高光限氮对莱茵衣藻响应环烷酸胁迫的影响

摘要

目的

探究油脂积累型模式藻株莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)响应环烷酸胁迫的生理生化适应机制。

方法

通过研究高光富氮和高光限氮条件下，典型环烷酸——环己烷甲酸(cyclohexanecarboxylic acid, CHCA)暴露对高初始密度培养的莱茵衣藻生长、光合活性、培养液pH值、氮磷元素吸收及脂质、碳水化合物、蛋白质、色素等生理生化组分的影响，以全面评估莱茵衣藻对CHCA的耐受性。

结果

在高光富氮条件下，CHCA暴露显著促进了莱茵衣藻对磷元素的吸收，同时显著增加了C16:0脂肪酸的相对丰度，而降低了C18:3n3脂肪酸的相对丰度；而在高光限氮条件下，CHCA暴露显著抑制了莱茵衣藻的光合活性以及对磷元素的吸收，但并未对其脂肪酸组成产生显著影响。此外，无论是高光富氮还是高光限氮条件下，CHCA暴露均未对莱茵衣藻的生长、培养液pH值以及脂质、碳水化合物、蛋白质和叶绿素含量产生明显影响。

结论

微藻对环境胁迫的耐受性可通过生长曲线直观表征，并可通过藻细胞的生长、光合活性、氮磷吸收及关键生化组分综合考量进行评估。高光富氮条件通过促进磷元素吸收和改变脂肪酸组成，增强了莱茵衣藻对环烷酸的耐受性；而高光限氮条件则通过抑制光合活性和磷元素吸收，减弱了莱茵衣藻对环烷酸的耐受性。这些发现可为筛选与构建高度耐受环烷酸的藻株培养策略提供借鉴。

关键词

莱茵衣藻; 环烷酸; 高光限氮; 生长; 光合活性; 氮磷元素吸收; 脂肪酸标志物

环烷酸是环烷烃的羧基衍生物，以无环、单环和多环脂环族羧酸的复杂混合物形式天然存在油砂尾矿和原油采油废水中，能对细菌、藻类、原生动物、无脊椎动物、鱼类和哺乳动物等多种生物产生毒性作用^[1]。一直以来环烷酸都是采油废水典型石油烃修复去除的重点组分，研究环烷酸的生态毒性对其污染的风险评估和生态修复具有重要意义^[2]。近年来，发掘利用能够有效降解环烷酸的生物资源已成为相关领域的研究热点^[3-6]。

Ruffell等^[5]研究表明，单细胞真核微藻能够对环烷酸进行生物降解。一些模式藻株因生长周期短、光合固碳效率高、资源化利用潜力大等优势，成为理想的“细胞工厂”，符合低碳与绿色生产的需求，受到越来越多的关注。然而，有效降解环烷酸的前提在于这些微藻对环烷酸具有较强的耐受性，因此深入探究微藻对环烷酸污染的生理响应和适应机制非常重要。Woodworth等^[7]率先考察了21株原生微藻对环烷酸的耐受性，其中19株微藻在14 d内可耐受0-1 000 mg/L的环烷酸。已知加拿大的油砂工艺影响水(oil sands process-affected water, OSPW)是一种典型环烷酸废水，通常具有独特的真核微生物群落^[8-9]，其中绿藻、蓝藻、硅藻、甲藻、裸藻、共球藻和黄群藻等典型类群都可以耐受背景浓度20 mg/L以上的环烷酸污染水体^[10]，并且微藻群落结构的演替与环烷酸环境浓度存在明显关联特征^[11]。由此推测，环烷酸污染水体中的原生微藻可能对环烷酸具有一定耐受性和降解潜力。然而，环境污染物只是造成了明显的物种局域特化，生物通过成为“已经是最适合的”或“还不是最适合的” 2种类型与环境条件相匹配。此后，众多学者先后报道了环烷酸对多株藻种保藏中心的绿藻、金藻、硅藻和甲藻的生长、光合活性、细胞形态、转录组畸变、抗氧化酶活性和生化组分等方面的影响^[12-19]。因此，通过耐受性检验筛选与特定生境(环烷酸污染水体)相匹配或精确匹配的潜在微生物(微藻)成为一种有效手段。有必要全面评估微藻对环烷酸暴露的耐受性能，以期构建高度耐受环烷酸的藻株培养策略，这将有助于加快筛选高效去除环烷酸的潜力修复藻株。

前期研究发现，在弱光富氮标准生长条件下，环己烷甲酸(cyclohexanecarboxylic acid, CHCA)暴露能显著抑制模式绿藻莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的生长和光合活性，还能显著改变其脂肪酸组成^[15]。户外采油废水的处理环境条件通常为高光强和氮限制，而高光限氮也是诱导微藻积累油脂的有效措施^[20]。此外，利用微藻处理废水通常需要优先培养出高密度的藻细胞培养液以提高其废水处理效率。前期研究考察的是低初始密度培养体系下环烷酸对莱茵衣藻的生物毒性，而有关高初始密度培养体系下莱茵衣藻响应环烷酸暴露的氮磷去除效率和油脂积累等方面尚未见报道。

本研究以油脂积累型莱茵衣藻(淀粉合成缺陷株)为研究对象，分别在高光富氮和限氮条件下，对比表征CHCA暴露对高初始密度接种的藻细胞生长、光合活性、培养液pH值、色素组成、氮磷元素吸收、生化组分(脂质、碳水化合物和蛋白质)、脂肪酸组成及其生物标志物的影响。相关结果有助于进一步阐明莱茵衣藻对环烷酸暴露的响应机理，从而为环烷酸高效降解的机制解析和耐受藻种/株培养策略的构建提供科学基础。

1 材料与方法

1.1 藻种(株)预培养

选用的莱茵衣藻淀粉合成缺陷株BAFJ5 (cw15 sta6, CC4348)购自美国莱茵衣藻中心(http:// www.chlamycollection.org/)。实验前，在三羟甲基氨基甲烷-乙酸盐-磷酸盐(Tris-acetate-phosphate, TAP)培养基中25 ℃、120 r/min振荡培养，继代培养体积为150 mL，培养周期为3-4 d。培养条件为初始接种光密度值(OD₇₅₀)为0.1 (藻细胞密度约为1×10⁵个/mL)，光周期为12 h光照:12 h黑暗，光照强度为80 μmol/(m²·s)。实验所用藻株培养代数不超过10代。

1.2 莱茵衣藻对CHCA的耐受性实验

考虑到某采油废水处理厂二级气浮出水的环烷酸浓度在50 mg/L左右，据文献报道，采油废水中环烷酸浓度通常不高于100 mg/L^[12,21]，因此CHCA (纯度99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)的梯度浓度设置为0 (对照组)、50和100 mg/L^[15]，对照组为加有0.1 mol/L NaOH溶液的TAP培养基藻液，实验组为分别加有50 mg/L和100 mg/L CHCA的TAP培养基藻液。用0.1 mol/L NaOH溶解5 g/L和10 g/L的CHCA母液，CHCA母液经稀释100倍后加入TAP培养基中，并调整初始接种OD₇₅₀。

莱茵衣藻对CHCA的耐受性实验通过阶段培养实现：第一阶段为弱光富氮条件 (LL+N)下的低初始密度培养，以收集足够藻细胞用于CHCA暴露实验；第二阶段为高光富氮或限氮(HL+N或HL-N)条件下的高初始密度培养。第一阶段的光照强度为80 μmol/(m²·s)，初始OD₇₅₀为0.10±0.02，25 ℃、130 r/min振荡培养，光周期为12 h光照:12 h黑暗，培养体积为350 mL (摇瓶体积为500 mL，光程为6 cm)，培养时间为3 d；第二阶段的光照强度为600 μmol/(m²·s)，用含相应浓度CHCA的富氮或限氮TAP培养基重悬第一阶段收集的浓缩藻液(25 ℃、4 000 r/min离心5 min)，并调整其OD₇₅₀至0.70±0.02 (约7×10⁶个/mL)。在此接种密度下，莱茵衣藻经高光限氮培养后能积累大量油脂^[20]，25 ℃、140 r/min振荡培养，光周期为24 h光照，培养体积为200 mL (摇瓶体积为200 mL，光程为5 cm)，培养时间为6 d，每组设3个生物学重复。

1.3 藻细胞生长、光合活性和培养液pH值测定

利用紫外-可见分光光度计(PerkinElmer公司)测定藻细胞培养液在750 nm下的光密度值(OD₇₅₀)，采用质量差法测定藻细胞干重密度：将2-10 mL藻细胞培养液过滤至预称重的玻璃纤维滤膜(孔径1.2 μm，Whatman公司)，60 ℃烘干至恒重(净生物质量≥2 mg)。

通过叶绿素荧光仪(Water-PAM WALZ公司)测定藻细胞光系统II (photosystem II, PS II)的最大光量子产率F_v/F_m。采用pH计(Mettler toledo公司)测定藻细胞培养液的pH值。

1.4 藻细胞色素含量测定

采用乙醇萃取法测定藻细胞色素含量^[22]。取0.5-2 mL藻细胞培养液，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，弃上清后加入1.0 mL无水乙醇。使用超声波破碎仪(昆山市超声仪器有限公司)处理10 min (250 W、25 ℃)后再次离心，收集上清液至刻度试管中。重复上述步骤2次后，合并提取液并定容。在470、649和665 nm处测定色素提取液的吸光度(A₄₇₀、A₆₄₉和A₆₆₅)。根据公式(1)-(4)计算藻细胞的叶绿素和类胡萝卜素含量。

$$\mathrm{C}\mathrm{h}\mathrm{l}\mathrm{a}(\mathrm{\mu }\mathrm{g}/\mathrm{m}\mathrm{L})=(\mathrm{13.95}{A}_{\mathrm{665}}-\mathrm{6.88}{A}_{\mathrm{649}})\times n$$

(1)

$$\mathrm{C}\mathrm{h}\mathrm{l}\mathrm{b}(\mathrm{\mu }\mathrm{g}/\mathrm{m}\mathrm{L})=\left(\mathrm{24.96}{A}_{\mathrm{649}}-\mathrm{7.32}{A}_{\mathrm{665}}\right)\times n$$

(2)

$$\mathrm{C}\mathrm{h}\mathrm{l}(\mathrm{a}+\mathrm{b})(\mathrm{m}\mathrm{g}/\mathrm{g})=(\mathrm{18.08}{A}_{\mathrm{649}}+\mathrm{6.63}{A}_{\mathrm{665}})\times n/\mathrm{D}\mathrm{C}\mathrm{W}$$

(3)

$$\mathrm{C}\mathrm{a}\mathrm{r}(\mathrm{m}\mathrm{g}/\mathrm{g})=[(\mathrm{1}\mathrm{000}{A}_{\mathrm{470}}-\mathrm{3.27}\mathrm{C}\mathrm{h}\mathrm{l}\mathrm{a}-\mathrm{104}\mathrm{C}\mathrm{h}\mathrm{l}\mathrm{b})/\mathrm{229}]\times n/\mathrm{D}\mathrm{C}\mathrm{W}$$

(4)

式中：Chl为叶绿素，Car为类胡萝卜素，18.08A₆₄₉+ 6.63A₆₆₅和(1 000A₄₇₀-3.27Chl a-104Chl b)/229分别为色素提取液中叶绿素和类胡萝卜素浓度(μg/mL)，n为稀释倍数，DCW (dry cell weight density)表示藻细胞干重密度(mg/mL)。

1.5 藻细胞培养液氮磷元素浓度测定

藻细胞培养液中氮和磷元素浓度的测定参照《中华人民共和国国家环境保护标准》(HJ 535—2009和HJ 670—2013)^[23-24]，分别采用纳氏试剂法和钼酸铵分光光度法进行测定。每天吸取1.0 mL藻细胞培养液，4 ℃、12 000 r/min离心5 min后，将上清液分别稀释100倍和200倍用于测定NH₄⁺-N和PO₄^3--P浓度。测定NH₄⁺-N浓度时，向10.0 mL稀释水样中加入0.2 mL酒石酸钾钠溶液和0.2 mL纳氏试剂，静置10 min后在420 nm波长处测定吸光度；测定PO₄^3--P浓度时，向10.0 mL稀释水样中加入0.2 mL硫酸-钼酸铵-酒石酸锑钾混合溶液和0.2 mL抗坏血酸溶液，混匀后静置10 min后于700 nm波长处测定吸光度。根据“浓度-吸光度”标准曲线回归方程和稀释倍数计算藻细胞培养液中氮和磷元素的浓度。

1.6 藻细胞脂肪酸分析

藻细胞脂肪酸分析参考改进后的一步酸催化酯化法^[25]，将准确称重的藻粉(2-5 mg, Mettler toledo公司)置于10 mL圆底烧瓶中，加入5 mL 体积分数为2%的硫酸-甲醇，在70 ℃油浴下进行甲酯化反应45 min。待冷却后，加入2 mL正己烷和0.75 mL去离子水进行萃取并分层。充分混合后，将上层含有脂肪酸甲酯的正己烷转移至2 mL色谱瓶中，进行气相色谱(Bruker公司)分析。以十七烷酸甘油三酯(Sigma-Aldrich公司)为内标，进样量为1 μL，检测器为氢火焰离子化检测器(flame ionization detector, FID)，载气为氮气(纯度99%)，前进样口和前检测器温度均为270 ℃，分流比为30:1，色谱柱为DB23 (柱长30 m，内径0.32 mm，膜厚度0.25 μm，Agilent公司)。升温程序：初始温度130 ℃，以10 ℃/min升温至170 ℃，再以2.5 ℃/min升温至195 ℃，运行时间为14 min。

每种脂肪酸的相对含量计算如公式(5)所示，绝对含量计算如公式(6)所示。

$$P_{\mathrm{i}}=A_{\mathrm{i}}/\sum A_{\mathrm{i}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}$$

(5)

$$M_{\mathrm{i}}=(A_{\mathrm{i}}/A_{\mathrm{s}}\times M_{\mathrm{s}})/M_{\mathrm{a}}$$

(6)

式中：P_i为每种脂肪酸的相对质量；M_i为每克藻细胞中某种脂肪酸的含量(mg/g)，A_i为每种脂肪酸的峰面积；∑A_i为所有脂肪酸峰面积之和；A_s为内标十七烷酸甲酯的峰面积；M_s为内标十七烷酸甘油三酯的质量(mg)；M_a为藻细胞的质量(mg)。

1.7 藻细胞碳水化合物和蛋白质含量测定

藻细胞碳水化合物含量采用改进的蒽酮比色法^[26]进行测定。将准确称取的藻粉(约2 mg)加入2.0 mL去离子水中，使用超声破碎仪(SONICS公司)对藻细胞进行超声破碎，条件为：超声5 s，间歇5 s，超声10次，振幅为20% (750 W)。超声完成后，将样品悬浮液定容至5.0 mL。取1.0 mL适当稀释倍数的样品，加入5.0 mL蒽酮试剂，充分振荡后置于沸水浴中加热10 min。冷却后，以去离子水为空白调零，在621 nm处测定吸光度。根据“葡萄糖浓度-吸光度”标准曲线回归方程、稀释倍数以及藻粉质量计算藻细胞碳水化合物含量，计算如公式(7)所示。

$$\begin{array}{l}\mathrm{碳水}\mathrm{化合}\mathrm{物含}\mathrm{量}(\mathrm{m}\mathrm{g}/\mathrm{g})=\\ \mathrm{葡萄}\mathrm{糖浓}\mathrm{度}(\mathrm{m}\mathrm{g}/\mathrm{m}\mathrm{L})\times \mathrm{稀释}\mathrm{倍数}\times \mathrm{样品}\mathrm{定容}\mathrm{体积}(\mathrm{5.0}\mathrm{m}\mathrm{L})/\mathrm{藻粉}\mathrm{质量}(\mathrm{g})\times \mathrm{100}\mathrm{\%}\end{array}$$

(7)

藻细胞蛋白质含量采用改进的考马斯亮蓝比色法^[27]进行测定。将准确称取的藻粉(约2 mg)加入5 mL离心管中，加入1.8 mL 0.5 mol/L NaOH溶液，采用与碳水化合物相同的超声条件对藻细胞进行冰浴破碎。超声完成后，将样品悬浮液转移至2 mL离心管中，80 ℃水浴10 min。水浴结束后25 ℃、12 000 r/min离心5 min，收集上清液至5 mL刻度试管中，再加入1.0 mL 0.5 mol/L NaOH溶液，重复80 ℃水浴提取10 min，离心后合并上清液并定容至5.0 mL。将藻粉样品提取液用0.15 mol/L NaCl溶液稀释2倍至100 μL，加入1.0 mL考马斯亮蓝G250试剂(Bio-Rad公司)振荡摇匀，静置5 min在595 nm处测定吸光度。根据“蛋白质浓度-吸光度”标准曲线回归方程、稀释倍数以及藻粉质量计算藻细胞蛋白质含量，计算如公式(8)所示。

$$\begin{array}{l}\mathrm{蛋白}\mathrm{质含}\mathrm{量}(\mathrm{m}\mathrm{g}/\mathrm{g})=\mathrm{蛋白}\mathrm{质浓}\mathrm{度}(\mathrm{m}\mathrm{g}/\mathrm{m}\mathrm{L})\times \mathrm{稀释}\mathrm{倍数}\times \mathrm{样品}\mathrm{定容}\mathrm{体积}(\mathrm{5.0}\mathrm{m}\mathrm{L})/\\ \mathrm{藻粉}\mathrm{质量}(\mathrm{g})\times \mathrm{100}\mathrm{\%}\end{array}$$

(8)

1.8 数据处理

实验数据利用Origin 2022软件进行绘图，并使用SPSS 27.0软件进行统计分析。结果以平均值±标准偏差(n=3)表示。不同浓度CHCA处理组之间进行单因素方差分析(analysis of variance, ANOVA)，当差异显著时，采用Tukey多重比较分析，以*P<0.05表示数据间差异显著。

2 结果与分析

2.1 CHCA暴露对莱茵衣藻生长、光合活性及培养液pH值的影响

在高光富氮条件下培养6 d内，暴露于0、50和100 mg/L CHCA的莱茵衣藻OD₇₅₀均增加了4倍，细胞干重均增加了2倍、光合活性(F_v/F_m)保持稳定，培养液pH值上升了11%-13% (图1)。然而，在高光富氮条件下，CHCA暴露对莱茵衣藻的生长指标(包括OD₇₅₀和细胞干重密度)、最大光量子转化效率(F_v/F_m)以及培养液pH值几乎未产生显著影响。

图1  CHCA暴露对莱茵衣藻生长(A、B)、光合活性(C)及其培养液pH值(D)的影响

Figure 1  Effects of CHCA exposure on growth (A, B), photosynthetic activity (C), and pH value of culture medium (D) in Chlamydomonas reinhardtii. HL+N: High light and nitrogen repletion; HL–N: High light and nitrogen depletion; CHCA concentrations include 0, 50 and 100 mg/L. Values are mean±SD (n=3).

在高光限氮条件下培养6 d内，暴露于0、50和100 mg/L CHCA的莱茵衣藻OD₇₅₀分别增加了25%、12%和13%；在第2天和第3天，暴露于100 mg/L CHCA的莱茵衣藻OD₇₅₀显著高于0 mg/L和50 mg/L CHCA；而在第5天和第6天，暴露于50 mg/L和100 mg/L CHCA的莱茵衣藻OD₇₅₀显著低于0 mg/L CHCA (下降了9%-11%) (图1A)。此外，CHCA暴露对莱茵衣藻的细胞干重密度和培养液pH值均未产生显著影响(图1B、1D)。因此，在高光限氮条件下，CHCA暴露对莱茵衣藻的生长未产生明显影响。

在高光限氮条件下培养6 d内，暴露于0、50和100 mg/L CHCA的莱茵衣藻F_v/F_m分别降低了21%、58%和49% (图1C)。从第2天开始，暴露于50 mg/L和100 mg/L CHCA的莱茵衣藻F_v/F_m均显著低于对照组(0 mg/L CHCA)；在第2天和第6天，暴露于50 mg/L CHCA的莱茵衣藻F_v/F_m显著低于100 mg/L CHCA (图1C)。因此，在高光限氮条件下，CHCA暴露对莱茵衣藻的光合活性产生了显著的抑制作用。

2.2 CHCA暴露对莱茵衣藻氮磷元素吸收的影响

在高光富氮条件下培养6 d内，暴露于0、50和100 mg/L CHCA的莱茵衣藻培养液中氮和磷元素浓度均先急剧降低，随后缓慢降低。氮元素浓度降低了96%-97%，磷元素浓度降低了45%-58% (图2)。然而，CHCA暴露并未对莱茵衣藻氮元素的吸收产生显著影响(图2A)。从第1天开始，暴露于50 mg/L和100 mg/L CHCA的莱茵衣藻培养液中磷元素浓度分别比0 mg/L CHCA显著低15%-22%和17%-24% (图2B)。因此，在高光富氮条件下，CHCA暴露显著促进了莱茵衣藻对磷元素的吸收。

图2  CHCA暴露对莱茵衣藻氮元素(A)和磷元素(B)吸收的影响

Figure 2  Effects of CHCA exposure on uptake of nitrogen (A) and phosphorus (B) in Chlamydomonas reinhardtii. Values are mean±SD (n=3).

在高光限氮条件下培养6 d内，暴露于0、50和100 mg/L CHCA的莱茵衣藻培养液中磷元素浓度整体维持相对稳定(图2B)。在第1、2和6天，暴露于50 mg/L和100 mg/L CHCA的莱茵衣藻培养液中磷元素浓度分别比0 mg/L CHCA显著高7%-10%和10%-13%。因此，在高光限氮条件下，CHCA暴露显著抑制了莱茵衣藻对磷元素的吸收。

2.3 CHCA暴露对莱茵衣藻生化组分含量的影响

在高光富氮条件下培养6 d内，暴露于0、50和100 mg/L CHCA的莱茵衣藻脂肪酸总含量显著增加了16%-22% (图3A)，而其蛋白质和碳水化合物含量保持相对稳定(图3B、3C)。色素含量在第6天增加至初始值的2倍(图3D)。然而，在第6天，CHCA暴露对莱茵衣藻脂肪酸、蛋白质、碳水化合物和色素含量均未产生显著影响(图3A-3C)。

图3  CHCA暴露对莱茵衣藻生化组分含量的影响

Figure 3  Effects of CHCA exposure on contents of biochemical components in Chlamydomonas reinhardtii. Values are mean±SD (n=3). Different letters indicate significant differences (P<0.05).

在高光限氮条件下培养6 d内，暴露于0、50和100 mg/L CHCA的莱茵衣藻脂肪酸总含量增加至初始值的2-3倍(图3A)，而其蛋白质和碳水化合物含量保持相对稳定(图3B、3C)。然而，色素含量显著降低至初始值的46%-50% (图3D)。在第6天，CHCA暴露对莱茵衣藻脂肪酸、蛋白质、碳水化合物和色素含量均未产生显著影响(图3A-3C)。

在高光富氮条件下培养6 d内，暴露于0、50和100 mg/L CHCA的莱茵衣藻叶绿素(图4A)和类胡萝卜素(图4B)含量先增加后保持稳定，分别增加了2-3倍和2倍。相反，在高光限氮条件下培养6 d内，暴露于0、50和100 mg/L CHCA的莱茵衣藻叶绿素和类胡萝卜素含量先降低后保持稳定，分别降低了55%-62%和29%-33%。然而，在高光富氮或高光限氮条件下培养6 d时，CHCA暴露均未对莱茵衣藻的叶绿素和类胡萝卜素含量产生显著影响(图4)。

图4  CHCA暴露对莱茵衣藻叶绿素(A)和类胡萝卜素(B)含量的影响

Figure 4  Effects of CHCA exposure on contents of chlorophylls (A) and carotenoids (B) in Chlamydomonas reinhardtii. Values are mean±SD (n=3).

2.4 CHCA暴露对莱茵衣藻脂肪酸组成的影响

在高光富氮条件下培养6 d内，暴露于0、50和100 mg/L CHCA的莱茵衣藻中，主要脂肪酸C16:0的相对丰度显著增加了18%-27%，而C18:3n3的相对丰度显著降低了26%-34%。此外，C16:2n6和C18:2n6的相对丰度分别显著增加了8-10倍和2倍。在第6天，暴露于100 mg/L CHCA的莱茵衣藻中，C16:0的相对丰度较0 mg/L CHCA显著增加了13%，而C18:3n3的相对丰度显著降低了11%。然而，暴露于50 mg/L和100 mg/L CHCA的莱茵衣藻脂肪酸组成之间无显著差异(图5A)。

图5  CHCA暴露对莱茵衣藻脂肪酸组成的影响。A：高光富氮；B：高光限氮。

Figure 5  Effects of CHCA exposure on the fatty acid composition in Chlamydomonas reinhardtii. A: High light and nitrogen repletion (HL+N); B: High light and nitrogen depletion (HL-N). Values are mean±SD (n=3). Different letters indicate significant differences (P<0.05).

在高光限氮条件下培养6 d内，暴露于0、50和100 mg/L CHCA的莱茵衣藻中，主要脂肪酸C16:4n3和C18:3n3的相对丰度分别显著降低63%和38%-41%，而C18:1n9和C18:1n7的相对丰度分别显著增加38%-59%和51%-54%。在第6天，暴露于50 mg/L和100 mg/L CHCA的莱茵衣藻脂肪酸组成与0 mg/L CHCA无显著差异，且不同浓度CHCA之间也无显著差异(图5)。

3 讨论

环烷酸广泛存在于石油工业废水中，对多种水生生物具有毒性作用。有效去除环烷酸是石油工业废水处理的关键挑战之一^[28]。臭氧化和微生物降解已成为当前去除环烷酸并降低其毒性的可行方法。目前已在环烷酸污染的水体中发现多种原生微藻^[8]，有关微藻的生长、光合活性、细胞形态、转录组畸变、抗氧化酶活性和生化组分等对不同类别环烷酸的耐受性能也有许多报道^[12-19]。前期研究发现，在弱光富氮标准培养条件下，CHCA暴露能显著抑制低初始密度莱茵衣藻的生长和光合活性，还能显著改变其脂肪酸组成^[15]。本研究结合采油废水处理过程的户外高光环境及其外排达标前的低氮浓度水体性质，进一步探究了高光限氮条件下高初始密度接种的莱茵衣藻对CHCA的耐受特性，重点关注了氮磷去除效率和基于生理生化组分的有机碳分配特征。结果为进一步评估藻株资源化利用潜力以及筛选构建高度耐受环烷酸的藻株培养策略提供了科学参考。

3.1 环烷酸暴露对微藻生长的影响

微藻能够耐受环烷酸暴露环境条件的最直接和最有利表征是维持较高的生物质产率。前期研究表明，在弱光富氮培养的3 d内，暴露于50 mg/L和100 mg/L CHCA的低初始密度BAFJ5的OD₇₅₀分别降低至对照组的72%和42%^[15]。本研究发现，在高光富氮和高光限氮培养期间，CHCA暴露均未对高初始密度接种莱茵衣藻(缺壁株BAFJ5)的生长，即OD₇₅₀和细胞干重密度产生显著影响(图1)；但在高光限氮培养期间(第2-6天)，暴露于50 mg/L和100 mg/L CHCA的BAFJ5，其OD₇₅₀显然受到了不同程度的影响。由此推测，莱茵衣藻缺壁株BAFJ5对CHCA的耐受性与藻细胞密度正相关，同时高光与氮的添加也能在一定程度上促进其对CHCA的耐受性。

研究表明，莱茵衣藻野生株暴露于10-100 mg/L油砂环烷酸组分(naphthenic acid fraction components, NAFCs)时，其生长速率逐渐受到抑制；而当NAFCs浓度高达100 mg/L时，缺壁株CC400的生长速率才开始受到显著抑制；类似地，缺壁株CC3395的生长速率在NAFCs≤100 mg/L时也未受到明显影响^[13]。可见，莱茵衣藻对环烷酸的耐受性与其藻株特性有关，细胞壁的缺失与否是决定微藻对环烷酸耐受性强弱的一个关键因素。此外，研究发现，0.5-4 mg/L环烷酸对莱茵衣藻野生株和普通小球藻(Chlorella vulgaris)的生长无显著影响，而8-16 mg/L环烷酸则开始产生抑制效应，2种微藻的初始接种密度分别为2×10⁶个/mL和6×10⁶个/mL^[19]。前期研究发现，低密度接种(约2×10⁵个/mL)的蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)在CHCA浓度为50 mg/L和100 mg/L时，其生长也不受影响，而低密度接种(约1×10⁵个/mL)的莱茵衣藻缺壁株BAFJ5的生长却受到显著抑制^[15]。本研究选择的莱茵衣藻BAFJ5也属缺壁株，其响应环烷酸胁迫的生长状态因培养策略的不同而异。BAFJ5的初始接种密度约为7×10⁶个/mL，50 mg/L和100 mg/L CHCA暴露对其生长几乎未产生明显影响。由此，环烷酸暴露对莱茵衣藻野生株的生长抑制作用更为明显，而对于莱茵衣藻缺壁株，较高的初始密度有利于藻细胞生长免受抑制。综上，莱茵衣藻初始接种密度在(1-20)×10⁵个/mL范围内，推测其对环烷酸的耐受性可能会显著降低；其初始接种密度≥7×10⁶个/mL时，环烷酸胁迫对莱茵衣藻的抑制作用则会逐渐减弱，甚至产生促进作用。相比之下，海洋微藻，包括颗石艾米里藻(Emiliania huxleyi)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、青岛大扁藻(Platymonas helgolandica var. tsingtaoensis)和赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)等，对环烷酸胁迫更加敏感，当环烷酸浓度<50 mg/L时，其生长即受到不同程度的抑制^[12,14,16,18]。

3.2 环烷酸暴露对微藻光合活性的影响

叶绿素荧光参数PS II的最大光量子转化效率(F_v/F_m)能有效表征高等植物和藻类应对营养盐和高光强^[20]、重金属^[29]和多环芳烃^[30]等多种环境胁迫的光合活性。目前有关环烷酸暴露对微藻光合活性影响的研究报道还相对有限。已知当OSPW的酸性可提取有机物(the acid extractable organic fraction, AEO)组分以及2种环烷酸替代物[(4′-n-butylphenyl)-4-butanoic acid and (4′-tert-butylphenyl)-4-butanoic acid, n-和tert-BPBA]浓度≤100 mg/L时，普通小球藻的光合活性F_v/F_m均不受影响；而海洋颗石艾米里藻的F_v/F_m在n-和tert-BPBA浓度>10 mg/L和50 mg/L时即受到显著抑制^[12]。当环烷酸浓度在0.5-4 mg/L范围内时，三角褐指藻、青岛大扁藻和赤潮异弯藻的F_v/F_m均呈现出毒物兴奋效应^[16,18,31]；当环烷酸浓度在2-32 mg/L范围内，三角褐指藻的F_v/F_m维持相对稳定^[14]。由于叶绿素是与微藻光合作用最密切相关的一种色素，叶绿素a荧光动力学能表征微藻对环烷酸胁迫的耐受性能。前期研究发现，在弱光富氮培养的3 d内，BAFJ5的F_v/F_m几乎未受到CHCA暴露的显著影响，尽管其生长抑制效应更为明显^[15]。在本研究中，高光富氮培养的6 d内，CHCA暴露对莱茵衣藻BAFJ5的F_v/F_m均未产生显著影响(图1C)；但高光限氮培养的第2-6天内，暴露于50 mg/L和100 mg/L CHCA的BAFJ5 F_v/F_m却受到显著抑制，这些结果与生长和叶绿素合成抑制效应在不同程度上保持一致(图1A-1C，图4A)。因此，与光照强度和藻细胞的初始接种密度相比，氮限制可能是环烷酸暴露导致莱茵衣藻光合活性受损的首要因素。考虑到高等植物叶片的光合作用速率通常与氮浓度高度相关^[32]，推测氮的可利用性有可能限制了微藻在光合作用中获得CO₂和能量的能力，进而可能在不同程度上影响微藻的生长和光合活性。可见微藻对氮的利用与其生长和光合活性之间具有不同的相关性，共同反映了微藻对环烷酸胁迫的耐受性，然而相关机制有待于后续工作的深入探究。

3.3 环烷酸暴露对微藻吸收氮磷元素的影响

微藻的生长与氮磷吸收特性密切相关，其中氮是生命体的必需元素，是蛋白质和遗传物质的必备元素；磷是生物膜和遗传物质的重要组成元素，是微藻生长和增殖不可或缺的元素^[33]。然而，采油废水外排达标之前通常为低氮低磷浓度水体(氮和磷浓度分别在15.0 mg/L和0.1 mg/L以下)，难以满足微藻生长的需要，因此，在实际处理采油废水过程中，可适当添加氮源和磷源^[34]，以期利用微藻实现减污降碳协同脱氮除磷等资源化利用效果。由此可见，研究环烷酸暴露条件下微藻氮磷吸收的变化也能反映其生长性能的变化，进而反映其对环烷酸耐受性的变化，但目前关于环烷酸暴露影响微藻氮磷元素吸收的报道还非常有限。已有研究表明，CHCA、环己烷乙酸(cyclohexanacetic acid, CHAA)和环己烷丁酸(cyclohexane butyric acid, CHBA) 3种典型环烷酸在≤300 mg/L浓度范围内，均不影响凯氏小球藻(C. kessleri)和布朗葡萄球藻(Botryococcus braunii)对磷元素的正常吸收，而300 mg/L CHCA、CHAA和CHBA却均能显著降低2种微藻对氮元素的吸收；低浓度100 mg/L CHCA则能显著促进凯氏小球藻对氮元素的吸收，而CHAA和CHBA对2种微藻氮元素吸收均无显著影响^[6]。在本研究中，50 mg/L和100 mg/L CHCA不影响高光富氮培养的莱茵衣藻对氮元素的吸收，但能促进其对磷元素的吸收；相反，在高光限氮条件下，50 mg/L和100 mg/L CHCA均显著降低了莱茵衣藻对磷元素的吸收。综上所述，相比凯氏小球藻和布朗葡萄球藻的氮元素吸收受环烷酸影响更大而言，环烷酸更能促进莱茵衣藻对磷元素的吸收作用。因此，环烷酸暴露对微藻氮磷元素吸收的影响可能具有种属特异性，同时还可能与培养液的氮磷本底值有关。

3.4 环烷酸暴露对微藻生化组分及脂肪酸组成的影响

微藻富含蛋白质、油脂、碳水化合物、色素等多样化的高值营养成分，是食品、化工、农业、转化医学及环境健康与生态工程应用领域的重要绿色原料或工具生物^[35]。目前有关微藻降解环烷酸耦合资源化利用的潜力还鲜有报道。已有研究发现，在0.5-16 mg/L范围内，莱茵衣藻野生株的叶绿素a含量随环烷酸浓度升高而逐渐降低，而普通小球藻的叶绿素a含量呈低浓度促进、高浓度抑制的变化规律；2种微藻的粗脂肪含量变化趋势与普通小球藻叶绿素a含量相似，其蛋白质含量在环烷酸处理24 h后均显著高于对照组，96 h后均显著低于对照组，其多糖含量较对照组几乎均显著增加^[19]。在本研究中，50 mg/L和100 mg/L CHCA暴露6 d内，莱茵衣藻缺壁株BAFJ5的脂肪酸、蛋白质、碳水化合物和色素含量均未受到显著影响(图3)，脂肪酸总含量的结果与前期工作(低初始密度)的BAFJ5结果一致^[15]。由此推测，在环烷酸暴露胁迫条件下，莱茵衣藻缺壁株BAFJ5的生化组分较野生株更易维持稳定，这与生长影响的结果相一致。

此外，有机体脂肪酸对环境变化非常敏感^[36]，是生物响应环境胁迫的指示因子^[37]，脂肪酸生物标志物已广泛用于指示环境变化。在微藻中，多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFA)通常是结构脂质的主要组分，而饱和脂肪酸(saturated fatty acid, SFA)和单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acid, MUFA)主要构成贮能脂质部分^[20]。在光照和营养盐等非生物逆境胁迫条件下，微藻的脂肪酸组成会发生改变，通常表现为PUFA相对丰度减少，而SFA和MUFA相对丰度增加^[38]。因此，微藻脂肪酸组成是其关键能量储备和膜结构适应环境变化的良好生物指标^[39]。前期研究发现，50 mg/L和100 mg/L CHCA暴露6 d后，蛋白核小球藻的主要脂肪酸C16:0和C18:3n3相对丰度与对照组相比分别显著降低和增加，而莱茵衣藻的C18:3n3相对丰度在100 mg/L环烷酸浓度下却显著降低，其C16:0相对丰度则呈增加趋势，同时其C18:1n9相对丰度显著增加^[15]。在本研究中，高光富氮培养6 d后，暴露于100 mg/L CHCA 的莱茵衣藻主要脂肪酸C16:0和C18:3n3相对丰度不同于蛋白核小球藻，分别显著增加18%-27%和降低26%-34%，与低初始密度的莱茵衣藻结果相一致；此外，高光限氮培养6 d后，50 mg/L和100 mg/L CHCA 暴露均未影响莱茵衣藻的脂肪酸组成。因此，氮元素是否受限可能是环烷酸暴露影响莱茵衣藻脂肪酸组成的重要因素，进而能够调控莱茵衣藻对环烷酸的耐受性能。C16:0和C18:3n3可以作为莱茵衣藻响应环烷酸胁迫的潜在生物标志物。

综上所述，由图1A和1B可知，50 mg/L和100 mg/L CHCA暴露对莱茵衣藻的生长几乎未产生显著影响，即在该培养体系下，莱茵衣藻的生长与CHCA浓度无显著相关性。此外，从图1D、图3和图4可以看出，CHCA暴露对莱茵衣藻的培养液pH值以及脂质、碳水化合物、蛋白质和叶绿素含量也几乎未产生明显影响。然而，在高光富氮条件下，CHCA暴露显著促进了莱茵衣藻对磷元素的吸收(图2B)，同时分别显著增加了C16:0和显著降低了C18:3n3的相对丰度，对其脂肪酸组成产生了显著影响(图5A)；而在高光限氮条件下，CHCA暴露显著抑制了莱茵衣藻的光合活性(图1C)以及对磷元素的吸收(图2B)，但并未对其脂肪酸组成产生显著影响(图5B)。微藻对环境胁迫的耐受性可通过生长曲线直观表征，并通过藻细胞的生长、光合活性、氮磷吸收及关键生化组分等指标综合考量。因此，高光富氮和高光限氮条件分别通过促进磷元素吸收并改变脂肪酸组成，以及抑制光合活性和磷元素吸收，进一步提高和降低了莱茵衣藻对环烷酸的耐受性。

由此推测，莱茵衣藻对环烷酸胁迫的耐受性可能与氮元素浓度及藻细胞初始接种密度有关。微藻的光合作用速率受限于氮浓度，氮的可利用性会影响微藻在光合作用中获取CO₂和能量的能力，进而导致其生长、光合活性甚至营养盐吸收能力受到不同程度的影响，从而调控其对环烷酸胁迫的耐受性。在低接种密度下，莱茵衣藻主要通过改变生长和脂肪酸组成来响应环烷酸胁迫^[15]；在高接种密度下，主要通过改变光合活性、磷元素吸收及脂肪酸组成来适应环烷酸胁迫。可见，在暴露于环烷酸期间，微藻能通过改变其脂肪酸组成实现脂质重塑，调控其对环烷酸的耐受性能，这可能是微藻响应环烷酸胁迫的潜在重要机制之一。

4 结论

在高光富氮培养条件下，CHCA暴露能显著促进莱茵衣藻对磷元素的吸收，同时分别显著增加饱和脂肪酸C16:0和显著降低多不饱和脂肪酸C18:3n3的相对丰度，进而提高了其对环烷酸的耐受性；而在高光限氮培养条件下，CHCA暴露未对其脂肪酸组成产生明显影响，但能显著抑制莱茵衣藻的光合活性以及对磷元素的吸收，导致其对环烷酸的耐受性有所降低。氮元素可能是莱茵衣藻耐受环烷酸的重要调控因素。这些结果可为筛选与构建高度耐受环烷酸的藻株培养策略提供借鉴。

作者贡献声明

杨淼：研究构思和设计、实验操作、数据处理与分析、论文撰写与修改；雷恒萍：实验操作、数据处理与分析；杨子艺：实验操作；吴朦：实验操作；魏诗骐：协助实验操作；谢玺：研究构思和设计、数据分析、论文修改；宫正：研究构思和设计、论文修改。

利益冲突

作者声明不存在任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。