内生菌

摘要

目的

探索盐胁迫环境下大豆根瘤内生菌对大豆幼苗生长的影响，为黄河流域作物高质量发展提供参考。

方法

以‘徐豆20’为实验材料，设置对照组、盐胁迫组和盐胁迫接种内生菌组3组处理，在人工气候条件下采用盆栽法探究不同盐胁迫下接种内生菌对大豆幼苗生长的影响。

结果

在盐胁迫条件下，接种内生菌72时，大豆幼苗培养至21 d时，使用OD₆₀₀=0.75菌悬液(2:1)接种，当盐浓度为200 mmol/L时，过氧化氢酶(catalase, CAT)活性最高，为2.010 0 U/g FW，比盐胁迫组高出54.02%；使用OD₆₀₀=0.33的菌悬液(1:2)接种时，在盐浓度为 300 mmol/L时，脯氨酸含量最高，为0.028 6 mg/g，而在盐浓度为100 mmol/L时，脯氨酸含量比盐胁迫组高出64.38%。接种内生菌146时，大豆幼苗培养至21 d时，使用OD₆₀₀=0.50的菌悬液(1:1)接种，在盐浓度为50 mmol/L时，CAT活性最高，为1.350 0 U/g FW；培养至28 d，使用OD₆₀₀=0.75的菌悬液(2:1)接种，在盐浓度为100 mmol/L时，CAT活性比盐胁迫组高出272.73%；在盐浓度为150 mmol/L时，脯氨酸含量最高，为0.147 0 mg/g，比盐胁迫组高出860.78%。由此可见，在盐胁迫条件下，接种内生菌72和146均具有一定的修复作用。总体而言，接种内生菌146后，大豆幼苗的CAT活性和脯氨酸含量均显著高于盐胁迫组，说明内生菌146的修复作用更为明显。基于16S rRNA基因序列及系统发育分析结果，菌株72与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)最相似，相似率为99.45%；菌株146与解蛋白芽孢杆菌(Bacillus proteolyticus)最相似，相似率为100%。

结论

接种内生菌可有效缓解黄河流域盐碱土壤对大豆幼苗生长的不利影响，对研发生物防治剂具有重要意义。

关键词

内生细菌; 大豆幼苗; 盐胁迫; 过氧化氢酶; 脯氨酸; 修复作用

大豆原产于中国，是我国居民饮食中不可或缺的蛋白质来源，也是油料和饲料制造产业的重要原料^[1]。土壤盐渍化会降低土壤溶液的渗透压，从而限制大豆的生长和产量^[2]，土壤中积累的Na⁺和Mg²⁺对植物形态的维持产生不利影响，导致植株光合作用减弱、叶绿素合成量减少。盐离子在氮代谢过程中会产生有毒中间体，导致植物生理性缺水，抑制其代谢活动，阻碍营养物质的吸收利用，最终使植株生长发育不良，作物产量降低^[3]。在盐胁迫下，植物体内超氧自由基、过氧化氢等活性氧的浓度会升高，这些物质对植物细胞具有毒害作用，会引起膜脂过氧化^[4]，进而危害植株生长。我国盐碱地总面积达9 913万hm²，约占全国土地面积的1/10，面积大且分布广^[5]，严重危害大豆的生长和发育。因此，采取恰当措施改善土壤盐渍化状况，有效缓解盐渍化对作物的危害，以促进大豆的生长和发育，对推动黄河流域生态保护和高质量发展具有重要意义。

植物内生菌(endophyte)是指在正常和恶劣环境条件下，生长在植物组织间及组织内，并对植物生长发育起促进作用的微生物类群^[6]。植物内生细菌主要存在于植物根系^[7]。内生菌分布广泛、种类繁多，几乎存在于所有植物中。作为一种新型微生物资源，内生菌具有丰富的物种多样性，可用于发掘新型天然活性物质，经过内生菌与宿主植物的长期协同进化，内生菌还能产生与宿主植物相同或类似的活性成分^[8]。由于内生菌生活在植物组织中，可直接与植物细胞保持密切接触，从而更易直接发挥促进作用^[9]。研究表明，内生菌能够增加杨树(Populus alba L.)抗氧化酶的产量以及脯氨酸含量，从而促进盐胁迫下杨树的生长^[10]；葫芦[Lagenaria siceraria (Molina) Standl.]内生真菌能够防治黄瓜(Cucumis sativus L.)病害^[11]；内生芽孢杆菌(Bacillus)可减轻作物受到的非生物胁迫和生物胁迫，包括调节水分运输、养分吸收以及激活抗氧化和防御系统^[12]，并通过诱导胁迫响应基因、植物激素和胁迫相关代谢物的表达来增强其植物宿主的胁迫耐受性^[13]。以上研究结果表明，内生菌具有促进宿主植物生长、防治植物病原菌、增强宿主抗胁迫能力等功能。然而，目前关于利用大豆内生菌缓解盐胁迫对大豆幼苗生长影响的研究相对较少^[14]。基于此，本研究以‘徐豆20’为实验材料，在人工气候条件下设置不同程度的盐胁迫，探究接种内生细菌72和146对盐胁迫下大豆幼苗生长的影响，以期为缓解土壤盐渍化对大豆幼苗的不良影响以及研发接种剂或生物菌肥提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

‘徐豆20’ (国审豆2014012)，系豫东黄河故道流域大面积种植品种，采购自商丘市睢阳区老杨种子经营部。

内生细菌72和146由商丘市农业微生物资源利用重点实验室从大豆根瘤中分离纯化，短期保藏于斜面培养基中。

牛肉膏蛋白胨固体培养基^[15](g/L)：牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，琼脂18.0，蒸馏水1.0 L，121 ℃灭菌20 min。

LB液体培养基^[15](g/L)：NaCl 15，酵母膏30，蛋白胨30，蒸馏水2 L，按NaCl、蛋白胨、酵母膏的顺序，依次煮沸后关火，分装于250 mL锥形瓶中，121 ℃灭菌20 min。

1.2 菌悬液配制

1.2.1 菌株活化

在超净工作台上，用无菌接种环从斜面培养基上挑取菌体，划线于斜面培养基上，标记后置于28 ℃培养箱中培养2 d，重复上述步骤进行2次活化，每次培养2 d。

1.2.2 菌株快速繁殖

在LB液体培养基中接种经2次活化的菌体，30 ℃、130 r/min培养3 d，至对数生长期(OD₆₀₀约为0.8)。

1.2.3 菌悬液配制

在超净工作台中，将菌悬液分装至50 mL离心管中，10 000 r/min离心10 min保留沉淀。用10 mL无菌水冲洗沉淀2次，再加入10 mL无菌水，置于磁力搅拌器上涡旋振荡摇匀。使用分光光度计在波长600 nm处测定，将菌液与无菌水按比例配制成OD₆₀₀约为1.00的半成品，置于4 ℃冰箱中保存备用。按半成品与无菌水的不同比例，分别配制成1:1 (OD₆₀₀=0.50)、1:2 (OD₆₀₀=0.33)和2:1 (OD₆₀₀=0.75)的菌悬液。

1.3 盐浓度梯度设置

称量NaCl，用无菌水分别配制成50、100、150、200、250、300 mmol/L的盐溶液。

1.4 大豆的挑选

挑选豆粒饱满、色泽鲜艳、无霉变、种皮完好无破损的 ‘徐豆20’ 4 000粒，每400粒为1包，放冰箱保鲜备用。

1.5 大豆幼苗的培养

采用蛭石作为栽培基质，将蛭石装袋后在高压灭菌锅中121 ℃灭菌20 min，每袋蛭石隔夜连续灭菌2次。选用口径Φ20 cm、深度15 cm的花盆作为栽培容器，用报纸包裹后在高压灭菌锅中121 ℃灭菌20 min。将干、湿蛭石搅拌均匀，较疏松地铺满花盆2/3，稍压实平整，标记为CK0、CK (NaCl)、1:1、1:2、2:1。CK0共9盆，其余处理组各设置6个不同的盐浓度梯度，其中50、100、150 mmol/L的盐胁迫各设3个重复，200、250、300 mmol/L的盐浓度各设4个重复。在超净工作台中，用无菌水冲洗大豆2遍，挑选45粒不破皮、饱满的大豆，置于培养皿中，加入30 mL无菌水，在培养箱中培养2 h；吸出培养皿中的无菌水，对照组加入30 mL无菌水，不同比例菌悬液处理组各加入30 mL相应比例的菌悬液，继续在培养箱中培养1 h。将经不同比例菌悬液(1:1、1:2、2:1)浸泡的大豆种植于相应花盆中，无菌水浸泡的大豆种植于CK0和CK (NaCl)的花盆中，每盆种植30粒。种植完毕后，用蛭石覆盖大豆，用无菌水浇灌蛭石，置于人工气候培养箱中培养。第2天，用30 mL不同浓度的盐溶液浇灌蛭石；第3天，除对照组和盐胁迫组用无菌水浇灌外，其余处理组分别接种相应比例的菌悬液。此后，每3 d为1个周期，每天依次按照无菌水、盐胁迫、盐胁迫接菌的顺序浇灌盆栽。

1.6 取样

对照组9盆共分为3组，每组设置3个重复。采用在蛭石深处不断根的方法，从每组重复中取样8株幼苗。其余盐胁迫组和盐胁迫接菌组(盐胁迫+1:1；盐胁迫+1:2；盐胁迫+2:1)，分别按照盐浓度梯度50、100、150、200、250、300 mmol/L设置6个小组，以同样方法在每个相同盐浓度梯度的3/4个重复中共取8株大豆幼苗，进行详细记录后置于冰箱保存备用。

1.7 过氧化氢酶(catalase, CAT)活性测定

采用紫外吸收法^[16]测定CAT活性。配制pH 7.8的磷酸缓冲液(A液8.5 mL，B液 91.5 mL)和pH 7.0的磷酸缓冲液(A液39.0 mL，B液61.0 mL)，再加入30% H₂O₂配成CAT反应液。称取0.1 g叶片，加入1.5 mL pH 7.8的磷酸缓冲液，在冰上研磨后，置于1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心20 min。将紫外分光光度计波长设置为240 nm，对照组为3 mL pH 7.8缓冲液，实验组为3 mL pH 7.0缓冲液和0.1 mL离心后的上清液。分别测定对照组、盐胁迫组、盐胁迫接菌组(NaCl+1:1、NaCl+1:2、NaCl+2:1)中不同盐浓度梯度在0 s和40 s时的CAT活性，每个处理组相同盐浓度共测定3组，记录数据。

1.8 脯氨酸含量测定

采用磺基水杨酸比色法^[17]测定脯氨酸含量。准备82支试管并标号，不同处理组相同盐浓度分别标有3支试管。在每个试管中分别加入 2 mL 3%磺基水杨酸、2 mL冰醋酸和4 mL 2.5%酸性茚三酮溶液。称取0.2 g茎，加入10 mL 3%磺基水杨酸研磨，倒入2个5 mL离心管中，将离心管放入80 ℃水浴锅中水浴10 min，冷却后以3 000 r/min离心10 min。每个离心管分别吸取3 mL上清液，加入相同标号的3支试管中，使每个试管中有2 mL上清液。拍照记录脯氨酸反应前的颜色，试管口封膜后置于100 ℃，将试管放在水浴锅中水浴1.5 h，拍照记录脯氨酸反应后的颜色。冷却后加入4 mL甲苯，摇晃并拍照观察脯氨酸分层现象。从每个试管中吸取3 mL甲苯上层提取液，将相同3支试管中的9 mL提取液合并到洁净的小烧杯中。将分光光度计波长设置为520 nm，对照组为4 mL甲苯溶液，实验组为红色甲苯上层提取液，测定含量并记录数据。

1.9 菌株16S rRNA基因测序及系统发 育树构建

采用CTAB法^[18]提取内生菌72和146的基因组DNA，利用正向引物P1 (5′-CGGGATCCA GAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′)和反向引物P2 (5′-CGGG ATCCTACGGCTACC TTGTTACGACTTCACCCC-3′)进行PCR扩增。PCR反应体系(25 μL)：2×Phanta Max Mix (p515) 12.5 µL，正、反向引物(10 µmol/L)各 1 µL，DNA模板0.5 µL，ddH₂O 10 µL。PCR反应条件：95 ℃预热5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共36个循环；72 ℃再延伸2 min，4 ℃下保持。扩增产物送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序，根据测序结果在GenBank中进行BLAST比对，使用DNAMAN 6.0软件分析相似性，用DNAStar软件对待测菌株序列进行反向互补转换，用MEGA 5.05构建系统发育树，确定待测菌株的系统发育地位。

1.10 数据处理

利用SPSS 26.0软件对数据进行Duncan’s新复极差法差异检验分析、单因素随机方差分析(one-way ANOVA)和最小显著差数法(least significant difference, LSD)分析，显著性水平设定为P<0.05。数据处理完成后，使用Excel 2010绘制折线图或柱状图，分析不同程度盐胁迫下接种内生菌72和146对大豆幼苗CAT活性和脯氨酸含量的影响。

2 结果与分析

2.1 内生菌代表菌株系统发育分析

对菌株72和146进行16S rRNA基因测序，获得长度为1 500 bp的DNA片段。测序所得序列已提交至GenBank，获得序列号分别为OR487866和OR485250。利用模式菌株序列构建系统发育树(图1)。系统发育树分析表明，菌株72和146与参比模式菌株形成分支I，边缘菌株为弧菌属(Calditerrivibrio)。通过DNAMAN软件进行同源性分析，结果显示菌株72与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) subsp. HUB-I-047^T (GQ892930)的相似性最高，相似率为99.45%；菌株146与解蛋白芽孢杆菌(Bacillus proteolyticus) MCCC 1A00365^T (KJ812418)的相似性为100%。因此，菌株72和146均属于芽孢杆菌属，其最相似菌株分别为枯草芽孢杆菌(B. subtilis)和解蛋白芽孢杆菌(Bacillus proteolyticus)。

图1  内生菌72和146基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树

Figure 1  Phylogenetic tree based on the sequences of the 16S rRNA gene sequence of endophytic bacteria 72 and 146. Numbers in parentheses represent sequence numbers in GenBank.

2.2 内生菌72对大豆幼苗CAT活性的影响

如图2所示，当大豆幼苗培养至21 d时，在盐胁迫条件下，CAT活性随盐浓度升高总体呈“波浪线”趋势。在盐浓度为50 mmol/L时，CAT活性最高，为1.470 0 U/g FW，比对照组高68.97%；而在盐浓度为300 mmol/L时，酶活性最低，为0.832 5 U/g FW。接种内生菌72后，用NaCl+1:1菌悬液处理大豆幼苗，CAT活性变化仍呈“波浪线”趋势，且酶活性均低于盐胁迫组；在盐浓度为300 mmol/L时，CAT活性最低，为0.472 5 U/g FW；在盐浓度为50 mmol/L时，酶活性最高，为1.065 0 U/g FW，比对照组高22.41%，但低于盐胁迫组27.55%，修复作用不显著。用NaCl+1:2菌悬液处理时，酶活性总体呈“波浪线”变化趋势；在盐浓度为50 mmol/L时，酶活性最低，为0.585 0 U/g FW；在盐浓度为100 mmol/L时，酶活性最高，为1.132 5 U/g FW，比对照组高30.17%，但低于盐胁迫组16.57%；在盐浓度为250 mmol/L时，酶活性比盐胁迫组高9.65%。用NaCl+2:1菌悬液处理时，酶活性总体呈“波浪线”变化趋势；在盐浓度为100 mmol/L时，酶活性最低，为0.600 0 U/g FW时；盐浓度为 200 mmol/L和300 mmol/L时，酶活性均高于盐胁迫组，且在盐浓度为200 mmol/L时，酶活性最高，为2.010 0 U/g FW，比对照组高131.03%，比盐胁迫组高54.02%。综上所述，在盐胁迫条件下，NaCl+1:2菌悬液在盐浓度为250 mmol/L时表现出一定的修复作用；NaCl+2:1菌悬液在盐浓度为200 mmol/L和300 mmol/L时均表现出修复作用，其中最佳修复作用的盐浓度为200 mmol/L。

图2  大豆幼苗接种内生菌72培养至21 d时的CAT活性

Figure 2  CAT activity of soybean seedlings inoculated with endophytic bacteria 72 and cultured for 21 days. Different lowercase letters indicate significant differences at the P<0.05 level. The same below.

如图3所示，当大豆幼苗培养至28 d时，随着盐浓度的升高，CAT活性呈“波浪线”变化趋势。在盐浓度为100 mmol/L时，酶活性最低，为1.102 5 U/g FW；而在盐浓度为 300 mmol/L时，酶活性最高，为1.657 5 U/g FW，比对照组高7.46%。接种内生菌72后，用NaCl+1:1菌悬液处理大豆幼苗，酶活性呈“先降后升再降”趋势；在盐浓度为50、100和250 mmol/L时，酶活性均高于盐胁迫组，但在盐浓度为300 mmol/L时，酶活性最低，为0.960 0 U/g FW；在盐浓度为250 mmol/L时，酶活性最高，为1.657 5 U/g FW，比对照组高7.46%，比盐胁迫组高36.42%。用NaCl+1:2菌悬液处理大豆幼苗时，酶活性呈“波浪线”变化趋势；在盐浓度为50 mmol/L时，酶活性最低，为 0.735 0 U/g FW；在盐浓度为300 mmol/L时，酶活性最高，为1.252 5 U/g FW，低于对照组18.80%，低于盐胁迫组24.43%；在盐浓度为100 mmol/L时，酶活性高于盐胁迫组0.68%。用NaCl+2:1菌悬液处理时，酶活性呈“波浪线”变化趋势；在盐浓度为250 mmol/L时，酶活性最低，为0.622 5 U/g FW；在盐浓度为100 mmol/L时，酶活性最高，为1.252 5 U/g FW，比盐胁迫组高13.61%，修复作用最为显著。由此可见，3种菌悬液接种大豆后均表现出一定的修复作用；NaCl+1:1菌悬液在盐浓度为50、100和250 mmol/L时均表现出修复作用，且在250 mmol/L时修复作用最为显著；NaCl+1:2菌悬液和NaCl+2:1菌悬液在盐浓度为100 mmol/L时表现出修复作用。

图3  大豆幼苗接种内生菌72培养至28 d时CAT活性

Figure 3  CAT activity of soybean seedlings inoculated with endophytic bacteria 72 and cultured for 28 days.

2.3 内生菌146对大豆幼苗CAT活性的影响

如图4所示，当大豆幼苗培养至21 d时，CAT活性随盐浓度升高呈“波浪线”变化。在盐胁迫条件下，盐浓度为150 mmol/L时，酶活性最高，为2.482 5 U/g FW，比对照组高76.69%；盐浓度为200 mmol/L时，酶活性最低，为0.412 5 U/g FW。接种内生菌146后，用NaCl+1:1菌悬液处理时，酶活性呈“先降后升”趋势；盐浓度为200 mmol/L时，酶活性最低，为0.720 0 U/g FW，比盐胁迫组高74.55%；盐浓度为50 mmol/L时，酶活性最高，为1.350 0 U/g FW，比盐胁迫组低26.23%。用NaCl+1:2菌悬液处理时，酶活性总体呈“波浪线”变化；盐浓度为100 mmol/L时，酶活性最低，为0.682 5 U/g FW；盐浓度为300 mmol/L时，酶活性最高，为0.900 0 U/g FW，比盐胁迫组低43.66%。用NaCl+2:1菌悬液处理，酶活性呈“波浪线”变化趋势；盐浓度为50 mmol/L时，酶活性最低，为0.615 0 U/g FW；盐浓度为250 mmol/L时，酶活性最高，为0.795 0 U/g FW，比对照组低43.42%，比盐胁迫组低40.11%。3种不同比例的菌悬液接种后，对大豆幼苗发挥修复效果的盐浓度均为200 mmol/L。

图4  大豆幼苗接种内生菌146培养至21 d时的CAT活性

Figure 4  CAT activity of soybean seedlings inoculated with endophytic bacteria 146 and cultured for 21 days.

如图5所示，大豆幼苗培养至28 d时，随着盐浓度升高，盐胁迫组CAT活性呈现“先降后升”趋势。盐浓度为50 mmol/L时，酶活性最高，为0.360 0 U/g FW，比对照组高33.33%；盐浓度为100 mmol/L时，酶活性最低，为0.165 0 U/g FW。接种内生菌146后，用NaCl+1:1菌悬液处理时，酶活性呈现“先升后降再升”趋势；盐浓度为200 mmol/L时，酶活性最低，为0.165 0 U/g FW；盐浓度为100 mmol/L时，酶活性最高，为0.472 5 U/g FW，比对照组高75.00%，比盐胁迫组高186.36%。用NaCl+1:2菌悬液处理时，酶活性呈现“先升后降再升”趋势；盐浓度为50 mmol/L时，酶活性最低，为0.210 0 U/g FW；盐浓度为200 mmol/L时，酶活性最高，为0.637 5 U/g FW，比对照组高136.11%，比盐胁迫组高165.63%，修复作用最显著。用NaCl+2:1菌悬液处理时，酶活性总体呈现“先降后升再降”趋势，均高于盐胁迫组；盐浓度为200 mmol/L时，酶活性最低，为0.472 5 U/g FW，比对照组高75.00%，比盐胁迫组高96.88%；盐浓度为250 mmol/L时，酶活性最高，为0.660 0 U/g FW，比对照组高144.44%，比盐胁迫组高144.44%。综上所述，不同比例菌悬液处理，对盐胁迫幼苗均有一定的修复作用；NaCl+1:1菌悬液发挥修复作用的盐浓度为100 mmol/L，NaCl+1:2菌悬液和NaCl+2:1菌悬液发挥最佳作用的盐浓度分别为200 mmol/L和100 mmol/L。

图5  大豆幼苗接种内生菌146培养至28 d时的CAT活性

Figure 5  CAT activity of soybean seedlings inoculated with endophytic bacteria 146 and cultured for 28 days.

2.4 内生菌72对大豆幼苗脯氨酸含量的影响

如图6所示，当大豆幼苗培养至21 d时，脯氨酸含量随盐浓度升高呈现“先升后降”趋势。在盐胁迫条件下，盐浓度为200 mmol/L时，脯氨酸含量最高，为0.023 0 mg/g，比对照组高18.56%。接种内生菌72，用1:1菌悬液处理时，脯氨酸含量呈现“先降后升”趋势；盐浓度为100 mmol/L时，脯氨酸含量最低，为0.015 9 mg/g，比盐胁迫组高8.90%；盐浓度为300 mmol/L时，脯氨酸含量最高，为 0.023 0 mg/g，比对照组高18.56%，比盐胁迫组高29.94%，修复作用最显著。用NaCl+1:2菌悬液处理时，脯氨酸含量总体呈“先升后降再升”趋势；除盐浓度为200 mmol/L外，其他盐胁迫条件下，脯氨酸含量均高于盐胁迫组；盐浓度为50 mmol/L时，脯氨酸含量最低，为 0.018 9 mg/g，比盐胁迫组高21.15%；盐浓度为300 mmol/L时，脯氨酸含量最高，为 0.028 6 mg/g，比对照组高47.42%，比盐胁迫组高61.58%，修复作用最显著。用NaCl+2:1菌悬液处理时，脯氨酸含量呈“波浪线”变化；除盐浓度为250 mmol/L和300 mmol/L外，其他盐胁迫条件下，脯氨酸含量均高于盐胁迫组；盐浓度为250 mmol/L时，脯氨酸含量最低，为0.017 1 mg/g；盐浓度为100 mmol/L时，脯氨酸含量最高，为0.024 0 mg/g，比对照组高23.71%，比盐胁迫组高64.38%，修复作用最显著。综上所述，不同比例菌悬液处理盐胁迫下的大豆幼苗后，脯氨酸含量均有一定升高，表现出一定的修复作用，且NaCl+1:1、NaCl+1:2、NaCl+2:1菌悬液发挥最佳作用的盐浓度分别为300、300、100 mmol/L。

图6  大豆幼苗接种内生菌72培养至21 d时的脯氨酸含量

Figure 6  Proline content of soybean seedlings inoculated with endophytic bacteria 72 and cultured for 21 days.

如图7所示，大豆幼苗生长至28 d时，脯氨酸含量呈现“波浪线”变化趋势。在盐胁迫条件下，当盐浓度为200 mmol/L时，脯氨酸含量最低，为0.011 4 mg/g；而盐浓度为 250 mmol/L时，脯氨酸含量最高，为 0.016 6 mg/g，比对照组高12.16%。接种内生菌72后，用NaCl+1:1菌悬液处理时，脯氨酸含量呈现“波浪线”变化；盐浓度为200 mmol/L时，脯氨酸含量最低，为0.009 9 mg/g；盐浓度为250 mmol/L时，脯氨酸含量最高，为0.016 3 mg/g，比对照组高10.14%，但比盐胁迫组低1.81%。在盐浓度为50、100和300 mmol/L时，脯氨酸含量分别比盐胁迫组高3.03%、6.98%和5.74%。用NaCl+1:2菌悬液处理时，脯氨酸含量呈现“先降后升再降”趋势；盐浓度为150 mmol/L时，脯氨酸含量最低，为0.012 7 mg/g，与盐胁迫组相等；盐浓度为 250 mmol/L时，脯氨酸含量最高，为0.016 0 mg/g，比对照组高8.11%，但比盐胁迫组低3.61%。在其盐浓度下，脯氨酸含量均高于盐胁迫组。用NaCl+2:1菌悬液处理时，脯氨酸含量呈现“波浪线”变化；除盐浓度为 100 mmol/L和250 mmol/L外，其余盐浓度下脯氨酸含量均高于盐胁迫组。盐浓度为100 mmol/L时，脯氨酸含量最低，为0.012 1 mg/g；盐浓度为300 mmol/L时，脯氨酸含量最高，为0.016 4 mg/g，比对照组高10.81%，比盐胁迫组高34.43%，修复作用最为显著。综上所述，1:1、1:2和2:1比例的菌悬液对盐胁迫下的大豆幼苗均具有一定的修复作用，其最佳修复作用的盐浓度分别为100、200、300 mmol/L。

图7  大豆幼苗接种内生菌72培养至28 d时的脯氨酸含量

Figure 7  Proline content of soybean seedlings inoculated with endophytic bacteria 72 and cultured for 28 days.

2.5 内生菌146对大豆幼苗脯氨酸含量的影响

如图8所示，大豆幼苗培养至21 d时，脯氨酸含量随盐浓度升高呈现“先升后降”趋势。在盐胁迫条件下，盐浓度为150 mmol/L时，脯氨酸含量最低，为0.015 3 mg/g；盐浓度为 300 mmol/L时，脯氨酸含量最高，为0.062 9 mg/g，比对照组高285.89%。接种内生菌146后，用NaCl+1:1菌悬液处理大豆幼苗，脯氨酸含量总体呈“波浪线”变化；除盐浓度为200 mmol/L和300 mmol/L外，其余盐浓度下，脯氨酸含量均高于盐胁迫组；盐浓度为100 mmol/L时，脯氨酸含量最低，为0.030 4 mg/g，比对照组高86.50%，比盐胁迫组高31.03%；盐浓度为250 mmol/L时，脯氨酸含量最高，为0.062 3 mg/g，比对照组高282.21%，比盐胁迫组高209.95%。用NaCl+1:2菌悬液处理时，脯氨酸含量呈“波浪线”变化，且均高于盐胁迫组；盐浓度为100 mmol/L时，脯氨酸含量最低，为0.037 7 mg/g，比对照组高131.29%，比盐胁迫组高62.50%；盐浓度为150 mmol/L时，脯氨酸含量最高，为 0.135 8 mg/g，比对照组高733.13%，比盐胁迫组高787.58%，修复作用最为显著。用NaCl+2:1菌悬液处理时，脯氨酸含量变化呈“先升高后降低”趋势；除300 mmol/L盐胁迫外，其他盐浓度下，脯氨酸含量均高于盐胁迫组；盐浓度为300 mmol/L时，脯氨酸含量最低，为0.034 1 mg/g，比对照组高109.20%；盐浓度为150 mmol/L时，脯氨酸含量最高，为0.147 0 mg/g，比对照组高801.84%，比盐胁迫组高860.78%，表现出最显著的修复作用。综上所述，在盐胁迫条件下，大豆幼苗接种3种比例的菌悬液后均表现出一定的修复作用；NaCl+1:1、NaCl+1:2、NaCl+2:1菌悬液发挥最佳作用的盐浓度分别为250、150和150 mmol/L。

图8  大豆幼苗接种内生菌146培养至21 d时的脯氨酸含量

Figure 8  Proline content of soybean seedlings inoculated with endophytic bacteria 146 and cultured for 21 days.

如图9所示，当大豆幼苗培养至28 d时，脯氨酸含量呈“先升后降再升”变化。在盐胁迫条件下，盐浓度为50 mmol/L时，脯氨酸含量最低，为0.014 1 mg/g；盐浓度为 300 mmol/L时，脯氨酸含量最高，为0.110 2 mg/g，比对照组高540.70%。接种内生菌146后，用NaCl+1:1菌悬液处理时，脯氨酸含量呈“先降后升再降”趋势；盐浓度为 150 mmol/L时，脯氨酸含量最低，为0.013 5 mg/g；盐浓度为250 mmol/L时，脯氨酸含量最高，为0.024 5 mg/g，比对照组高42.44%，比盐胁迫组低3.92%；盐浓度为 50 mmol/L时，脯氨酸含量高于盐胁迫组57.45%。用NaCl+1:2菌悬液处理时，脯氨酸含量呈“波浪线”变化；除盐浓度为250 mmol/L外，其他盐浓度下，脯氨酸含量均低于盐胁迫组；盐浓度为50 mmol/L时，脯氨酸含量最低，为0.012 1 mg/g；盐浓度为250 mmol/L时，脯氨酸含量最高，为0.056 6 mg/g，比对照组高229.07%，比盐胁迫组高54.95%。用NaCl+2:1菌悬液处理时，脯氨酸含量变化呈“先降后升”趋势；盐浓度为200 mmol/L时，脯氨酸含量最低，为0.012 5 mg/g；盐浓度为300 mmol/L时，脯氨酸含量最高，为0.062 2 mg/g，比对照组高261.63%，比盐胁迫组低43.56%；盐浓度为 50 mmol/L和250 mmol/L时，脯氨酸含量分别高于盐胁迫组54.61%和100.78%。综上所述，NaCl+1:1菌悬液在50 mmol/L盐浓度下发挥修复作用，NaCl+1:2菌悬液在250 mmol/L盐浓度下发挥修复作用，NaCl+2:1菌悬液在250 mmol/L盐浓度下表现出最佳修复作用。

图9  大豆幼苗接种内生菌146培养至28 d时的脯氨酸含量

Figure 9  Proline content of soybean seedlings inoculated with endophytic bacteria 146 and cultured for 28 days.

3 讨论与结论

3.1 接种内生菌对大豆幼苗CAT活性的影响

过氧化氢酶(CAT)作为一种清除羟基自由基的酶，能够减轻植株氧化损伤，维持细胞内氧的动态平衡，通过提高植物的抗氧化能力，CAT对植物抵抗逆境胁迫具有重要意义^[19]。本研究结果表明，在盐胁迫条件下，随着盐浓度的升高，大豆幼苗CAT活性总体呈现“波浪线”变化趋势。沈金铃等^[20]研究发现，盐胁迫会引起桉树(Eucalyptus spp.)活性氧(reactive oxygen species, ROS)代谢失衡，导致H₂O₂积累和膜脂过氧化；不同盐胁迫强度下，6个CAT基因表现出不同的转录差异，其响应机制也不同，该研究结果有力支持了本研究的结论。周莹等^[21]发现，荆芥(Nepeta cataria L.)幼苗在不同盐胁迫下的反应不同：轻度盐胁迫时，叶片内CAT活性升高，清除活性氧的能力增强，维持植株的正常生长；而当盐胁迫程度增加时，酶活性受到抑制，质膜受损严重，稳定性下降，荆芥生长受到抑制，这与本研究的结论相符。朱金方等^[22]指出，植物在遭受盐胁迫时，叶片在一定程度内具有抗氧化酶活性和抗氧化能力来清除活性氧自由基，但当盐胁迫强度超过这一限度时，CAT活性会下降，抗氧化能力受到抑制，这一结果也支持了本研究的结论。此外，本研究还发现，接种内生菌72和146后，在一定盐浓度下，大豆幼苗的CAT活性显著升高，高于对照组和盐胁迫组，且幼苗长势良好，未出现发黄或萎蔫现象，说明2种内生菌能够增强盐胁迫下大豆幼苗的CAT活性，促进植株生长，缓解盐胁迫对幼苗的危害。赵欣桐等^[23]研究发现，接种混合菌液B3014后，可增强狗牙根(Cynodon dactylon L.)的渗透调节能力，缓解盐胁迫对其的毒害作用，使植株在生长过程中保持稳定状态，这与本研究的结论一致。佐长赓等^[24]发现，接种SHZ-24、SMT-24、SHT-15、BHZ-29等菌株后，可显著提高棉花(Gossypium spp.)防御酶CAT、SOD等抗氧化酶的活性，缓解盐胁迫对棉株的毒害作用，增强其抗病性。董芮萌等^[25]研究发现，内生菌能够增强水稻(Oryza sativa L.)幼苗在镉和盐单一及复合胁迫下的抗氧化酶活性，提高其对不良环境的抵抗能力，以上研究结果均与本研究结论基本一致。此外，研究还表明，菌株CB7对番茄(Solanum lycopersicum L.)具有显著的修复作用，具有开发为生物肥料以提高土壤肥力和促进植物生长的潜力^[26]，这也为本研究结论提供了有力支持。综上所述，内生菌72和146能够显著提高盐胁迫下大豆幼苗的CAT活性，但本研究仅探讨了内生菌浸种和盆栽接种对大豆幼苗在不同盐浓度下CAT活性的影响，不同大豆品种在相同盐浓度下对内生菌的响应仍需进一步研究。

通过盆栽试验，本研究进一步探究了盐胁迫下接种内生菌72和146对大豆幼苗CAT活性的影响。结果表明，接种内生菌72后，当大豆幼苗培养至21 d时，用NaCl+2:1菌悬液处理，盐浓度为200 mmol/L时，CAT活性最高，为2.010 0 U/g FW，比盐胁迫组高54.02%；培养至28 d时，用NaCl+1:1菌悬液处理，盐浓度为250 mmol/L时，CAT活性最高，为1.657 5 U/g FW，高于盐胁迫组36.42%。接种内生菌146后，生长至21 d，用NaCl+1:1菌悬液处理大豆幼苗，盐浓度为50 mmol/L，CAT活性最高为1.350 0 U/g FW，但盐浓度为200 mmol/L时，CAT活性比盐胁迫组高74.55%；培养至28 d时，用2:1菌悬液处理，盐浓度为250 mmol/L时，CAT活性最高，为0.660 0 U/g FW，盐浓度为100 mmol/L时，CAT活性比盐胁迫组高272.73%，修复作用更为显著。综上所述，内生菌72和146均能显著提高盐胁迫下大豆幼苗的CAT活性，有效缓解盐胁迫对幼苗的危害，为生物防治菌剂的开发和利用提供了理论基础。

3.2 接种内生菌对大豆幼苗脯氨酸含量的影响

脯氨酸(Pro)是一种广泛存在的渗透调节物质，在植物生长发育以及响应干旱胁迫的信号途径中发挥重要作用^[27]。研究表明，脯氨酸在盐胁迫条件下能够诱导抗氧化生物合成相关基因(Cu/Zn-SOD和APX)和离子稳态相关基因(SOS1、HKT1和NHX1)的表达^[28]。通过提高植株体内抗氧化酶的活性以及脯氨酸含量，可以降低或清除活性氧浓度，稳定细胞膜结构，维持细胞内营养离子的平衡稳态，从而发挥促生作用^[29]。本研究结果表明，在大豆幼苗培养期间，盐胁迫下脯氨酸含量随盐浓度升高总体呈现“先升后降”趋势，说明大豆幼苗对盐胁迫具有一定的抵抗能力，但当盐浓度超过阈值时，其大豆幼苗的抵抗能力减弱，调节盐胁迫的能力有限。Gyawali等^[30]发现，在盐胁迫条件下，油菜(Brass caicampestris L.)的脯氨酸含量增加，这一结果支持了本研究的结论。Ghaid等^[31]发现，随着水体盐度的增加，大麦(Hordeum vulgare L.)基因型的脯氨酸含量也随之增加。钟华等^[32]发现，在盐胁迫条件下，扁蓿豆(Pocockia ruthenia L.)幼苗通过提高脯氨酸含量来缓解NaCl和Na₂CO₃胁迫造成的伤害，但当浓度超过400 mmol/L时，其效果减弱。以上结果均与本研究结论一致。此外，本研究还表明，接种内生菌72和146后，提高了大豆幼苗的脯氨酸含量，显著高于盐胁迫组，有助于清除细胞内活性氧，提高大豆抵抗盐胁迫的能力，增强大豆的存活率，从而发挥促生作用。尤其是接种内生菌72后，在培养至21 d时，盐浓度为100 mmol/L，用NaCl+2:1菌悬液接种；以及接种内生菌146后，在培养至21 d时，盐浓度为150 mmol/L，用NaCl+2:1菌悬液接种，对大豆幼苗的修复作用最为显著。随着培养时间的延长，大豆幼苗对环境的适应性增强，脯氨酸含量在28 d时低于21 d，表明修复能力有所下降。徐亚军等^[33]研究发现，在盐胁迫条件下接种内生菌252和254后，随着培养时间的延长，小麦体内的脯氨酸含量下降，且随着盐浓度的升高，脯氨酸含量呈现“先升高后降低”的趋势，这一结果有力地支持了本研究的结论。杜欣等^[34]发现，小麦(Triticum aestivum L.)叶片中脯氨酸含量与培养时间和NaCl浓度呈一定相关性，在低盐胁迫环境下，紫茎泽兰(Eupatorium coelestinum L.)内生细菌表现出一定的修复能力，但在高浓度盐胁迫(NaCl为300 mmol/L)或延长培养时间后，修复作用减弱，效果不明显，这与本研究结论基本一致。Lastochkina等^[35]发现，内生细菌B. subtilis对盐胁迫(2% NaCl)下的小麦植株具有保护作用，盐胁迫导致幼苗体内脯氨酸含量显著增加，而接种B. subtilis 10-4的幼苗脯氨酸含量增加不明显，这与本研究结果相符。此外，Yoolong等^[36]研究了内生菌株对盐胁迫下水稻(Oryza sativa L.)的影响，阐明内生菌通过增加脯氨酸含量来促进水稻生长和耐盐性，从而发挥促生作用。综上所述，内生菌72和146能够缓解盐胁迫对大豆幼苗造成的损害，具有一定的修复能力，但随着培养时间的延长，修复能力有所下降，其具体机制有待进一步研究。

通过研究内生菌72和146对盐胁迫下大豆幼苗的修复效果发现，接种内生菌72后，在培养至21 d时，用NaCl+2:1菌悬液处理，盐浓度为100 mmol/L时，脯氨酸含量最高，为0.024 0 mg/g，比盐胁迫组高64.38%；培养至28 d时，用NaCl+2:1菌悬液处理，盐浓度为300 mmol/L时，脯氨酸含量最高，为0.016 4 mg/g，比盐胁迫组高34.43%。接种内生菌146后，在培养至21 d时，用NaCl+1:2和NaCl+2:1菌悬液处理，盐浓度为150 mmol/L时，脯氨酸含量均最高，分别为0.135 8 mg/g和0.147 0 mg/g，分别比盐胁迫组高787.58%和860.78%；培养至28 d时，用NaCl+2:1菌悬液处理，盐浓度为300 mmol/L时，脯氨酸含量最高，为0.062 2 mg/g，盐浓度为250 mmol/L时，脯氨酸含量比盐胁迫组高100.78%。由此可见，内生菌72和146能够显著提高脯氨酸含量，使大豆幼苗的生长情况优于盐胁迫组，充分发挥对盐胁迫危害的缓解与修复作用，但随着培养时间的延长，修复作用逐渐减弱。

作者贡献声明

赵龙飞：实验总体设计；徐亚军：实验开展及论文撰写；杨静雅：数据处理及分析；黄雪珍：协助数据处理和校对；宋唯一：英文翻译及校对；杜丽平：实验开展及论文撰写。

利益冲突

作者声明不存在任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。