摘要
目的
对具有拮抗植物病原真菌作用的链霉菌ZH-356进行定殖能力和生防作用评价,并结合组学分析初步揭示其植病生防机制。
方法
采用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)荧光标记法,检测链霉菌ZH-356在植物体内的定殖情况;同时,通过测定不同剂型菌剂(种子包衣剂、可湿性粉剂、胶水菌剂和骨胶菌剂)对植物真菌病害的生防效果来评价链霉菌ZH-356的植病生防作用及潜力;利用三代测序技术分析链霉菌ZH-356的全基因组信息,并对其基因功能进行注释;结合转录组学对比分析链霉菌ZH-356在拮抗植物病原真菌过程中表达发生显著改变的基因,预测其拮抗活性物质的合成基因。
结果
通过GFP荧光标记的植物定殖分析,发现链霉菌ZH-356能在番茄和小麦的根茎中稳定定殖;同时,基于ZH-356制备的不同剂型菌剂对番茄早疫病和苹果树腐烂病均具有良好防效作用。其中,链霉菌ZH-356制成的种子包衣剂处理后不影响番茄种子的发芽率,且能有效保护番茄苗免受番茄早疫病菌的侵染;基于ZH-356制备的可湿性粉剂对番茄早疫病具有良好的预防与治疗效果,且预防作用优于治疗作用;由链霉菌ZH-356制成的液体菌剂,无论是否刮除发病处的树皮,对苹果树腐烂病均具有一定的防治效果,刮除病斑上的树皮后防治效果更好,且这种防治效果优于甲基硫菌灵农药。通过对链霉菌ZH-356的全基因组测序分析发现,其基因组含有一条线状染色体,大小为9 435 898 bp,G+C含量平均为70.82%,共预测到8 432个编码基因、69个tRNA基因和18个rRNA基因。物种注释结果显示,链霉菌ZH-356不属于任何已完成基因组测序的链霉菌种类。经全基因组分析预测,链霉菌ZH-356中含有32个次级代谢产物合成基因簇。通过转录组学分析发现,在拮抗植物病原真菌过程中,NRPS/T1PKS基因簇ZH_356_GM000343-ZH_356_GM000422的表达显著上调,推测它可能是链霉菌ZH-356中介导其抗植物病原真菌活性物质生物合成基因簇,而ZH_356_GM000409可能是该活性物质的核心生物合成基因。
结论
链霉菌ZH-356能在植物体内稳定定殖,基于该菌株制备的生防菌剂对植物真菌病害具有良好防治效果,其拮抗植物病原真菌的活性物质可能由ZH_356_GM000343-ZH_356_GM000422基因簇负责合成。本研究为菌株ZH-356的产业化应用和拮抗植物病原真菌的机制研究奠定了基础。
链霉菌(Streptomyces)属于放线菌目,是具有高度分支营养菌丝的革兰氏阳性
同时,链霉菌在农业方面也展现出很高的应用价值,例如利用链霉菌农用抗生素、活菌菌剂等来防治植物病害。然而,随着农业的高质量发展,长期滥用化学农药防治植物病害已引发了一系列严重问题,如病原菌抗药性增强、环境污染和农产品农药残留
链霉菌ZH-356是本课题组前期从枣树枝条中分离得到的一株具有广谱拮抗植物病原真菌活性的植物内生菌,其产生的抑菌活性物质对温度和酸碱度具有高度稳定性,并且该活性物质仅存在于胞内;只有当ZH-356遇到植物病原真菌时,才会被分泌到胞外来抑制它们的生长,这种抑制作用可导致苹果树腐烂病菌(Valsa mali)菌丝变粗、交叉扭曲、分枝变少且容易断
为进一步研究链霉菌ZH-356的生防机制,本研究通过构建携带GFP基因的ZH-356/pIJ8660Ep菌株,以小麦和番茄盆栽为植物模型对该菌在植物体内的定殖情况进行分析;针对不同植物真菌病害开发不同剂型的菌剂(种子包衣剂、可湿性粉剂、胶水菌剂和骨胶菌剂),并对其生防作用进行探究,测定其生防效果。在此基础上,对链霉菌ZH-356进行全基因组测序,分析并预测其可能的次级代谢产物合成基因簇;结合转录组学分析,发掘菌株ZH-356在拮抗植物病原真菌过程中表达发生明显改变的次级代谢产物合成基因簇,并鉴定在菌株ZH-356中介导拮抗植物病原真菌的关键基因,以期为菌株ZH-356拮抗植物病原真菌的机制研究及其在农业生物防治领域的开发利用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 菌株
供试菌株链霉菌ZH-356为实验室分离得到,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号:CCTCC No.M2020690。供试菌株大肠杆菌ET12567/pUZ8002/pIJ8660E
1.2 培养基
高氏一号培养基(g/L):可溶性淀粉20.00,NaCl 0.50,KNO3 1.00,K2HPO4·3H2O 0.50,MgSO4·7H2O 0.50,FeSO4·7H2O 0.01,琼脂粉15.00,双蒸水定容,pH 7.2。
胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB) (g/L):tryptone soya broth 30,琼脂粉15,双蒸水定容,pH 7.2。
LB培养基(g/L):胰蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10,琼脂粉15,双蒸水定容,pH 7.2。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) (g/L):马铃薯200,葡萄糖20,琼脂粉15,双蒸水定容,pH自然。
2×酵母提取物胰蛋白胨培养基(2×YT) (g/L):蛋白胨16,酵母提取物10,NaCl 5,双蒸水定容,pH 7.2。
M1培养基(g/L):天冬酰胺1.00,酵母浸膏粉5.00,丙三醇10.00,KNO3 5.00,甜菜碱1.25,琼脂粉15.00,双蒸水定容,pH 7.2。
YME培养基(g/L):酵母提取物4,可溶性淀粉4,麦芽糖10,CoCl2·6H2O 5,琼脂粉20,双蒸水定容,pH 7.2。
2CMY培养基(g/L):可溶性淀粉10,胰蛋白胨2,NaCl 1,(NH4)2SO4 2,K2HPO4 1,CaCO3 2,无机盐溶液(FeSO4·7H2O 0.1,MgCl2·6H2O 0.1,ZnSO4·7H2O 0.1) 1 mL,琼脂粉15,双蒸水定容,pH 7.2。
ISP2培养基(g/L):麦芽提取物10,酵母提取物4,葡萄糖4,琼脂粉15,双蒸水定容,pH 7.2。
以上培养基除ISP2培养基115 ℃灭菌30 min,其余培养基均121 ℃灭菌20 min。
1.3 主要试剂和抗生素
胰蛋白胨、酵母提取物,OXOID公司;天冬酰胺、甜菜碱,北京索莱宝科技有限公司;壳聚糖、聚乙烯醇,上海麦克林生化科技股份有限公司;骨胶,青州亿博新材料有限公司,硅藻土,生工生物工程(上海)股份有限公司;其他试剂均为国产分析纯。
卡那霉素和氯霉素,北京索莱宝科技有限公司,使用浓度为30 μg/mL;安普霉素使用浓度为50 μg/mL,萘啶酮酸使用浓度为25 μg/mL,均为阿拉丁试剂(上海)有限公司。
1.4 链霉菌ZH-356在植物中的定殖
1.4.1 链霉菌ZH-356/pIJ8660Ep的构建
大肠杆菌和链霉菌属的间接合转移参考《链霉菌操作手册
1.4.2 链霉菌ZH-356/pIJ8660Ep的GFP表达检测和拮抗活性测定
GFP荧光表型检测方法参考刘晓瑜
1.4.3 链霉菌ZH-356/pIJ8660Ep在植物体内的定殖
定殖测定参考周林
1.5 基于链霉菌ZH-356的菌剂制备及生物防治
1.5.1 基于链霉菌ZH-356的菌剂制备
链霉菌ZH-356种子包衣剂的制备方法参考王
链霉菌ZH-356可湿性粉剂的制备方法参考朱海霞
链霉菌ZH-356液体菌剂,包括胶水菌剂和骨胶菌剂的制备。
(1) 链霉菌ZH-356胶水菌剂制备:用0.8 mL无水乙醇溶解0.8 g水杨酸,向溶解好的水杨酸溶液中加入320 g阿拉伯树胶、40 mL甘油和960 mL ZH-356发酵液,充分搅拌溶解混匀后室温储存备用。
(2) 链霉菌ZH-356骨胶菌剂制备:取天然骨胶333.3 g,用333.3 mL H2O浸泡过夜,70 ℃水浴搅拌融化,放至温度为30 ℃,加入甘油166.7 mL,CaCO3 3.33 g,搅拌均匀得到基质。在基质中加入链霉菌ZH-356发酵液500 mL,搅拌混匀,制备得到骨胶菌剂,室温储存备用。
1.5.2 链霉菌ZH-356种子包衣剂盆栽防效实验
取打制好备用的番茄早疫病菌菌饼接种至PDA液体培养基中,25 ℃、180 r/min振荡培养10-15 d至菌丝球充满培养基,得到番茄早疫病菌发酵液。分别在50 mL包衣剂基质和链霉菌ZH-356种子包衣剂中加入30颗矮生盆栽红番茄种子(北京东升种业有限公司),待其完全被种子包衣剂包裹后,取出晾干成膜备用。在无菌营养土中按500 mL/kg加入制备好的番茄早疫病菌发酵液搅拌混匀,备用。分别将链霉菌ZH-356种子包衣剂处理、包衣剂基质处理和无处理对照组的种子播种在上述加番茄早疫病菌发酵液的营养土中。每个处理组3个生物学重复,每个重复播种10颗种子。测量各处理组的种子发芽率、植株根长、株高、鲜重、干重和长势。
1.5.3 链霉菌ZH-356可湿性粉剂盆栽防效实验
以培养50 d的番茄苗(番茄苗培育方法同1.4.3)作为实验材料进行防效实验,防效实验方法参考朱海霞
统计各处理组番茄早疫病的病情指数[计算如
(1) |
1.5.4 链霉菌ZH-356液体菌剂的大田防效测定
选取陕西省延安市安塞区高桥镇南沟村(36°35′29″N,109°17′59″E)山地苹果园中已感染苹果树腐烂病的苹果树枝干作为实验对象进行大田试验。
2022年3月15日,在果园中随机选取发病的苹果树枝干,刮除发病处的树皮后,分别涂抹链霉菌ZH-356胶水菌剂、甲基硫菌灵糊剂,不做处理作为空白对照等3个处理组,每组3个生物学重复,每个重复15棵树。2023年4月15日,在果园中随机选取发病的苹果树枝干,分为6个处理组:刮除发病处的树皮后分别涂抹骨胶菌剂、甲基硫菌灵糊剂和无处理,以及在不刮除发病处树皮的情况下涂抹骨胶菌剂、涂抹甲基硫菌灵糊剂和无处理,每个处理组5个生物学重复,每个重复20棵树。在涂抹处理后每1-2月进行病害进程调查,统计每棵树的苹果树腐烂病复发率[计算如
(2) |
(3) |
1.6 链霉菌ZH-356基因组测序
1.6.1 链霉菌ZH-356基因组测序及拼接
将链霉菌ZH-356接种于高氏一号培养基,在28 ℃活化培养4-6 d,然后挑取单菌落接种至TSB液体培养基中,28 ℃、180 r/min振荡培养3 d,6 000 r/min离心5 min收集菌体进行全基因组测序。链霉菌ZH-356的全基因组测序由天津诺禾致源生物信息科技有限公司完成。采用PacBio和Illumina测序平台构建SMRT Bell文库和350 bp小片段文库,使用PacBio Sequel II/PacBio Sequel IIe和Illumina NovaSeq PE150进行测序。基于测序结果使用Canu软件(version 2.0)对reads进行基因组组装。
1.6.2 基因预测与注释
使用GeneMarkS软件(v4.17)预测编码基因。通过RepeatMasker软件(version open-4.0.5)进行散在重复序列预测,并利用tRNAscan-SE软件(v1.3.1)对tRNA进行预测。利用通用数据库将预测基因的蛋白序列与NR数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/);GO数据库(https://www.geneontology.org/);KEGG数据库(http://www.genome.jp/kegg/);COG数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/);Swiss-Prot数据库(http://www.ebi.ac.uk/uniprot/)进行Diamond比对,过滤比对结果选取score最高的结果进行注释,分别得到non-redundant protein database (NR)、gene ontology (GO)、Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG)、cluster of orthologous groups of proteins (COG)和Swiss-Prot蛋白注释结果,使用Type Strain Genome Server (dsmz.de) (TYGS)在线工具(https://tygs.dsmz.de/)和DNA杂交法进行物种分类注释以及构建物种发育树,得到构树结果使用itol在线工具(https://itol.embl.de/)美化。
1.6.3 链霉菌ZH-356次级代谢产物合成基因簇预测
利用antiSMASH网站(http://antismash.secondarymetabolites.org/)预测链霉菌ZH-356的次级代谢物合成基因簇,通过比较每个基因簇与已知化合物的生物合成基因簇,得知每个基因簇的代谢产物存在的可能性,并推测其生物合成途径。
1.7 链霉菌ZH-356转录组分析
1.7.1 链霉菌ZH-356与苹果树腐烂病菌平板对峙样品制备
挑取链霉菌ZH-356单菌落至5 mL TSB液体培养基中,28 ℃、180 r/min振荡培养3 d。在PDA培养基中心接种苹果树腐烂病菌,25 ℃培养5-7 d至菌丝铺满培养基,使用无菌打孔器将其打制成直径为5 mm菌饼。在PDA培养基中心滴加15 μL的链霉菌ZH-356菌液,在距离中心点2.5 cm四侧对称点接种菌面向下的苹果树腐烂病菌菌饼,对照组只在PDA培养基中心滴加15 μL链霉菌ZH-356菌液,25 ℃培养5-7 d后,待培养基形成圆形抑菌圈,刮取PDA培养基中心的链霉菌ZH-356菌体至无菌1.5 mL离心管中,液氮速冻10 min,放置于-80 ℃保存,将样品送至上海美吉生物医药科技有限公司进行转录组测序分析。
1.7.2 链霉菌ZH-356转录组测序与分析
从链霉菌ZH-356组织样品中提取总RNA,利用NanoDrop 2000 (ThermoFisher Scientific公司)对所提RNA的浓度和纯度进行检测,琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,并使用Agilent 2100测定RNA完整值(RNA integrity number, RIN)。去除rRNA后,加入Fragmentation Buffer,将完整的mRNA随机断裂成约200 bp的小片段。随后加入逆转录酶,使用随机引物,以mRNA为模板反转录合成一链cDNA。用dUTP代替dTTP合成cDNA二链,加入End Repair Mix将其补成平末端,并在3′末端加上1个A碱基,用于连接Y字形接头。使用UNG酶消化cDNA第二链,使文库中仅包含cDNA第一链。最终利用Illumina平台和华大平台上机测序。
使用RSEM软件(http://deweylab.github.io/RSEM/)对基因的表达水平进行定量分析。根据基因在不同样本间的表达情况,分析样本间共有与特有表达基因的相关性。对获得的基因Read Counts数进行样本间基因的差异表达分析,以差异倍数(fold change, FC)和校正后的P值(P-adjust)作为筛选差异基因的阈值,并对差异基因进行统计分析。采用上海美吉生物医药科技有限公司自主研发的流程对基因集进行KEGG PATHWAY功能富集分析,从而获得该基因集中的KEGG PATHWAY功能富集情况以推测链霉菌ZH-356在面对植物病原真菌胁迫时产生拮抗作用的潜在机制。
1.8 统计及分析
使用Microsoft Excel软件分析原始数据,利用GraphPad Prism软件(v7.00)进行差异显著性分析,使用Adobe Illustrator 2021软件进行作图。
2 结果与分析
2.1 链霉菌ZH-356在植物中的定殖能力分析
将链霉菌ZH-356/pIJ8660Ep接种于ISP2培养基上进行插片培养,并使用荧光显微镜观测其是否发出绿色荧光。结果显示,链霉菌ZH-356/pIJ8660Ep在荧光显微镜下可清晰观察到菌丝体上产生的绿色荧光,而对照组链霉菌ZH-356则无此现象,这证实了质粒pIJ8660Ep已成功导入链霉菌ZH-356中[数据已上传国家微生物科学数据中心(https://nmdc.cn/resource/attachment/detail/NMDCX0001773),登录号为NMDCX0001773]。通过平板对峙法对链霉菌ZH-356/pIJ8660Ep和ZH-356进行抑菌活性比较实验。结果显示与链霉菌ZH-356相比,链霉菌ZH-356/pIJ8660Ep对小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、苹果树腐烂病菌(Valsa mali)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokinianum)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)和玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)等植物病原真菌的拮抗活性并无明显差异,表明携带GFP荧光标记质粒pIJ8660Ep并未影响链霉菌ZH-356的拮抗活性,因此可用于分析链霉菌ZH-356在植物体内的定殖情况。
取用处理后的番茄根系和茎,制作临时装片,并使用荧光显微镜观测链霉菌ZH-356/pIJ8660Ep的定殖情况。结果如

图1 链霉菌ZH-356/pIJ8660Ep在番茄植株体内的定殖
Figure 1 Colonization of Streptomyces sp. ZH-356/pIJ8660Ep in tomato. Streptomyces sp. ZH-356/pIJ8660Ep, ZH-356 and water-treated tomato seedling root slices were observed for fluorescence under white light (A, C, and E) and blue light (B, D, and F) using a fluorescence microscope. Streptomyces sp. ZH-356/pIJ8660Ep, ZH-356 and water-treated tomato seedling stem sections were observed for fluorescence under white light (G, I, and K) and blue light (H, J, and L) using a fluorescence microscope. Bar=50 μm.

图2 链霉菌ZH-356/pIJ8660Ep在小麦植株体内的定殖
Figure 2 Colonization of Streptomyces sp. ZH-356/pIJ8660Ep in wheat. Streptomyces sp. ZH-356/pIJ8660Ep, ZH-356 and water-treated wheat seedling root slices were observed for fluorescence under white light (A, C, and E) and blue light (B, D, and F) using a fluorescence microscope. Streptomyces sp. ZH-356/pIJ8660Ep, ZH-356 and water-treated wheat seedling stem slices were observed for fluorescence under white light (G, I, and K) and blue light (H, J, and L) using a fluorescence microscope. Bar=50 μm.
2.2 链霉菌ZH-356菌剂对植物真菌病害的生物防治效果测定
2.2.1 链霉菌ZH-356种子包衣剂盆栽防效实验
在种植土壤中拌入番茄早疫病菌发酵液,播种处理过的3组番茄种子(链霉菌ZH-356种子包衣剂处理;基质包衣剂处理;无处理对照组)。21 d后每个处理组番茄苗长势如

图3 链霉菌ZH-356种子包衣剂对番茄早疫病的防治作用
Figure 3 Effect of Streptomyces sp. ZH-356 seed coating agent on controlling tomato early blight. A: Tomato seeds treated with three different methods (Streptomyces sp. ZH-356 seed coating agent, matrix coating agent, and untreated control) were sown in soil mixed with a fermentation solution of Alternaria solani. After 21 d, the growth of the tomato seedlings in each treatment group was observed and photographed; B: Germination rates of tomato seeds in Streptomyces sp. ZH-356 seed coating treatment group, substrate treatment group and untreated group were determined without infection with Alternaria solani; C: Germination rates of tomato seeds in Streptomyces sp. ZH-356 seed coating treatment group, substrate treatment group and untreated group were determined after treatment with Alternaria solani. Plant height (D), root length (E), fresh weight (F) and dry weight (G) of tomato seedlings in Streptomyces sp. ZH-356 seed coating treatment group, substrate treatment group and untreated group were obtained after 21 d of treatment with Alternaria solani. All the data are representative of a minimum of three independent experiments. Error bars represent the standard deviations. *: P<0.05; ***: P<0.001, ****: P<0.000 1; ns: No significant difference.
2.2.2 链霉菌ZH-356可湿性粉剂盆栽防效实验
可湿性粉剂盆栽防效实验共设置8个处理组,各组处理见1.5.3。番茄早疫病菌孢子液和链霉菌ZH-356可湿性粉剂喷洒间隔时间为3 d,根据其先后顺序不同,分为链霉菌ZH-356可湿性粉剂对番茄早疫病的预防处理(a1、b1和CK1)和治疗处理(a2、b2和CK1)。结果如

图4 链霉菌ZH-356可湿性粉剂对番茄早疫病的防治作用
Figure 4 Control effect of Streptomyces sp. ZH-356 wettable powder on tomato early blight. Leaf spot symptoms (A) and disease index (B) of tomato seedlings treated with apply wettable powder first and then inoculate Alternaria solani (a1), inoculate Alternaria solani first and then apply wettable powder (a2), apply wettable powder (a3), apply wettable powder matrix first and then inoculate Alternaria solani (b1), inoculation of Alternaria solani followed by application of wettable powder matrix (b2), apply wettable powder matrix (b3), inoculation of Alternaria solani (CK1) and untreated control (CK2). All the data are representative of a minimum of three independent experiments. Error bars represent the standard deviations. *: P<0.05; ****: P<0.000 1.
2.2.3 链霉菌ZH-356液体菌剂田间防效实验
2022-2023年,连续2年在陕西省延安市安塞区高桥镇南沟村的山地苹果园中开展链霉菌ZH-356液体菌剂的田间试验。2022年,对苹果树刮除发病处树皮后,分别涂抹链霉菌ZH-356胶水菌剂、甲基硫菌灵糊剂或不作处理,发现施用链霉菌ZH-356胶水菌剂后的苹果树腐烂病复发率显著低于施用甲基硫菌灵糊剂和无处理组(

图5 链霉菌ZH-356胶水菌剂对苹果树腐烂病的田间防效作用
Figure 5 Field control effect of Streptomyces sp. ZH-356 glue inoculant against apple valsa canker. A: Recurrence rate of apple valsa canker at different time after treatment with ZH-356 biological agent; B: Width of callus at apple valsa canker spot after 7 months of treatment with ZH-356 biological agent. Treatment of thiophanate-methyl and no treatment were used as controls. All the data are representative of a minimum of three independent experiments. Error bars represent the standard deviations. ***: P<0.001; ****: P<0.000 1; ns: No significant difference.
2023年,设置苹果树在刮除发病处的树皮后分别涂抹骨胶菌剂、甲基硫菌灵糊剂和无处理,以及在不刮除发病处树皮的情况下分别涂抹骨胶菌剂、甲基硫菌灵糊剂和无处理等6种不同处理。结果如

图6 链霉菌ZH-356骨胶菌剂对苹果树腐烂病的田间防效作用
Figure 6 Field control effect of Streptomyces sp. ZH-356 bone glue agent against apple valsa canker. A: Recurrence rate of apple valsa canker at different time after treatment with ZH-356 biological agent after scraping off the bark at the disease area; B: Recurrence rate of apple valsa canker at different time after treatment with ZH-356 biological agent after without scraping the bark at the disease area; C: Disease index of apple valsa canker at different time after treatment with ZH-356 biological agent after the bark of the disease area was not scraped. Treatment of thiophanate-methyl and no treatment were used as controls. All the data are representative of a minimum of three independent experiments. Error bars represent the standard deviations. *: P<0.05; **: P<0.01.
2.3 链霉菌ZH-356基因组测序及分析
链霉菌ZH-356的基因组经过测序和组装,得到一条总长度为9 435 898 bp的线性染色体结构contig。该contig的G+C含量为70.82%,N50长度平均为9 303 bp。预测到8 432个编码基因,总长度为8 217 771 bp,平均长度为975 bp,这些编码基因占全基因组的87.09%。此外,该基因组包含69个tRNA基因、18个rRNA基因、2 026个小卫星序列和68个微卫星序列。同时,还含有81个重复序列和2 402个串联重复序列,长度范围在1-828 bp,总长度为120 175 bp,占基因组全长1.273 6%。链霉菌ZH-356的基因组测序数据已提交至国家微生物科学数据中心(https://nmdc.cn),基因组序列编号:NMDC60203801。
2.4 链霉菌ZH-356基因通用功能注释
2.4.1 物种注释
NR数据库(non-redundant protein database)是一个可做物种分类用的非冗余的蛋白质数据库。使用Diamond软件将链霉菌ZH-356所有蛋白的氨基酸序列在NR数据库中进行比对,并根据比对结果进行基因注释,根据注释到的物种情况,统计注释到的物种及基因数目,结果显示链霉菌ZH-356与杜米托尔山链霉菌(Streptomyces durmitorensis)的匹配度最高(登录号为NMDCX0001773)。使用TYGS在线工具对基因组进行比对及相似性分析,并构建系统发育树,基于GBDP (genome blast distance phylogeny)法得到链霉菌ZH-356与不同物种间的DNA-DNA杂交值(DNA-DNA hybridization, dDDH),结果如

图7 链霉菌ZH-356系统发育树
Figure 7 Species evolutionary tree of Streptomyces sp. ZH-356. Numbers in parentheses are GenBank or National Microbiology Data Center accession numbers; Values above the branches are species diversity.
2.4.2 次级代谢产物合成基因簇预测与分析
利用antiSMASH程序(version 4.0.2)对链霉菌ZH-356基因组进行次级代谢产物合成基因簇的预测,共鉴定出32个次级代谢产物合成基因簇。其中,以编码萜类(terpene)、聚酮类(PKS)和非核糖体多肽类(NRPS)的合成基因簇为主要类型,共计17个,占基因组的53.13%。其余15个基因簇主要参与核糖体合成和翻译后修饰、羊毛硫肽类化合物、氧化还原辅因子、吲哚、依克多因、丁内酯、黑色素、铁载体、套索肽等物质的生物合成(登录号为NMDCX0001773)。本课题组前期研究发现链霉菌ZH-356在高氏一号液体培养基和M1液体培养基中均能产生黑色
2.5 链霉菌ZH-356转录组测序分析
2.5.1 RNA提取质量及测序质量分析
按照1.5.1制备实验组(A)和对照组(con) (

图8 不同处理样品图
Figure 8 Sample diagrams with different treatments. con: Streptomyces sp. ZH-356 no treatment served as control; A: Streptomyces sp. ZH-356 was antagonized with Valsa mali.
2.5.2 样本间KEGG功能富集分析
采用上海美吉生物医药科技有限公司自主研发的流程,对不同基因集(gene-set)中的基因进行KEGG PATHWAY富集分析,以P<0.05为阈值,筛选基因集中显著富集的KEGG通路。与对照组相比,实验组差异基因富集数量较多的通路包括双组分系统(two-component system)、丙酮酸代谢(pyruvate metabolism)、泛酸和CoA生物合成(pantothenate and CoA biosynthesis)以及脂肪酸生物合成(fatty acid biosynthesis)途径;其中上调基因主要富集在双组分系统、嘌呤代谢(purine metabolism)、丙酮酸代谢、磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway)和三羧酸循环(TCA cycle)中;实验组中其他次级代谢物生物合成途径的上调基因在硫代葡萄糖苷生物合成(glucosinolate biosynthesis)途径和各种抗生素的生物合成(biosynthesis of various antibiotics) 中的富集程度较高(登录号为NMDCX0001773)。说明与苹果树腐烂病菌对峙期间,链霉菌ZH-356能够激活双组分系统感应机制,并合成各种抗生素等活性物质作出反击。
2.5.3 链霉菌ZH-356样本间次级代谢产物合成基因簇表达差异分析
为了鉴定链霉菌ZH-356中的参与其抗植物病原真菌的次级代谢物生物合成基因簇,通过转录组分析比较了实验组(A)和对照组(con)中次级代谢物生物合成基因簇的表达变化情况。与对照组(con)相比,上调表达基因数目不超过2个的次级代谢物生物合成基因簇在本研究中被认定为未被激活的基因簇(登录号为NMDCX0001773)。排除这些基因簇后,只有3个基因簇在实验组(A)中的表达显著上调,分别为编码合成terpene、T3PKS和NRPS/T1PKS的基因簇。其中编码合成terpene的基因簇ZH_356_GM006641-ZH_356_GM006664中,ZH_356_GM006650、ZH_356_GM006651、ZH_356_GM006654、ZH_356_GM006655、ZH_356_GM006656、ZH_356_ GM006657和ZH_356_GM006663等7个基因的表达均显著上调。同源比对发现,该基因簇与杜米托尔山链霉菌(Streptomyces durmitorensis) MS405菌株中的M4V62_07560-M4V62_07630基因簇同源,该基因簇负责细菌藿多醇(bacteriohopanepolyols, BHPs)的生物合成。细菌藿多醇是一种五环三萜类化合物,主要存在于原核生物中,具有促进细胞膜通透性和稳定性的作
3 讨论与结论
本研究通过GFP荧光标记的植物定殖分析,发现链霉菌ZH-356能够在番茄苗和小麦苗中稳定定殖。基于ZH-356制备的种子包衣剂在不影响番茄种子发芽率的前提下,可有效保护番茄苗免受番茄早疫病菌的侵染。ZH-356可湿性粉剂对番茄早疫病具有良好的预防和治疗效果,且预防效果优于治疗效果。ZH-356液体菌剂,无论是否刮除发病处树皮,均对苹果树腐烂病具有一定的防治效果,但刮除病斑树皮后的防治效果更好,且优于甲基硫菌灵糊剂。这些结果表明,链霉菌ZH-356具有良好的环境适应性和卓越的生物防治潜力。为进一步探究ZH-356的生防作用机制,本研究结合基因组学和转录组学分析,发现该生防菌不属于任何已测序的链霉菌种类;预测其含有32个以PKS和NRPS为主的次级代谢产物合成基因簇;通过转录组学分析,推测NRPS/T1PKS基因簇ZH_356_ GM000343-ZH_356_GM000422可能是链霉菌ZH-356中参与抗植物病原真菌的活性物质的生物合成基因簇,其中ZH_356_GM000409可能是该活性物质的核心生物合成基因。这些发现为链霉菌ZH-356的产业化应用和拮抗植物病原真菌的机制研究奠定了基础。
在植物与微生物互作的研究中,链霉菌作为一种重要的植物内生菌,因其多功能性而备受关注。生防链霉菌在植物体内定殖后可通过竞争、拮抗等多种方式抑制病原菌。例如,刘琴
对于苹果树腐烂病的防治,链霉菌ZH-356菌剂在田间已展现出一定效果。为确保其疗效,刮除病斑上的树皮成为一项关键且不可或缺的步骤。然而,刮除病斑再抹药的施药方式人工成本较高,难以实现降本增效的目标。因此,后续还需对ZH-356菌剂配方进行改良,旨在不刮除病斑的情况下也能有效防治苹果树腐烂病。例如,可以探索内吸型制剂的应用,通过提高与植物靶标部位接触机会从而提高药剂的利用率,在与植物接触过程中利用渗透作用进入植物体内并随水分循环达到植物各部分发挥防治作
本研究对链霉菌ZH-356的基因组进行分析,结果显示其拥有32个以PKS和NRPS为主的次级代谢产物合成基因簇,PKS和NPRS负责合成链霉菌的2类主要次级代谢产物,具有广泛的生物活
将生防菌开发成微生物制剂并应用于田间环境,以发挥对农业中植物病害的防治作用,是开发生防菌的最终目的。例如,Kemira公司、赫尔辛基大学和芬兰农业研究中心合作研发的商品化生物杀真菌剂MYCOSTO
综上所述,链霉菌ZH-356具有很强的植物病害生防作用。深入解析其作用机制将为可持续农业的发展提供重要理论依据。进一步研究链霉菌ZH-356次级代谢产物的合成机制及其环境适应性,有望揭示其拮抗活性背后的深层次调控网络。这不仅有助于理解链霉菌在生态系统中的复杂行为,还能指导其生防制剂的优化开发。同时,在此基础上未来可通过基因编辑技术或合成生物学手段重构链霉菌ZH-356的次级代谢途径,以提高其目标代谢产物的产量、活性或环境适应性。另外,将链霉菌ZH-356与其他不同的生防菌株及其代谢产物组合使用,或在不同农业环境中合理施用,也不失为一种综合防治植物病害的新策略。
作者贡献声明
刘安东:参与实验实施、数据采集与分析、论文撰写与修改;宁婉清:参与实验实施、数据分析、论文修改与完善;朱旭飞:参与实验实施,协助论文修改;张博琳:参与实验实施;屈小娜:参与实验实施;张晋龙:指导实验实施,评审实验过程与数据,提供修改意见;徐成楠:指导实验实施,评审实验过程与数据;李广伟:指导实验实施,提供修改意见;张向前:对实验结果进行评审,提供修改意见;王延峰:参与数据讨论与解读;成娟丽:负责实验规划与指导,参与论文撰写、修改及定稿,提供语言润色;林金水:负责研究构思、方案设计与实验规划,指导研究方向与数据解读,审核论文撰写与定稿。
利益冲突
作者声明,在本研究的设计、数据收集、数据分析、论文撰写及发表过程中,不存在任何经济、个人或学术利益冲突。
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