摘要
目的
聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate, PET)的生物酶法解聚是通过PET水解酶催化PET水解,得到终产物对苯二甲酸和乙二醇。通过基因挖掘获得新的PET水解酶,可为废弃PET的生物酶法解聚提供可用于分子改造的蛋白。
方法
通过基因挖掘的方法发现来源于Alkalilimnicola ehrlichii的未知功能蛋白(命名为AePETase)具有水解无定形PET膜的活性,并对AePETase进行异源表达、纯化和酶学性质研究。
结果
确定了AePETase的Tm值为(53.0±0.7) ℃,最适反应温度为45 ℃,最适缓冲液体系为Na2HPO4-NaH2PO4 (100 mmol/L, pH 8.0),较合适的酶浓度为1.0 µmol/L以内。在45 ℃条件下,无定形PET膜的水解产物量为已报道的IsPETase的13.4倍(72 h)。
结论
AePETase对PET具有较好的水解活性,是一种具有较大潜力的PET水解新酶。
聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate, PET)是由对苯二甲酸(terephthalic acid, TPA)和乙二醇(ethylene glycol, EG)通过酯键连接而成的一种应用广泛的石油基合成聚合
现阶段大部分PET塑料制品为一次性消费品,废弃后主要通过物理、化学和生物法3种方式实现降解与循环利用。物理再生法是将废PET塑料经过清洗、破碎、再加工等方式得到PET纤维或PET瓶等再生产品;化学循环法是将废弃PET材料通过化学法完全或部分降解为单体或低聚物,实现循环利用,主要方法包括水解法、氨解法、醇解法和热降解法
近年来,已从微生物中发现多种可降解PET的PET水解酶,如角质酶和PETase等。角质酶是存在于大多数植物病原菌和腐生植物中的胞外丝氨酸酯
本研究以IsPETase的氨基酸序列作为模板进行BLAST,对中常温PET水解酶进行基因挖掘,并将重组质粒转入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中进行异源表达、纯化以及酶学性质研究,以期为废弃PET的生物酶法解聚提供可进一步改造的新酶催化剂。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒
菌株E. coli BL21(DE3)和质粒pET-22b(+)均由本实验室保存;含有PET水解酶基因的重组质粒pET22b-AmPETase和pET22b-AePETase委托苏州金唯智生物科技有限公司天津分公司合成。
1.1.2 主要试剂和仪器
氨苄青霉素(ampicillin, Amp)购自北京兰博利德商贸有限公司;异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)购自北京索莱宝科技有限公司;无定形PET膜(Goodfellow, 250 µm)购自顾特服(上海)贸易有限公司。
Agilent 1260 Infinity II,安捷伦科技有限公司;酶标仪,Molecular Devices公司;恒温摇床,上海知楚仪器有限公司;高压灭菌锅,上海伯能仪器有限公司。
1.2 PET水解酶的基因挖掘
以来源于I. sakaiensis 201-F6的IsPETase氨基酸序列为模板,使用蛋白聚类分析工具(enzyme similarity tool, EFI)在UniProtKB数据库(https://www.uniprot.org/)中进行BLAST,通过设定alignment score threshold值对BLAST得到的所有序列进行序列相似性比较,进而构建得到序列相似网络图(sequence similarity network, SSN)。使用Cytoscape v.3.10.3软件对序列相似网络图进行可视化,选择IsPETase所在簇中的100条序列,并使用MEGA软件进行多序列比对,去除不合群序列。使用邻接法将剩余序列构建系统发育树,选用步长检验的检验方法,设置检验次数为1 000次。距离模型选择P-distance,部分删除多序列比对中含有空位的列。最终得到的步长检验合并树大多数的节点可信度大于70%,进而通过考虑所属分支、序列相似性、菌属来源等因素选择了2条候选序列进行蛋白表达与活性表征。
1.3 PET水解酶的表达与纯化
将PET水解酶表达载体pET22b-AmPETase和pET22b-AePETase转入E. coli BL21(DE3)中,涂布平板,37 ℃培养12 h长出单克隆菌落。挑取单菌落于20 mL LB培养基中,37 ℃、220 r/min培养12-16 h,以体积分数1%的接种量接种到1 L LB培养基中,37 ℃、220 r/min摇床培养至OD600为0.6-0.8,加入诱导剂IPTG,使其终浓度为0.1 mmol/L,20 ℃继续培养24 h。培养完成后,使用4 ℃、5 000 r/min低温高速离心机离心50 min,收集菌体与上清液粗酶液。使用0.45 µm滤膜将粗酶液过膜处理后,再使用5 kDa滤膜浓缩至原体积的10%。0.22 µm滤膜过膜处理后,使用AKTA纯化仪和5 mL HisTrap HP层析柱纯化蛋白,A液为含300 mmol/L NaCl的50 mmol/L NaH2PO4缓冲液(pH 8.0),B液为含300 mmol/L NaCl和250 mmol/L咪唑的50 mmol/L NaH2PO4缓冲液(pH 8.0)。利用不同浓度咪唑梯度洗脱的方式得到纯化后的蛋白,再使用50 mL HiPrep 26/10脱盐柱将纯化后蛋白置换至Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(100 mmol/L,pH 8.0)中,保存于-80 ℃。
1.4 PET水解酶表观熔化温度(Tm值)的测定
使用荧光热稳定性测定法检测PET水解酶的Tm值。检测方法:将20 µL蛋白混合液(包含0.5 mg/mL纯化后蛋白10 µL,超纯水2.5 µL,蛋白质染液2.5 µL和蛋白质染液缓冲液5 µL)转移到96孔PCR板中,用光学质量密封胶带密封,并在ABI 7500 FAST RT-PCR仪中以1%的加热速率从25 ℃加热到99 ℃。监测升温过程中蛋白质变性的荧光信号变化,Tm值由一阶导数曲线确定。
1.5 PET水解酶活性的测定
标准品标准曲线的配制:标准品有对苯二甲酸单羟乙酯[mono(2-hydroxyethyl) terephthalate, MHET]、对苯二甲酸(terephthalic acid, TPA)。分别配制成10 mmol/L母液,并稀释至10-1 000 µmol/L的梯度标准溶液,通过HPLC检测可得到标准品的标准曲线。
HPLC检测条件:EF-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 µm),流动相为Na2HPO4-NaH2PO4 (20 mmol/L, pH 7.0)缓冲液,内含30%-70%乙腈线性梯度液,流速为0.8 mL/min,上样量为10 µL,检测波长为260 nm。
PET水解酶活性的测定:在2 mL Na2HPO4-NaH2PO4 (100 mmol/L, pH 8.0)缓冲液中,将0.5 µmol/L纯酶与6 mm圆形无定形PET膜(Goodfellow, 8.3 mg)分别在30 ℃和40 ℃条件下反应48 h。加入等体积含有25%乙腈的缓冲液终止反应,对样品进行稀释和过膜处理(0.22 µm滤膜)后,用于高效液相色谱分析。
1.6 酶水解反应的最适温度研究
酶水解活性测定温度设置为30、35、40、45、50 ℃,分别取24 h和72 h样品,终止反应后检测水解产物TPA、MHET含量,HPLC检测方法同1.5节。
1.7 酶水解反应的最适缓冲液体系研究
酶水解活性测定缓冲液分别设置为Na2HPO4-NaH2PO4 (100 mmol/L, pH 7.0)、Na2HPO4-NaH2PO4 (100 mmol/L, pH 8.0)、Tris-HCl (50 mmol/L, pH 8.0)、KH2PO4 (100 mmol/L, pH 8.0)、Glycine-NaOH (100 mmol/L, pH 9.0),分别取24 h和72 h样品,终止反应后检测水解产物TPA和MHET的含量,HPLC检测方法同1.5节。
1.8 酶水解反应的最适酶量研究
酶水解活性测定的酶浓度设置为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 µmol/L,分别取24 h和72 h样品,终止反应后检测水解产物TPA和MHET的含量,HPLC检测方法同1.5节。
1.9 PET水解酶与IsPETase水解活性比较
在45 ℃、2 mL Na2HPO4-NaH2PO4 (100 mmol/L, pH 8.0)缓冲液条件下,分别进行0.5 µmol/L AePETase和IsPETase纯酶与6 mm无定形PET膜的水解反应,分别取24 h和72 h样品,终止反应后检测水解产物量,比较PET水解酶与IsPETase水解产物TPA和MHET的含量,HPLC检测方法同1.5节。
2 结果与分析
2.1 PET水解酶的挖掘
如

图1 以IsPETase为模板构建的序列相似性网络(A)和系统发育树(B)
Figure 1 Sequence similarity network (A) and phylogenetic tree (B) constructed with IsPETase as the template.
2.2 酶的可溶性表达与纯化
对挖掘到的PET水解酶基因进行合成,转入E. coli BL21(DE3)中后,用IPTG进行诱导表达,并通过SDS-PAGE分析AmPETase和AePETase在E. coli BL21(DE3)中的可溶性表达情况。如

图2 SDS-PAGE分析AmPETase (A)和AePETase (B)的可溶性表达及纯化后的AmPETase和AePETase (C)
Figure 2 SDS-PAGE analysis of soluble expression of AmPETase (A) and AePETase (B), and the purification efficiency of AmPETase and AePETase (C). 1: Protein marker; 2: pET22b(+); 3: Extracellular crude enzyme supernatant of pET22b-AmPETase; 4: Extracellular crude enzyme supernatant of pET22b-AePETase; 5: Purified AmPETase; 6: Purified AePETase.
2.3 热稳定性测定
通过ABI 7500 FAST RT-PCR仪检测从25 ℃加热到99 ℃过程中蛋白质变性的荧光信号变化,确定一阶导数曲线,计算PET水解酶的平均Tm值。AmPETase的Tm值为(54.6±1.4) ℃,AePETase的Tm值为(53.0±0.7) ℃。因此推断AmPETase和AePETase均为中常温PET水解酶。
2.4 无定形PET膜水解活性
分别在30 ℃和40 ℃条件下,在2 mL Na2HPO4-NaH2PO4 (100 mmol/L, pH 8.0)缓冲液中将0.5 µmol/L纯酶与6 mm圆形无定形PET膜反应48 h。如

图3 两种新酶在30 ℃ (A)和40 ℃ (B)水解无定形膜产物量
Figure 3 Total amount of products from the hydrolysis of amorphous membranes by AmPETase and AePETase at 30 ℃ (A) and 40 ℃ (B).
2.5 最适温度
在30-50 ℃条件下,进行AePETase与无定形PET膜水解反应,检测了24 h和72 h的TPA与MHET总产量。如

图4 不同温度下无定形膜水解产物总量
Figure 4 Total amount of products from the hydrolysis of amorphous membranes at different temperatures.
2.6 最适缓冲液与pH
选择总产物量较高的反应温度40 ℃和45 ℃,分别在以下5种缓冲液体系中进行AePETase与无定形PET膜水解反应:Na2HPO4-NaH2PO4 (100 mmol/L, pH 7.0)、Na2HPO4-NaH2PO4 (100 mmol/L, pH 8.0)、Tris-HCl (50 mmol/L, pH 8.0)、KH2PO4 (100 mmol/L, pH 8.0)、Glycine-NaOH (100 mmol/L, pH 9.0),检测24 h和72 h的TPA与MHET总产量。如

图5 40 ℃ (A)和45 ℃ (B)条件下,不同缓冲液体系无定形膜水解产物总量
Figure 5 Total amount of products from the hydrolysis of amorphous membranes with different buffer systems at 40 ℃ (A) and 45 ℃ (B). PB: Na2HPO4-NaH2PO4; KPB: KH2PO4.
2.7 最适酶量
在酶浓度设置为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 µmol/L的条件下,进行AePETase与无定形PET膜水解反应,检测了24 h和72 h的TPA与MHET总产量。如

图6 不同酶浓度无定形膜水解产物总量
Figure 6 Total amount of products from the hydrolysis of amorphous membranes with different enzyme concentrations.
2.8 AePETase与IsPETase水解PET的活性比较
如

图7 AePETase与IsPETase水解无定形膜产物总量比较
Figure 7 Comparison of the total amount of products from the hydrolysis of amorphous membranes by AePETase and IsPETase.
3 讨论与结论
PET塑料已成为固体垃圾和海洋微塑料污染的重要来源之一,对废弃PET进行有效地降解回收,是解决固体废弃物污染的重要方向。在本研究中,通过基因挖掘手段挑选了2条以IsPETase为模板挖掘到的中常温候选PET水解酶,并在E. coli BL21(DE3)中实现了异源表达与酶学性质研究。研究发现,与IsPETase处于同一分支的AePETase相较于IsPETase对无定形PET膜具有更显著的水解活性,而不同分支的AmPETase虽实现了可溶性表达与纯化,但与无定形PET膜反应时未检测到水解产物。结构分析发现2条候选新酶均具有与IsPETase相似的Ser-His-Asp催化三联体。考虑到无定形PET膜是由TPA和EG构成的长链大分子且具有一定结晶度,而结晶度对PET水解酶的反应速率有较大影
对AePETase的酶学性质检测表明,该酶在40-45 ℃具有较高的水解活性,最适缓冲液体系为Na2HPO4-NaH2PO4 (100 mmol/L, pH 8.0),而Tris-HCl (50 mmol/L, pH 8.0)和Glycine-NaOH (100 mmol/L, pH 9.0)均未检测到水解产物,原因可能是这2种缓冲液体系影响了AePETase的水解活性。在对酶浓度进行优化的过程中发现,AePETase较为合适的酶浓度为1.0 µmol/L以内,高浓度的酶并不会产生更多产物,这种现象与目前大多数PET水解酶相似。在确定最适条件后,对AePETase与已报道的IsPETase进行了水解活性比较,发现AePETase的水解活性远高于IsPETase,是一种具有较高潜力的PET水解新酶。后续可通过分子改造等方法提高AePETase的水解活性和热稳定性。
作者贡献声明
赵伟:PET水解酶的挖掘、性能测试及文章撰写;毕海珍:PET水解酶的克隆表达;Yew Maxine:PET水解酶的活性测试;翟欢欢:部分数据分析及文章修改;张翠英:实验设计及文章修改;朱蕾蕾:整体实验设计及文章修改。
利益冲突
作者声明不存在任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。
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