一株玉米赤霉烯酮降解菌的筛选及其降解特性

摘要

玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)是一种由镰刀菌属真菌产生的次级代谢产物，严重危害人类和动物的健康。

目的

筛选出可降解ZEN的细菌菌株，并探究其在不同条件下的生长与降解特性。

方法

以ZEN为唯一碳源，从安徽某地连作的玉米田的土壤样品中筛选出一株能够高效降解ZEN的细菌菌株。通过形态学观察、生理生化试验和16S rRNA基因序列系统发育树分析对菌株进行鉴定；研究不同温度、pH值和培养时间对菌株生长速率和ZEN降解效率的影响；测定菌株不同活性成分对ZEN的降解效率，并对其活性物质进行定位。

结果

从土壤样品中共筛选出21株ZEN降解菌候选菌株，其中菌株DC-R2的降解效果最佳。经形态学观察、生理生化检测和16S rRNA基因序列系统发育树分析，鉴定该菌株属于戈登氏菌属(Gordonia sp.)。该菌株的最适培养基为BHI培养基，最适ZEN降解温度和pH值分别为37 ℃和8.0。在此条件下，孵育6 h时可降解100%的ZEN (5 μg/mL)。活性成分定位试验结果表明，菌株DC-R2主要以胞内酶降解ZEN。

结论

本研究报道了一株能够高效降解ZEN毒素的戈登氏菌DC-R2，该菌株所具有的胞内酶是降解ZEN的关键。本研究为后续工作中关键降解酶的纯化及其潜在应用奠定了坚实基础。

关键词

玉米赤霉烯酮; 戈登氏菌; 筛选; ZEN降解菌

玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)最早于1962年由Stob等从感染禾谷镰刀菌的霉变玉米中分离并鉴定出来^[1-2]。ZEN是一种常见且具有高度污染性的饲料及粮食污染物，小麦、豆类、谷子等多种农作物及其制品均存在被其霉变污染的报道，其污染范围广，毒性作用大^[3-4]。作为主要谷物和饲料的有毒污染物，ZEN常通过食物链危害人类及动物的健康^[5-6]。ZEN的存在不仅会给农业生产带来经济损失，还会通过农产品对人类及家禽等的健康造成极大危害^[7-8]。据联合国粮食与农业组织的数据显示，全球25%的粮油作物受到真菌毒素的污染^[9]，而ZEN是其中污染范围最广、毒性最大的毒素之一^[10]。朱文倩^[11]对我国159例玉米油样本的ZEN含量进行分析，发现多数玉米油样品中均检出ZEN，平均含量约170.1 μg/kg，部分油样中ZEN含量较高，最高浓度可达1 950.0 μg/kg。戎晓平等^[12]对北京、山东、河南、四川等地的179份饲料原料进行免疫亲和柱净化-高效液相色谱法检测，发现棉粕/棉籽、麸皮、青贮饲料等样品中ZEN检出率为100%，其中玉米样品的ZEN含量和超标率最高，最高含量为3 387.00 μg/kg，超标率为23.21%。因此，加强作物田间管理和谷物储藏管理，抑制禾谷镰刀菌的感染，降低ZEN生成的可能性至关重要。同时，针对已生成ZEN的谷物或有生成ZEN嫌疑的谷物，开发有效的脱毒方法，既能保持农产品的质量，减少损失，又能将对环境和生物的影响降到最低。

目前，关于ZEN脱毒的方法主要包括物理、化学和生物脱毒法^[13-14]。物理方法主要通过高温、吸附或辐射使ZEN变性或去除；化学方法则采用臭氧化、双氧水或碳酸钠浸泡等处理降解ZEN^[15-16]。然而，物理法和化学法往往成本高昂，并可能导致农产品的营养流失及二次污染等问题^[17]。生物脱毒法是利用功能微生物的吸附或微生物中的酶将其降解，该方法规避了物理法和化学法的缺点，具有更为绿色、安全、高效的特点，其在处理如ZEN这类霉菌毒素污染问题上展现出广阔的前景^[14,18-19]。多种微生物对ZEN具有一定的降解效果，Ben Taheur等^[20]从开菲尔培养物中分离鉴定出开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri) KFLM3，在牛奶培养条件下对ZEN吸附率为82%-100%。De Troyer等^[4]发现一株链霉菌(Streptomyces rimosus) LMG 19352，可在24 h内完全降解LB培养基中的5 μg/mL ZEN。Li等^[21]成功分离出一株芽孢杆菌(Bacillus velezensis) L9，在24 h内对ZEN的降解率达到91.14%。Gruber-Dorninger等^[22]在饲料中添加ZEN降解酶ZenA，发现其可有效降解鸡、猪和虹鳟鱼胃肠道中的ZEN为水解玉米赤霉烯酮(hydrolysis ZEN, HZEN)，并抑制猪体内α-ZEL的形成。Fruhauf等^[23]对ZEN和HZEN在2种体外模型中进行了测试，并比较了ZEN与HZEN对雌性仔猪生殖道形态的影响，结果表明与ZEN相比，HZEN的雌激素活性显著降低，且不会引起雌性仔猪生殖道的形态变化。Ji等^[24]从黑曲霉细胞外酶溶液中分离纯化出一种对ZEN降解率为75%-80%的生物酶。因此，生物脱毒法降解ZEN具有安全性高、反应温和、价格低廉且对环境污染小等优点。此外，ZEN降解酶在未来可能是生物脱毒法中降解ZEN最有效的方法之一，并具有一定的商业价值^[25]。然而要获得高效的ZEN降解酶，必须筛选出可降解ZEN的安全无毒菌株，并探究其具体降解机制仍然是未来的研究热点和难点。

本研究的主要目的是筛选一株可高效降解ZEN的细菌菌株，通过探究其在不同培养条件下的生长特性和降解情况，并对ZEN降解酶进行细胞定位，探究其对ZEN的降解特性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集

本研究样品来自安徽省某地连作的玉米田土壤样品。

1.1.2 主要试剂和仪器

玉米赤霉烯酮(ZEN)标准品、甲醇，赛默飞世尔科技公司；Brain-Heart Infusion Broth，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；Biolog 1030 GEN III鉴定板，Biolog公司。

摇床，上海新苗医疗器械制造有限公司；生化培养箱，上海知楚仪器有限公司；高效液相色谱，安捷伦科技有限公司；PCR仪，耶拿分析仪器有限公司；pH计，Mettler Toledo公司。

1.1.3 培养基

液体基本培养基(minimal medium, MM)(g/L)：磷酸氢二钠14.3，磷酸二氢钾3.0，七水硫酸亚铁0.000 3，500×Storage solution 0.002，ddH₂O定容至1.0，pH 7.0，121 ℃灭菌30 min。固体培养基中加入1.5%-2.0%琼脂粉。

LB液体培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，氯化钠10.0，ddH₂O定容至1.0 L，121 ℃灭菌30 min。固体培养基中加入1.5%-2.0%琼脂粉。

Reasoner’s 2A (R2A)液体培养基(g/L)：胰蛋白胨0.5，酵母提取物0.5，可溶性淀粉0.5，丙酮酸钠0.3，硫酸镁0.021，磷酸氢二钾0.3，酶水解酪蛋白0.5，ddH₂O定容至1.0 L，121 ℃灭菌30 min。

Mueller-Hinton broth (MH)液体培养基：MH培养基21.0 g，加热溶解于1.0 L蒸馏水中，121 ℃灭菌15 min。

脑心浸液(Brain-heart infusion broth, BHI)液体培养基：BHI培养基38.5 g，加热溶解于1.0 L蒸馏水中，121 ℃灭菌15 min。

1.2 降解玉米赤霉烯酮菌株的富集和分离

采集安徽省某地连作的玉米田的土壤样本，取0.5 g土壤样品放入100 mL含有ZEN (50 μg/mL)的MM培养基中[加入终浓度为2 mmol/L的(NH₄)₂SO₄作为氮源]，28 ℃、200 r/min条件下培养7 d。取MM培养基的上清液，5%的接种量加入到100 mL含有50 μg/mL的ZEN液体MM培养基中[加入终浓度为2 mmol/L的(NH₄)₂SO₄作为氮源]，并在28 ℃、200 r/min摇床中继续培养7 d。经过连续传代8次后，获得含有能够降解ZEN菌株的混合培养物。

1.3 降解玉米赤霉烯酮菌株的纯化与复筛

将分离初筛的降解ZEN的菌液划线于固体MM培养基上[ZEN终浓度为10 μg/mL，(NH₄)₂SO₄终浓度为2 mmol/L]，于28 ℃培养箱中倒置培养7 d后，挑取不同的单菌落于含终浓度10 μg/mL的ZEN、2 mmol/L的(NH₄)₂SO₄的液体MM培养基中，于28 ℃、200 r/min的条件下培养7 d。如此连续划线、挑取单菌落2次。将所得单菌落接种到5 mL液体MM培养基中，其中ZEN终浓度为10 μg/mL，(NH₄)₂SO₄终浓度为2 mmol/L，以不加菌为空白对照，每个菌均做3次重复，于28 ℃、200 r/min条件下摇床培养12 h。根据高效液相色谱(HPLC)法对培养液中的ZEN含量进行检测，色谱柱为Accucore C18柱(长度100 mm×内径4.6 mm×粒径2.6 μm)，流动相A相为80%甲醇、B相为20%纯水，流速为0.5 mL/min，进样量为20 μL，柱温30 ℃，紫外检测器(波长236 nm)。按照公式(1)计算降解率，筛选出降解率最高的菌株。

ZEN降解率=(对照组浓度-实验组浓度)/对照组浓度×100%

(1)

1.4 菌株形态及理化特性检测

将筛选出的菌株接种到LB固体培养基上，于28 ℃培养48 h左右，观察其菌落形态，挑取单菌落进行电镜观察。将DC-R2菌株接入Biolog GEN III鉴定板，96孔板分布有阳性、阴性对照以及71种碳源、23化学敏感物质，培养48 h后通过观察其颜色反应判断菌株碳源利用情况。

1.5 16S rRNA基因序列检测

以DC-R2基因组DNA为模板，利用16S rRNA基因通用引物^[26]27F (5′-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTAC CTTGTTACGACTT-3′)进行PCR。采用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒(武汉勤致杰生物科技有限公司)提取DNA，以目的菌种基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系(25 μL)：2×Taq Mix 12.5 μL，ddH₂O 10 μL，上、下游引物(10 µmol/L)各1 μL，DNA模板0.5 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃终延伸5 min。将扩增后的PCR产物送到测序公司进行测序。将测序所得到的结果在NCBI数据库中进行序列比对，选取26个相似度较高的菌株的序列为参考序列，并利用MEGA 7.0软件，采用Neighbor-Joining法进行分子系统学分析。

1.6 不同条件对菌株生长的影响

将复苏的DC-R2菌液以体积分数为1%的比例分别接种于5 mL R2A培养基、5 mL MH培养基、5 mL BHI培养基、5 mL LB培养基中，在28 ℃、200 r/min条件下培养，实验设置3个平行。于24 h时取菌液1 mL，使用紫外分光光度计测量其OD₆₀₀值，分析菌株DC-R2的最适培养基。

将复苏的DC-R2菌液以体积分数为1%的比例接种于100 mL BHI培养基中，于28 ℃、200 r/min条件下摇床培养72 h，实验设置3个平行。分别在0、6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72 h时取菌液样品1 mL，使用紫外分光光度计测量其OD₆₀₀值。以时间为横坐标，OD₆₀₀值为纵坐标，绘制菌株DC-R2的生长曲线。

将复苏的DC-R2菌液以体积分数为1%的比例接种于5 mL BHI培养基中，分别在15、20、25、28、37、40、45 ℃温度下200 r/min摇床培养24 h，实验设置3个平行。取菌液样品1 mL，使用紫外分光光度计测量其OD₆₀₀值。以温度为横坐标，OD₆₀₀值为纵坐标，绘制温度与OD₆₀₀的关系曲线，判断菌株DC-R2的最适生长温度。

将复苏的DC-R2菌液以体积分数为1%的比例接种于5 mL BHI培养基中，预先将培养基的初始pH分别调整为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，在37 ℃、200 r/min条件下摇床培养24 h，实验设置3个平行。取菌液样品1 mL，使用紫外分光光度计测量其OD₆₀₀值。以pH为横坐标，OD₆₀₀值为纵坐标，绘制pH与OD₆₀₀的关系曲线，判断菌株DC-R2的最适生长pH。

1.7 不同条件对菌株降解ZEN的影响

取复苏的 DC-R2菌液8 000 r/min离心1 min，收集菌体，使用无菌水清洗2次并悬浮菌体，将悬浮菌液加入到30 mL MM培养基中，同时加入ZEN (终浓度为5 μg/mL)，并补充(NH₄)₂SO₄ (终浓度为2 mmol/L)作为氮源。根据上述最适生长条件，置于37 ℃、200 r/min条件下孵育15 h。分别于0、3、6、9、12、15 h时取样1 mL测定其OD₆₀₀，分析菌株DC-R2以ZEN为唯一碳源时的生长能力。

取复苏的DC-R2菌液8 000 r/min离心1 min，收集菌体，使用无菌水清洗2次并悬浮菌体，将菌液按1%接种量接种于5 mL MM培养基中。同时加入ZEN (终浓度为5 μg/mL)，并补充(NH₄)₂SO₄ (终浓度为2 mmol/L)作为氮源在15、28、37、45 ℃温度下200 r/min摇床培养，分别于0、1、2、3、4、5、6 h时取样。

取复苏的DC-R2菌液 8 000 r/min离心1 min，收集菌体，使用无菌水清洗2次并悬浮菌体，将菌液按1%接种量分别接种于初始pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的MM培养基中。同时加入ZEN (终浓度为5 μg/mL)，并补充(NH₄)₂SO₄ (终浓度为2 mmol/L)作为氮源，最终培养物总体积为5 mL。将其在37 ℃、200 r/min条件下孵育3 h。

挑取复苏的DC-R2菌液8 000 r/min离心1 min，收集菌体，使用无菌水清洗2次并悬浮菌体，将菌液按1%接种量接种于5 mL MM培养基中，同时加入ZEN，使初始ZEN终浓度分别为5、10、20、30、40、50 μg/mL，并补充(NH₄)₂SO₄ (终浓度为2 mmol/L)作为氮源，在37 ℃、200 r/min条件下孵育3 h。

以上实验均以不接种菌液为对照，实验均设置3个平行。取菌液500 μL，加入500 μL甲醇终止反应，充分混匀后，使用0.22 μm 滤膜过滤，使用HPLC法检测ZEN残留量(峰面积)，计算ZEN的降解率。

1.8 菌株DC-R2降解ZEN活性物质定位及粗酶液降解效果

将复苏的DC-R2菌液以体积分数为1%的比例接种于100 mL BHI培养基中，在37 ℃、200 r/min条件下培养24 h。菌液在8 000 r/min下离心10 min，将得到的菌体分为3份，分别加入到30 mL MM培养基内，并补加ZEN至终浓度为5 μg/mL，诱导1 h，液相检测ZEN已完全降解，将菌液在8 000 r/min下离心10 min，上清液使用0.22 μm滤膜过滤，得到全细胞培养上清液。将得到的3份全细胞用无菌水清洗2次后，各用20 mL无菌水将其悬浮。第1份无菌水悬浮的全细胞备用；第2份全细胞放入高压蒸汽灭菌锅121 ℃灭菌30 min后备用；第3份使用超声破碎后，将其在12 000 r/min下离心30 min，破碎菌体上清液使用0.22 μm滤膜过滤后得到菌体破碎后的上清。上述样品中加入ZEN (5 μg/mL)孵育12 h后，检测ZEN残留量(峰面积)，计算ZEN降解率。

在上述试验的基础上，取发挥主要降解作用的实验组进行处理：加1 mg/mL蛋白酶K (65 ℃，水浴2 h)；加蛋白酶K (1 mg/mL)和1% SDS (65 ℃，水浴2 h)；热处理(100 ℃，水浴30 min)，并与ZEN (5 μg/mL)共同孵育12 h，检测ZEN残留量(峰面积)，计算ZEN降解率。

为了进一步验证活性物质的位置及其对ZEN的降解效率和降解时间。以不加活性物质作为对照，在全细胞培养上清液、菌体破碎后的上清液、全细胞样品中加入ZEN (终浓度为6 μg/mL)，每隔10 min取样1次，使用HPLC法检测ZEN残留量(峰面积)，计算ZEN的降解浓度。

1.9 金属离子对粗酶液降解ZEN的影响

粗酶液中分别加入终浓度为5 mmol/L的亚铁离子(Fe²⁺)、铜离子(Cu²⁺)、锰离子(Mn²⁺)、镁离子(Mg²⁺)、钙离子(Ca²⁺)、锌离子(Zn²⁺)、镍离子(Ni²⁺)、钴离子(Co²⁺)和乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraactic acid, EDTA)，与ZEN (5 μg/mL)充分混匀后置于37 ℃、200 r/min摇床中共同孵育12 h。采用HPLC检测ZEN的残留量(峰面积)，并计算ZEN的降解率。

2 结果与分析

2.1 ZEN降解菌的筛选

在以ZEN为唯一碳源的MM培养基中培养12 h后，共筛选获得21种潜在的ZEN降解细菌，在温度为28 ℃、ZEN初始浓度为5 μg/mL的条件下，菌株DC-R2降解ZEN的效果最佳，降解率为100%，其他菌株的ZEN降解率均低于40% (图1A)，因此，选择DC-R2进行后续研究。HPLC检测结果显示，对照组中ZEN的检测峰出现在14 min左右(图1B)，而实验组DC-R2培养液中ZEN的检测峰消失(图1C)。上述结果表明菌株DC-R2对ZEN具有极佳的降解能力。

图1  菌株筛选及HPLC检测脱毒效果。A：21个分离菌株对ZEN的降解率；B：对照组高效液相色谱图；C：实验组高效液相色谱图。

Figure 1  Strain screening and detection of detoxification of ZEN by HPLC. A: The degradation rates of ZEN by 21 strains; B: HPLC chromatogram of control group; C: HPLC chromatogram of the experimental group.

2.2 ZEN降解菌株的鉴定

将具有ZEN降解能力的菌株DC-R2进行培养后，观察其菌落形态。菌落的形态一致，呈现粉红色表型，粗糙边缘不整齐(图2A)。该菌株为革兰氏阳性菌，呈杆状，大小为(0.5-0.8) μm×(1.2-1.8) μm，无鞭毛，不产生菌丝(图2B)。通过Biolog GEN III鉴定板进行代谢特性分析，结果表明菌株DC-R2对纤维二糖、蔗糖、D-果糖、D-甘露糖、D-山梨醇、乳酸钠、D-阿拉伯醇、果胶、丙酸、氨曲南、α-羟基-丁酸、吐温-40、丁酸钠等均呈阳性反应；与龙胆二糖、D-丝氨酸、肌醇、四唑紫、四唑蓝、林肯霉素、洁霉素、万古霉素、溴酸钠等均呈阴性反应(表1)。对该菌株的16S rRNA基因序列进行扩增并测序，序列比对结果显示，DC-R2与Gordonia westfalica Kb2的序列同源性最高。通过构建16S rRNA基因序列系统发育树进行分析，发现DC-R2与Gordonia westfalica DSM 44215菌株高度聚类(图2C)。因此，推断DC-R2菌株属于戈登氏菌属(Gordonia sp.)。

图2  菌株筛选及鉴定。A：DC-R2菌落形态；B：DC-R2电子透射电镜观察；C：基于16S rRNA基因序列的系统发育树。

Figure 2  The screening and characterization of strain. A: Colony morphology of strain DC-R2; B: Morphology of strain DC-R2 under transmission electron microscope; C: The phylogenetic evolutionary tree based on the 16S rRNA gene sequence of strain DC-R2.

表1  ZEN降解菌DC-R2的Biolog GEN III鉴定板结果

Table 1  The results of the Biolog GEN III identification plate for the ZEN degradation bacteria DC-R2

Biochemical projects	Results	Biochemical projects	Results	Biochemical projects	Results	Biochemical projects	Results
Negative control	-	α-D-glucose	+	Gelatin	w	p-hydroxy-phenylacetic acid	w
Dextrin	+	D-mannose	+	Glycyl-L-proline	w	Methyl pyruvate	w
D-maltose	w	D-fructose	+	L-alanine	+	D-lactic acid methyl ester	+
D-trehalose	+	D-galactose	w	L-arginine	w	L-lactic acid	w
D-cellobiose	+	3-methyl glucose	w	L-aspartic acid	-	Citric acid	w
Gentiobiose	-	D-fucose	w	L-glutamic acid	w	α-keto-glutaric acid	+
Sucrose	+	L-fucose	w	L-histidine	w	D-malic acid	+
D-turanose	+	L-rhamnose	w	L-pyroglutamic acid	w	L-malic acid	+
Stachyose	w	Inosine	w	L-serine	w	Bromo-succinic acid	+
Positive control	+	1% sodium lactate	+	Lincomycin	-	Nalidixic acid	+
pH 6.0	+	Fusidic acid	-	Guanidine HCl	+	Lithium chloride	+
pH 5.0	w	D-serine	-	Niaproof 4	-	Potassium tellurite	+
D-raffinose	w	D-sorbitol	+	Pectin	+	Tween-40	+
α-D-lactose	w	D-mannitol	+	D-galacturonic acid	w	γ-amino-butryric acid	w
D-melibiose	w	D-arabitol	+	L-galactonic acid lactone	w	α-hydroxy-butyric acid	+
β-methyl-D-glucoside	w	myo-inositol	-	D-gluconic acid	w	β-hydroxy-D,L-butyric acid	+
D-salicin	-	Glycerol	w	D-glucuronic acid	w	α-keto-butyric acid	+
N-acetyl-D-Glucosamine	w	D-glucose-6-PO4	w	Glucuronamid e	w	Acetoacetic acid	+
N-acetyl-β-D-mannosamine	w	D-fructose-6-PO4	w	Mucic acid	w	Propionic acid	+
N-acetyl-D-galactosamine	w	D-aspartic acid	w	Quinic acid	w	Acetic acid	+
N-acetylneuraminic acid	-	D-serine	w	D-saccharic acid	w	Formic acid	-
1% NaCl	+	Troleandomycin	-	Vancomycin	-	Aztreonam	+
4% NaCl	w	Rifamycin SV	w	Tetrazolium violet	-	Sodium butyrate	+
8% NaCl	w	Minocycline	-	Tetrazolium blue	-	Sodium bromate	-

+：阳性；-：阴性；w：弱阳性。

+: Positive; -: Negative; w : Weakly positive.

2.3 DC-R2菌株不同条件的生长情况

菌株DC-R2在28 ℃、200 r/min条件下培养24 h，在BHI培养基中的OD₆₀₀值最高达1.16，而培养基R2A、LB、MH的OD₆₀₀值分别为0.68、0.72、0.15左右。因此，可以确定BHI是菌株DC-R2的最适培养基(图3A)。后续实验均选择BHI作为研究培养基。在28 ℃培养时，菌株DC-R2的对数生长期为24 h (图3B)。菌株DC-R2的生长繁殖能力表现出显著的温度依赖性。在较低温度下，OD₆₀₀值增长缓慢；当温度提升至25、28、37 ℃时，OD₆₀₀值稳步上升，表明菌株DC-R2的生长繁殖能力在这一温度范围内逐渐增强；然而，当温度进一步升高至40 ℃以上时，OD₆₀₀值明显下降，说明菌株的生长能力受到显著抑制。因此，菌株DC-R2的最适生长温度为37 ℃左右(图3C)。在37 ℃条件下，当初始pH为3.0-5.0时，菌株DC-R2的OD₆₀₀值增加缓慢；当初始pH为6.0-10.0时，OD₆₀₀值较高；当初始pH为11.0时，菌株DC-R2的OD₆₀₀值未见增加；其中，当初始pH为8.0时，OD₆₀₀值最高，说明最适生长pH为8.0 (图3D)。

图3  菌株DC-R2培养条件。A：最适培养基；B：戈登氏菌DC-R2生长曲线；C：最适温度；D：最适pH。

Figure 3  Optimization of culture conditions for strain DC-R2. A: The optimization of different medium; B: The growth curve of strain Gordonia sp. DC-R2; C: The optimization of temperature; D: The optimization of pH.

2.4 DC-R2菌株降解ZEN受不同条件的影响

在温度为37 ℃、初始pH 8.0的条件下，菌株DC-R2能在6 h内完全降解5 μg/mL的ZEN；在3 h内，ZEN含量迅速减少，降解率达到90%；在3-6 h内，剩余的ZEN被完全降解。菌株DC-R2在0-6 h迅速生长，到6 h时，OD₆₀₀值约为0.18，6-9 h时，DC-R2生长速度减缓，9 h时样品中DC-R2浓度最高，OD₆₀₀值可达0.20，9-12 h时样品OD₆₀₀值迅速下降，最终15 h时OD₆₀₀约为0.12 (图4A)。在初始pH为3.0-11.0的范围内，ZEN降解率呈现先升高后降低的趋势。当初始pH为7.0-10.0时，DC-R2对ZEN的降解率极高，达到95%以上；其中，当初始pH为8.0时，ZEN被完全降解。在酸性及强碱性条件下，ZEN的降解率明显下降，说明降解ZEN的活性物质在中性及弱碱性环境下具有最佳活性，而在酸性及强碱性环境下活性被明显抑制(图4B)。当温度在15-45 ℃范围内时，DC-R2对ZEN的最适降解温度为37 ℃，在4 h内能完全降解5 μg/mL的ZEN，降解率达到100%；其次为28 ℃，降解率约为60%；当温度为15 ℃和45 ℃时，ZEN的降解率明显降低，6 h内ZEN的降解率分别约为40%和20% (图4C)。随着ZEN初始浓度的增加，ZEN降解率逐渐降低。当ZEN初始浓度为5 μg/mL时，DC-R2对ZEN的降解效果最好，降解率为100%；当ZEN初始浓度为30-50 μg/mL时，ZEN降解率仅约20% (图4D)。

图4  菌株DC-R2降解ZEN的条件。A：时间；B：pH；C：温度；D：ZEN浓度。

Figure 4  Optimization of ZEN degradation conditions by strain DC-R2. A: Optimization of time; B: Optimization of pH; C: Optimization of temperature; D: ZEN concentration.

2.5 菌株DC-R2降解ZEN活性位置定位及粗酶液降解效果

在温度为37 ℃、ZEN初始浓度为6 μg/mL的条件下孵育12 h后，DC-R2全细胞和菌株破碎的上清对ZEN的降解率达到100%，而灭活菌体、全细胞培养上清液及煮沸处理后的破碎菌体上清对ZEN的降解率均在10%以下(图5A)。此外，在同等条件下，菌体破碎后的上清液中加入蛋白酶K、SDS及SDS与蛋白酶K处理后，其对ZEN的降解率分别下降到13.62%、10.14%和10.07% (图5B)。由此推测降解ZEN的活性物质存在于细胞内。为了进一步验证菌株DC-R2降解ZEN的活性酶位置，分别取ZEN降解完全的全细胞、全细胞培养上清液和全细胞破碎后收集的粗酶液，并用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白质浓度对粗酶液中的蛋白质进行定量(9.6 mg/mL)。结果表明，该全细胞破碎后收集的粗酶液与全细胞在温度为37 ℃条件下，20 min内对初始浓度为6 μg/mL的ZEN降解率分别达到100%和90%以上，而全细胞培养上清液在60 min内未将ZEN降解(图5C)。继续在37 ℃条件下孵育2 h后，将含有6 μg/mL ZEN的全细胞培养上清液和全细胞破碎后得到的粗酶液分别再用HPLC法检测。结果显示，在粗酶液中并未检测到ZEN的存在，而细胞培养上清液中仍然可以检测出约6 μg/mL浓度的ZEN。

图5  菌株DC-R2降解ZEN活性物质定位及粗酶液降解效果。A：DC-R2不同组分对ZEN降解率的影响；B：SDS与蛋白酶K对DC-R2破碎后的上清液降解ZEN的影响；C：不同时间粗酶液对ZEN的降解情况。

Figure 5  Localization of ZEN-degrading active substances in strain DC-R2 and degradation efficiency of crude enzyme solution. A: Effects of different components of DC-R2 on ZEN degradation rates; B: Effects of SDS and protease K on ZEN degradation in supernatant after bacteroid disruption; C: Effects of crude enzyme solution on ZEN degradation at different times.

2.6 金属离子对粗酶液降解ZEN效果的影响

在温度为37 ℃、ZEN初始浓度为5 μg/mL的条件下，不同金属离子对粗酶液降解ZEN的效果展现出了显著差异，Mn²⁺、Mg²⁺和Ca²⁺这3种金属离子对粗酶液的影响相对微弱，它们存在时粗酶液对ZEN的降解率依然保持在100%，表明这些金属离子在此浓度下并未对粗酶液的降解活性产生明显的抑制作用。相比之下，Ni²⁺与Co²⁺则对粗酶液的降解效果产生了一定程度的影响，导致降解率下降至大约50%，这意味着这2种金属离子在一定程度上干扰了粗酶液的降解功能，但并未完全抑制其活性。Fe²⁺、Cu²⁺和Zn²⁺则严重抑制了粗酶液对ZEN的降解能力，在它们存在的情况下，ZEN降解率分别急剧下降至22%、11%和2.5%左右。此外，EDTA的引入也会影响粗酶液对ZEN的降解效果，ZEN降解率下降至14.5%左右。上述研究表明这些金属离子在给定浓度下显著干扰了粗酶液的降解机制，几乎完全抑制了其降解ZEN的能力。EDTA作为一种高效的金属螯合剂，在加入反应体系后，能够迅速与溶液中的金属离子结合形成稳定且不易解离的络合物。这一现象揭示了菌株DC-R2中降解酶的一个关键特性：它对金属离子具有较高的敏感性。因此，当反应体系中的金属离子被EDTA螯合而减少时，菌株DC-R2的降解酶会因此失去这些必要的金属离子支持，从而导致其降解活性显著降低(图6)。

3 讨论

ZEN是最常见的污染性真菌毒素之一，主要由禾谷镰刀菌产生，对人类食品安全和动物饲料安全构成严重威胁。因此，寻找高效安全的脱毒方法对于保障我国食品和饲料安全具有重要意义。本研究以ZEN为唯一碳源，从土壤样品中筛选到了一株可高效降解ZEN的戈登氏菌DC-R2，在37 ℃、初始pH 8.0的条件下培养6 h后，对ZEN (5 μg/mL)降解率为100%。

戈登氏菌属放线菌是一类棒状稀有放线菌。1971年，Tsukamura首次从土壤中分离出戈登氏菌属细菌；1988年，Tsukamura等^[27]及Stackebrandt等^[28]通过16S rRNA基因序列分析，将其归为Gordona属，随后更名为Gordonia。Liu等^[29]从鸡渗滤液富集培养物中分离出可降解17β-雌二醇的Gordonia属菌株R9，并对其生长条件进行优化，发现Gordonia sp. R9可以耐受较宽的温度(4-40 ℃)和pH值(1.0-11.0)。Wang等^[30]则分离出能降解水溶液和土壤中邻苯二甲酸二正辛酯污染的Gordonia sp. Lff，并发现其最佳温度和pH值分别为35 ℃和8.0^[30]。本研究对菌株DC-R2进行16S rRNA基因序列扩增并测序，通过序列比对，发现DC-R2与Gordonia westfalica Kb2序列同源性最高，因此推测菌株DC-R2属于戈登氏菌属。为了探究不同培养条件对菌株生长的影响，我们设置了不同温度条件对DC-R2进行培养，结果发现在28-37 ℃时菌株DC-R2的OD₆₀₀值呈稳定上升趋势，因此推测其最适温度在37 ℃左右，与Liu等^[29]和Wang等^[30]研究戈登氏菌的最适温度相近。戈登氏菌具有特异的生物降解功能，Chandramouli Swamy等^[31]分离鉴定出一株菌株Gordonia sp. CN2K，该菌株能在45 d内降解40.43%的PET微塑料。Frantsuzova等^[32]研究表明菌株Gordonia polyisoprenivorans 135含有芳香族化合物分解代谢基因，能够利用多种芳香族化合物。Guo等^[33]以四甲基菊酯作为唯一碳源，从活性污泥中分离出一株可高效降解四菊酯的细菌，经鉴定为Gordonia cholesterolivorans A16。Silva等^[34]鉴定出2株Gordonia sp.菌株，分别为MTZ052和MTZ096，其对正十六烷的降解率分别为86%和100%^[34]。

尽管已有众多关于戈登氏菌降解环境污染物的研究，但关于其对ZEN的降解却未见报道^[35]。因此，关于戈登氏菌降解ZEN的研究可丰富戈登氏菌属的生物降解功能认知。目前，关于降解ZEN的微生物多见于其他菌属，如Lee等^[2]分离鉴定出一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) LN可在36 h后使ZEN浓度降低了92%。Zhai等^[36]从动物肠道内容物中分离得到一株产孢梭菌(Clostridium sporogenes) F39，该菌在48 h内对ZEN的降解率为87.35%。Gan等^[37]发现了2株可降解ZEN的乳杆菌，分别为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei) 85和布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri) 93，其在48 h内的降解率分别达到77.7%和72.8%^[37]。本研究筛选到的一株戈登氏菌DC-R2，在温度为37 ℃、初始pH 8.0的条件下，3 h内将ZEN (5 μg/mL)降解90%左右，并在6 h内完全降解，其降解效率远高于已报道的菌株。由于菌株的生长活性和降解率受培养条件的影响，在生长环境适宜、营养条件充分的情况下，观察到菌株的高生长活性，从而充分降解ZEN^[16]。因此，我们对其最适培养基进行筛选，并探究其不同生长及降解的时间、温度、pH等条件下的生长情况，以期找到最适生长降解条件使其高效降解ZEN。

王继雯等^[38]从有机磷农药严重污染的土壤中分离鉴定出一株假单胞菌(Pseudomonas stutzeri) J7-4，该菌能高效降解有机磷农药，并定位其降解酶为胞内酶，该酶最适pH为9.0，最适反应温度为45 ℃。为了定位降解ZEN的活性酶位置，我们对ZEN诱导后的不同组分在温度为37 ℃条件下进行ZEN降解活性的测定，结果发现DC-R2全细胞和菌株破碎的上清液可将ZEN (5 μg/mL)完全降解，而全细胞的上清液与煮沸处理后的菌株破碎的上清液对ZEN几乎无降解效果。初步认定菌株破碎的上清液可能对ZEN具有降解效果。进一步对菌体破碎后的上清液样品进行加蛋白酶K；加蛋白酶K (1 mg/mL)和1% SDS和热处理后与ZEN (5 μg/mL)共同孵育12 h后并用HPLC检测ZEN残留量，结果发现处理后的样品对ZEN的降解率均下降到10%以下。为了进一步验证活性物质的位置及其降解效果，再次对不同时间的全细胞与破碎后的菌体上清液的降解效率进行研究。结果发现，在37 ℃条件下，全细胞与破碎后的菌体上清液在30 min内对6 μg/mL的ZEN降解率为100%，全细胞上清在60 min内对ZEN基本无降解。上述结果表明，菌株DC-R2能够降解ZEN的原因并非菌株的吸附作用；菌株DC-R2降解ZEN的酶可能并非分泌到胞外，而是定位于胞内。因此，DC-R2降解ZEN的作用主要归因于细胞内酶的降解作用。ZEN能够被胞内酶降解的原因可能是，当以ZEN为唯一碳源培养菌株DC-R2时，其通过感知周围环境中的碳源浓度变化调控转运蛋白的表达，这些转运蛋白起到了通道的作用，使得ZEN能够通过细胞膜进入细胞内部从而达到摄取碳源的目的^[39]。我们推测，在菌株DC-R2中，存在具有转运真菌毒素ZEN的通道蛋白，它们将ZEN转运到胞内被活性酶进一步降解。后续研究可通过高效液相色谱质谱法、转录组和蛋白质组学的方法挖掘菌株DC-R2对ZEN的代谢途径和降解酶，并解析其降解的分子机制。

Bi等^[40]通过基因工程的手段，在毕赤酵母中表达出可降解ZEN的酶ZENC，将800单位的ZENC添加到含有可溶物的干谷物副产品(distillers dried grains with solubles, DDGS)、玉米副产品以及玉米麸皮(各25 g)的实验中，观察到了显著的ZEN浓度下降现象。DDGS中的ZEN浓度降低了70.9%，玉米副产品中的ZEN浓度减少了88.9%，而玉米麸皮中的ZEN浓度更是大幅下降了94.7%。ZENC的所有这些特性都使其在动物饲料和食品行业具有广阔的应用前景。因此，我们未来将进一步挖掘DC-R2中降解ZEN的关键活性酶，并通过体外克隆表达和纯化获得高效率的ZEN降解酶。目前，我们已经通过全基因组测序和转录组分析，初步挖掘到ZEN降解的代谢途径，包括各种内酯酶、水解酶、脱羧酶和硫酯酶等，这些酶可能在ZEN降解过程中起到重要的作用。

4 结论

本研究以ZEN为唯一碳源进行分离筛选，从土壤样品中筛选出一株高效降解ZEN的菌株DC-R2。通过形态学和16S rRNA基因测序分析表明该菌株属于戈登氏菌属(Gordonia sp.)。降解试验表明，DC-R2菌株降解ZEN的最佳条件为温度37 ℃、pH 8.0、培养时间在6 h内，DC-R2菌株可将初始浓度为5 μg/mL的ZEN完全降解。活性物质定位试验发现，该菌株主要通过胞内酶发挥ZEN的降解作用。

作者贡献声明

陈昌翠：实验设计、实验操作、数据处理、文章撰写及修改；王乾支：数据整理、文章撰写；孙洋洋：实验设计、实验操作、文章修改；陈静：实验指导、文章指导；闫达中：实验指导、文章指导；邱东茹：实验指导、文章指导；戴景程：实验设计、实验指导、文章指导及修改。

利益冲突

作者声明不存在任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。