清除^{[参考文献 51

百度学术}51]。对代谢产物进行分析显示，菌株CHF7-2的基因组中含有核黄素(ribBA、ribF、ribT、ribD、ribE、ribH)和乙酸合成相关基因(ackA)。核黄素也称维生素B₂，大多数微生物具有合成核黄素的功能，而动物则不能自身合成，其在机体中参与氧化还原反应，起到抗氧化和抗炎作用^{[参考文献 52-53}52-53]。乙酸作为一种短链脂肪酸，可促进动物肠道发育和营养吸收^{[参考文献 54

百度学术}54]。最后，乳酸菌在生产过程中常会遭遇不适宜的冷热环境，需要诱导产生一系列的伴侣蛋白或蛋白酶，以降低或消除冷热胁迫造成的损伤。菌株CHF7-2的基因组中存在包含dnaK、dnaJ、hrcA、grpE、groES、groEL在内的伴侣分子和转录调控因子基因，这些基因可组成DnaK-GrpE-DnaJ和GroES-GroEL伴侣蛋白复合体，HrcA则作为DnaK和GroESL这2个操纵子的负调控蛋白参与对热胁迫的响应^{[参考文献 55

百度学术}55]。冷休克蛋白基因(cspA)也被发现存在于CHF7-2的基因组中，该基因可表达冷休克蛋白，冷休克蛋白作为RNA分子伴侣，能够促进核酸有效折叠，保证菌体在受到冷胁迫时维持核酸的正常转录和翻译^{[参考文献 56

百度学术}56]。

通过对包含CHF7-2在内的28株不同来源的L. reuteri进行ANI分析显示，CHF7-2与罗伊特氏黏液乳杆菌(L. reuteri)模式株DSM 20016^T的ANI值达到95.38%，在全基因组水平上证实其属于L. reuteri。值得注意的是，28株L. reuteri的泛-核心基因集具有开放式特征，泛基因组大小随菌株数量的增加而不断扩大，但核心基因数量却趋于稳定，仅占所有基因的11.21%，这一现象可能源于不同L. reuteri具有产生或接受新遗传物质的能力以适应不同生态环境的需要^[

57]。此外，CAZy注释显示，菌株CHF7-2与其他5株鸡源L. reuteri在GHs和GTs上的注释最为丰富，特别是GH73、GH25家族和GT4、GT2家族。GHs以内切或外切方式水解含糖化合物中的糖苷键，生成单糖、寡糖或糖复合物，而GTs则负责糖苷键的形成，参与糖蛋白、糖脂和多糖的合成^{[参考文献 58-59}58-59]。其中，GT4和GT2主要参与细菌细胞壁中β-1,4-糖苷键、脂磷壁酸和胞外多糖的合成^{[参考文献 60-61}60-61]，可能与菌体的益生功效有关。GH73和GT25则均与细菌溶菌酶的合成相关，特别是GH73可切割细菌肽聚糖中N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和N-乙酰胞壁酸(MurNAc)部分之间的β-1,4-糖苷键，进而参与溶菌过程^{[参考文献 62-63}62-63]，也证实了乳酸菌中普遍存在这2种GHs糖苷酶家族，通过抑菌作用适应宿主复杂的微生物环境^{[参考文献 64

百度学术}64]。

综上所述，罗伊特氏黏液乳杆菌CHF7-2具有良好的黏附性能、抗菌活性和抗氧化活性。同时，其基因组中含有大量潜在的益生基因，且不存在毒力基因和耐药基因。因此，该菌株有望成为饲用微生态制剂的重要候选菌株。

作者贡献声明

徐乐：实验设计、实验操作、数据分析和论文撰写；陈诗宇：实验操作、数据分析和论文撰写；王上：实验操作、数据分析；张志翔：实验操作；董斌：实验操作；林秋叶：实验设计、数据分析、论文审阅和修改；曹振辉：实验设计、数据分析、论文审阅和修改。

利益冲突

作者声明不存在任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。

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