流感病毒

摘要

目的

探究TGF-β1/Smad3在流感病毒WSN毒株感染过程中对类黏蛋白(orosomucoid, ORM)表达的调控作用。

方法

利用流感病毒WSN毒株感染或TGF-β1处理A549细胞，然后使用Smad3抑制剂处理，通过RT-PCR检测ORM的表达情况；构建过表达STAT3的细胞系与敲低STAT3的细胞系，通过RT-PCR和Western blotting方法检测STAT3在流感病毒诱导ORM表达中的作用；使用TGF-β1处理A549细胞，通过Western blotting方法检测p-STAT3表达情况；使用TGF-β1或流感病毒处理A549细胞，然后使用Smad3抑制剂处理，检测p-STAT3表达情况；构建Smad3表达敲低细胞系，通过Western blotting方法检测STAT3磷酸化水平。

结果

TGF-β1调控ORM1和ORM2的表达依赖于Smad3的活化；STAT3在流感病毒感染过程中参与了ORM1和ORM2的表达调控；TGF-β1能够诱导STAT3发生磷酸化；阻断Smad3的活化或敲低Smad3表达后，TGF-β1或WSN诱导的STAT3的磷酸化也被抑制。

结论

流感病毒WSN毒株调控ORM1和ORM2的表达依赖于TGF-β1/Smad3介导的STAT3磷酸化。

关键词

流感病毒; TGF-β1/Smad3; STAT3; 类黏蛋白

甲型流感病毒(influenza A virus, IAV)是正黏病毒科的一种分节段负链RNA病毒，其宿主范围广泛，可以感染人类和多种动物，引起急性呼吸道感染，主要通过飞沫传播，部分也可经直接或间接接触传播。由于IAV具有极强的传染性和快速传播的特性，它能够在较短时间内引发局部乃至全球范围的流行病，造成严重的公共卫生危机^[1]。当宿主被IAV感染后，其免疫系统会被迅速激活，进而触发一系列免疫调节因子的生成，包括趋化因子、促炎细胞因子以及其他关键的免疫调节细胞因子^[2]。

转化生长因子-β (transforming growth factor-β, TGF-β)是TGF-β超家族中的典型代表，在哺乳动物中主要存在TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三种异构体，在胚胎发育、炎症、组织稳态和肿瘤发生等过程中发挥着关键作用^[3-4]。Smad3是Smad家族的成员，是TGF-β信号传导的主要转录因子。TGF-β与其受体结合后活化下游的Smad2和Smad3蛋白，并与Smad4结合形成异源三聚体，在细胞核内聚集并调节靶基因的转录^[5]，在创伤修复、肿瘤发生和胚胎发育中发挥重要作用^[6]。

类黏蛋白(orosomucoid, ORM)是一类分泌蛋白，属于急性期反应物，主要由肝脏产生，也在肺、脾和淋巴中表达^[7]。在人体内，ORM蛋白主要有ORM1和ORM2两种亚型，在小鼠中则存在ORM1、ORM2和ORM3三种亚型^[8]。ORM蛋白具有多种生物学功能，如药物运输、免疫调节、维持毛细血管屏障、脂质代谢的调控等^[9]。我们之前的研究发现^[10]，IAV感染激活TGF-β1，进而调控ORM1和ORM2的表达，但其中的调控机制尚不明确。

1 材料与方法

1.1 细胞、病毒与质粒

人肺腺癌细胞(A549)和人肾上皮细胞(HEK293T)均由本实验室保存。A/WSN/33 (H1N1) (简写为WSN)由本实验室保存。PNL-STAT3、sh-STAT3由潘宸构建，sh-Smad3质粒由尤冬雪构建，其余质粒均由本实验室保存。

1.2 主要试剂

高糖DMEM培养基与胎牛血清均购自Gibco公司；Lip8000真核转染试剂和TGF-β受体抑制剂SB431542均购自上海碧云天生物技术股份有限公司；HRP标记山羊抗兔/鼠IgG购自Merck公司；Taq DNA酶和T4 DNA连接酶均购自宝生物工程(大连)有限公司；高保真DNA聚合酶购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；限制性内切酶购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；PerfectStart^® Green qPCR SuperMix购自北京全式金生物技术股份有限公司；重组人TGF-β1购自PeproTech公司；Smad3特异性抑制剂SIS3购自奥默生物技术(上海)有限公司。

1.3 病毒感染

将细胞接种至6孔培养板，待细胞密度达到90%左右时，用1×PBS清洗2次，加入 1 mL含有2 μg/mL胰酶的高糖DMEM病毒维持液，并向其中添加病毒液，使感染复数(multiplicity of infection, MOI)达到1。将细胞置于培养箱中吸附1 h，每隔15 min摇晃1次。吸附完成后，用1×PBS清洗2次，然后每孔补充2 mL病毒维持液，继续置于培养箱中培养。

1.4 细胞转染

将HEK293T细胞接种于6孔板，待其生长至大约70%的密度时，用PBS清洗2次，每孔加入900 μL含10% FBS的高糖DMEM培养基，置于培养箱中以备后续转染操作。准备洁净的1.5 mL离心管，加入100 μL高糖DMEM培养基，随后依次加入3 μg目的质粒与4 μL Lip8000转染试剂于离心管中，混匀后静置 10 min，将混合物均匀滴加至6孔板细胞上，置于培养箱中继续培养。

1.5 RNA提取及逆转录

收集细胞样品，加入1 mL的TRIzol，随后加入适量氯仿，充分混匀后于4 ℃条件下12 000 r/min离心12 min，分离出水相。将水相转移至新管中，加入等体积异丙醇，混匀后在4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min，弃去上清，保留沉淀。用75%的乙醇清洗RNA沉淀2次，风干后溶解于适量的DEPC水中。最后，利用微量分光光度计测定RNA的纯度和浓度。

参照南京诺唯赞生物科技股份有限公司的HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)说明书进行逆转录。

1.6 RT-PCR

RT-PCR扩增体系与反应程序参照南京诺唯赞生物科技股份有限公司的2×Taq Plus Master Mix Ⅱ (Dye Plus)说明书，引物序列见表1。

表1  本研究所用引物

Table 1  Primers used in this study

Primer name	Primer sequences (5′→3′)
β-actin-F	TGGGTGTGAACCATGAGAAGT
β-actin-R	AAGGCCATGCCAGTGAGCTT
ORM 1-F	AGAGAGTACCAGACCCGACA
ORM 1-R	TCGTTCACGTCAAAAGCAAGC
ORM 2-F	CCAACAAGACAGAGGACACG
ORM 2-R	CATCGTCCAGGTAGGAACCAAA

1.7 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)

以逆转录获得的cDNA为模板进行qRT-PCR。qRT-PCR反应体系(15 μL)：2×PerfectStart^® Green qPCR SuperMix 7.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA 0.8 μL，ddH₂O 5.7 μL。qRT-PCR反应条件参照北京全式金生物技术股份有限公司PerfectStart^® Green qPCR SuperMix说明书。

1.8 过表达STAT3细胞株的构建

利用RT-PCR技术从A549细胞中扩增STAT3基因的全长序列，所用引物序列为PNL-STAT3-F (5′-CGGCTAGCATGGCCCAATGGAA TCAGCT-3′)和PNL-STAT3-R (5′-CCCTCGAGT TATCACATGGGGGAGGTAGCGC-3′)。PCR扩增体系(50 μL)：2×Phanta Flash Master Mix (Dye Plus) 25 μL，上、下游引物(10 µmol/L)各2 µL，cDNA模板1 µL，ddH₂O 20 µL。PCR反应条件：98 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，60 ℃退火5 s，72 ℃延伸12 s，35个循环；72 ℃终延伸1 min。将目标基因片段连接至PNL-EGFP-CMV-WPREDU3慢病毒表达载体，构建重组质粒。测序验证成功后，筛选出正确的PNL-STAT3重组质粒。随后将重组质粒与包装质粒转染至HEK293T细胞中，培养48 h后收集转染上清液，加入适量A549细胞，并以1:1 000的比例避光加入Polybrene。混匀后加入6孔板，随后放入水平离心机离心。32 ℃、2 100 r/min离心120 min后，每孔补加1 mL含10% FBS的高糖DMEM培养基，置于细胞培养箱中培养。

1.9 干扰STAT3、Smad3细胞株的构建

首先利用在线工具(https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)设计针对STAT3和Smad3的短发夹RNA (shRNA)序列，即sh-STAT3 (5′-GCAACAGATTGCCTGCATTGG-3′)和sh-Smad3 (5′-GGATTGAGCTGCACCTGAAT G-3′)。合成shRNA序列后，通过退火处理形成双链RNA结构。接下来，将退火后的shRNA产物与pSIH-H1-GFP慢病毒表达载体进行连接，构建重组慢病毒表达质粒。最后参照过表达细胞株构建方法进行慢病毒的包装和感染。

1.10 Western blotting检测

收集细胞样品，加入适量蛋白裂解液(并添加蛋白酶抑制剂以防止蛋白降解)。冰浴裂解30 min，每10 min涡旋振荡1次以充分裂解，4 ℃、12 000 r/min离心5 min后，收集上清，加入等量2×蛋白上样缓冲液，置于沸水中煮 5 min。使用10% SDS-PAGE凝胶进行电泳分离，在冰浴环境下以恒流250 mA转膜120 min。转膜完成后，用5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h，以阻断非特异性结合。接着，将条带与特异性一抗在4 ℃条件下孵育过夜。次日用含0.1% Tween-20的TBST洗涤3次，每次10 min。随后，室温孵育二抗1 h，再次用TBST洗涤3次，每次10 min。最后进行化学发光检测并记录结果。

1.11 统计学分析

本研究的所有结果均经过3次独立试验验证，所得数据通过t检验进行显著性分析。统计分析标准如下：P>0.05代表无差异(ns)，P<0.05代表有差异(*)，P<0.01代表差异显著(**)，P<0.001代表差异极显著(***)。

2 结果与分析

2.1 抑制Smad3的激活下调ORM1和ORM2的表达

前期研究结果证明，IAV感染激活的TGF-β上调ORM1和ORM2的表达，使用TGF-β受体抑制剂处理可以阻断IAV和TGF-β1诱导的ORM1和ORM2表达水平升高^[10]。Smad3是TGF-β的下游效应转录因子，为了探究Smad3是否参与ORM的表达调控，使用TGF-β1刺激或者流感病毒WSN感染A549细胞，然后加入Smad3的抑制剂SIS3处理细胞。RT-PCR结果表明，与对照组相比，SIS3处理明显降低了TGF-β刺激或WSN感染诱导的ORM1和ORM2表达水平(图1A、1B)。这一结果说明，SIS3阻断Smad3的磷酸化抑制了ORM1和ORM2的表达，证明TGF-β1调控ORM的表达依赖于Smad3的活化。

图1  抑制Smad3的激活下调ORM1和ORM2的表达。A：使用SIS3 (10 µmol/L)或DMSO处理TGF-β1 (5 ng/mL)刺激的A549细胞，18 h后检测ORM1和ORM2的表达水平；B：使用SIS3 (10 µmol/L)或DMSO处理流感病毒WSN (MOI=1)感染的A549细胞，18 h后检测ORM1和ORM2的表达水平。

Figure 1  Inhibition of Smad3 activation down-regulates the expression of ORM1 and ORM2. A: TGF-β1 (5 ng/mL) stimulated A549 cells were treated with SIS3 (10 μmol/L) or DMSO, and the expression levels of ORM1 and ORM2 were detected after 18 h; B: Influenza virus WSN (MOI=1) infected A549 cells were treated with SIS3 (10 μmol/L) or DMSO, and the expression levels of ORM1 and ORM2 were detected after 18 h.

2.2 过表达STAT3促进流感病毒诱导的ORM1和ORM2表达

之前研究结果表明，IL-6也能够促进ORM1的少量表达^[10]。为了探究IL-6信号通路下游效应转录因子STAT3是否在ORM的表达调控中发挥作用，首先构建了稳定过表达STAT3的A549细胞系(图2A)，然后使用WSN分别感染STAT3过表达细胞系以及对照细胞系。RT-PCR和qRT-PCR结果显示，STAT3过表达细胞系中ORM1和ORM2的表达量与对照细胞系相比显著升高，证明STAT3能够促进ORM1和ORM2的表达(图2A-2C)。

图2  过表达STAT3促进流感病毒诱导的ORM1和ORM2表达。A-C：WSN感染STAT3过表达细胞系后检测ORM1和ORM2的表达水平。**：P<0.01；***：P<0.001；ns：P>0.05，代表无差异。

Figure 2  Overexpression of STAT3 promoted the expression of ORM1 and ORM2 induced by influenza virus. A-C: The expression levels of ORM1 and ORM2 were detected in STAT3-overexpressing cell lines and control cell lines infected with WSN influenza virus. **: P<0.01; ***: P<0.001; ns: P>0.05, indicates no statistical difference.

2.3 敲低STAT3抑制流感病毒诱导的ORM1和ORM2表达

为了进一步验证STAT3对ORM1和ORM2表达的调控作用，构建了敲低STAT3表达的A549细胞系(图3A)，然后使用WSN分别感染STAT3表达敲低细胞系以及对照细胞系。RT-PCR和qRT-PCR结果显示，细胞中敲低STAT3的表达后，流感病毒感染诱导的ORM1和ORM2表达量显著下降(图3A-3C)。以上结果证明STAT3在IAV感染过程中参与了ORM1和ORM2的表达调控。

图3  敲低STAT3抑制流感病毒诱导的ORM1和ORM2表达。A-C：WSN感染STAT3敲低细胞系后检测ORM1和ORM2的表达水平。**：P<0.01；ns：P>0.05，无统计学差异。

Figure 3  Knockdown of STAT3 inhibits influenza virus-induced ORM1 and ORM2 expression. A-C: The expression levels of ORM1 and ORM2 were detected in STAT3-knockdown cell lines and control cell lines infected with WSN influenza virus. **: P<0.01; ns: P>0.05, indicates no statistical difference.

2.4 TGF-β1促进STAT3的磷酸化

由以上结果得知，STAT3能够调控ORM1和ORM2的表达，而IL-6处理仅能诱导ORM1的少量表达，说明除了IL-6，STAT3可能还被其他细胞因子激活。由于TGF-β1能够诱导ORM1和ORM2的表达，接下来检测了TGF-β1是否可以激活STAT3。使用TGF-β1处理A549细胞后，Western blotting检测结果发现TGF-β1处理细胞12 h和18 h后，STAT3磷酸化水平明显升高(图4A)。为了进一步验证TGF-β1能够调控STAT3的磷酸化水平，在TGF-β1刺激或WSN感染细胞后，使用TGF-β1受体特异性抑制剂SB431542处理并检测STAT3的磷酸化水平。Western blotting结果显示，在TGF-β1刺激或者WSN感染A549细胞后，SB431542处理组中的p-STAT3水平与对照组相比明显下降，说明阻断TGF-β1信号的传递后STAT3的磷酸化也被抑制(图4B、4C)。以上实验结果证明TGF-β1能够通过其受体诱导STAT3发生磷酸化。

图4  TGF-β1促进STAT3磷酸化。A：使用TGF-β1 (5 ng/mL)处理A549 细胞后检测STAT3的磷酸化水平；B：使用SB431542 (10 µmol/L)或DMSO处理TGF-β1 (5 ng/mL)刺激的A549细胞，18 h后检测STAT3的磷酸化水平；C：使用SB431542 (10 µmol/L)或DMSO处理WSN (MOI=1)感染的A549细胞，12 h后检测STAT3的磷酸化水平。

Figure 4  TGF-β1 promotes the phosphorylation of STAT3. A: The phosphorylation level of STAT3 was detected in A549 cells treated with TGF-β1 (5 ng/mL); B: A549 cells were stimulated with TGF-β1 (5 ng/mL) followed by treatment with SB431542 (10 µmol/L), and the phosphorylation level of STAT3 was detected after 18 hours; C: A549 cells were infected with WSN influenza virus (MOI=1) followed by treatment with SB431542 (10 µmol/L) or DMSO, and the phosphorylation level of STAT3 was detected after 12 hours.

2.5 阻断Smad3的激活可以抑制STAT3的磷酸化

上述实验结果说明TGF-β1可以同时激活Smad3和STAT3，为了探究Smad3和STAT3之间是否存在调控关系，使用TGF-β1刺激或者流感病毒WSN感染A549细胞，然后加入Smad3的抑制剂SIS3处理细胞。Western blotting结果显示，在TGF-β1刺激或WSN感染后，SIS3处理组的STAT3磷酸化水平与对照组相比均明显降低(图5A、5B)。以上结果表明，阻断Smad3的活化后，TGF-β1或WSN诱导的STAT3的磷酸化也被抑制。

图5  阻断Smad3的激活可以抑制STAT3的磷酸化。A：使用SIS3 (10 µmol/L)或DMSO处理TGF-β1 (5 ng/mL)刺激的A549细胞，18 h后检测STAT3的磷酸化水平；B：使用SIS3 (10 µmol/L)或DMSO处理WSN (MOI=1)感染的A549细胞，18 h后检测STAT3的磷酸化水平。

Figure 5  Blocking the activation of Smad3 inhibits the phosphorylation of STAT3. A: A549 cells were stimulated with TGF-β1 (5 ng/mL) followed by treatment with SIS3 (10 µmol/L), and the phosphorylation level of STAT3 was detected after 18 hours; B: A549 cells were infected with WSN influenza virus (MOI=1) followed by treatment with SIS3 (10 µmol/L), and the phosphorylation level of STAT3 was detected after 18 hours.

2.6 敲低Smad3抑制STAT3的表达和磷酸化

为了进一步证明Smad3可以调控STAT3的磷酸化，构建了敲低Smad3的A549细胞系(图6A)，然后使用WSN分别感染Smad3敲低细胞系以及对照细胞系。Western blotting结果显示，Smad3敲低细胞系中STAT3的表达量和磷酸化水平与对照细胞系相比明显降低(图6B)。以上结果证明，敲低A549细胞中Smad3可以抑制STAT3的蛋白表达和磷酸化水平。

图6  敲低Smad3抑制STAT3的表达和磷酸化。A：构建Smad3敲低细胞系和对照细胞系，通过qRT-PCR检测Smad3的敲低效果(***：P<0.001)；B：使用WSN (MOI=1)感染Smad3敲低细胞系，18 h后检测STAT3的蛋白表达和磷酸化水平。

Figure 6  Knockdown of Smad3 inhibits the expression and phosphorylation level of STAT3. A: The Smad3 knockdown and control cell lines were generated and the knockdown effect of Smad3 was detected by qRT-PCR (***: P<0.001); B: The Smad3 knockdown and control cell lines were infected with WSN (MOI=1), and the protein expression and phosphorylation level of STAT3 were detected 18 hours later.

3 讨论与结论

流感病毒是一种具有高度传染性的病原微生物，主要通过呼吸道途径在宿主体内引发感染，它不仅能感染人类，还能感染多种动物，导致人畜共患病。类黏蛋白ORM作为急性期反应蛋白，能够调节机体免疫应答^[9]。潘宸等研究中同样发现IAV感染激活TGF-β，进而增强ORM1和ORM2的表达，其中ORM2可以抑制趋化因子CCL3的表达，调控宿主体内的炎症反应^[10]。因此，ORM蛋白在IAV感染中的表达调控对于调节炎症反应以及防止细胞因子风暴等方面发挥着重要作用，这些功能对于宿主的防御机制和疾病进程的控制至关重要。Smad3作为TGF-β经典信号通路的下游蛋白，在TGF-β信号转导中起到了重要的作用。使用Smad3的抑制剂SIS3处理A549细胞，然后感染甲型流感病毒WSN或使用TGF-β1刺激，ORM1和ORM2的表达受到明显抑制，说明TGF-β1通过激活Smad3调控ORM1和ORM2的表达。

STAT3是信号分子STAT家族的成员，是一种重要的转录因子，对病原所引发的炎症刺激作出反应，调节基因表达^[11]。它参与多种生物过程，包括伤口愈合、血管生成、炎症反应和癌症等^[12]。流感病毒感染时上调IL-6表达激活STAT3磷酸化，而激活后的STAT3又可以负反馈调节IL-6的表达^[13]。本研究使用TGF-β1刺激A549细胞，发现不仅可以激活Smad3，还可以促进STAT3的磷酸化，这与Dees等^[14]在成纤维细胞中发现的结果一致。我们深入探究了STAT3对ORM1和ORM2的影响，发现流感病毒感染STAT3过表达细胞系后，ORM1和ORM2表达水平均显著上升，而感染STAT3表达敲低细胞系后，ORM1和ORM2表达水平显著下降，说明STAT3在流感病毒诱导ORM1和ORM2的表达过程中发挥了重要作用。

TGF-β1既可以通过激活STAT3调控ORM1和ORM2的表达，又可以活化其下游Smad3分子，进而促进ORM1和ORM2的表达。进一步研究发现，敲低Smad3表达或者使用Smad3抑制剂SIS3处理A549细胞，然后感染甲型流感病毒WSN或使用TGF-β1刺激，发现STAT3的磷酸化水平与对照组相比受到明显抑制，说明STAT3活化受到TGF-β1/Smad3的调控。此外，TGF-β1还可以通过不依赖于Smad的方式激活JAK1-STAT3信号通路，Tang等^[15]发现TGF-β1可以通过其受体TGFβRI与JAK1结合使JAK1被活化，进而磷酸化STAT3，并与SMAD通路协同诱导肝纤维化。

TGF-β信号通路不仅与STAT3信号通路存在调控关系，还与其他形式信号转导通路相互作用，包括Notch、Hippo和Wnt通路^[16]。除了依赖于经典的Smad信号通路，TGF-β也可以通过非经典通路进行信号转导，如激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)^[17]和磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase, PI3K)通路^[18]。综上所述，甲型流感病毒可以通过TGF-β1/Smad3介导的STAT3磷酸化调控ORM1和ORM2的表达，但或许这不是TGF-β1/Smad3信号通路的唯一作用方式，TGF-β1/Smad3还可能通过其他信号分子并协同STAT3调控ORM1和ORM2的表达，这需要我们进一步深入研究。本研究探讨了ORM在IAV感染中的关键作用，为揭示流感病毒的致病机制提供了重要科学依据。此外，本研究不仅为IAV的临床诊断提供了新的思路，还为研发新型抗流感病毒药物指明了潜在的研究方向，具有显著的科学价值和实际应用意义。

作者贡献声明

尤冬雪：实验操作、数据处理与分析、论文撰写与修改；潘宸：实验操作、数据收集和处理；陈玉章：论文讨论、协助实验操作；周欣霓：协助实验操作、数据处理；高铭：协助实验操作；陈梦颖：协助实验操作；王佳俊：协助实验操作；池晓娟：论文讨论、技术支持；王松：研究构思和设计、论文撰写和修改。

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