微塑料对假单胞菌

摘要

微塑料是一种新型污染物，在海洋、土壤和大气环境中广泛存在，可通过物理、化学或生物作用影响污染物的迁移转化过程。矿业开采活动导致锑矿区周边水土环境的污染程度逐年升高，然而，目前针对矿区环境中微塑料对锑迁移转化影响的研究却鲜有报道。

目的

了解微塑料的种类、粒径以及浓度对微生物介导辉锑矿释放的影响。

方法

以具有高浓度锑耐性且能够促进辉锑矿释放的假单胞菌(Pseudomonas sp.) J-1，以及使用较广泛的聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯3种微塑料为研究对象，通过对菌种生长过程中pH、氧化还原电位和菌落生物量变化进行分析，并定期监测锑释放量，结合不同pH下微塑料对锑的吸附实验以及激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy, CLSM)和扫描电子显微镜-能量色散X射线光谱仪(scanning electron microscope-energy dispersive X-ray spectroscopy, SEM-EDS)等表征手段，进一步揭示微塑料对锑的生物地球化学循环的影响机理。

结果

粒径为13 μm、高浓度的聚丙烯对Pseudomonas sp. J-1参与下辉锑矿释放的抑制作用最强。微塑料通过抑制菌群生长从而导致对辉锑矿释放的促进效果减弱，高浓度的微塑料甚至可使Pseudomonas sp. J-1的生长被完全抑制。微塑料能够吸附锑，但其吸附能力与溶液pH无关。

结论

微塑料的种类、粒径与浓度是影响Pseudomonas sp. J-1介导辉锑矿释放的关键因素，主要是通过影响微生物生长从而间接影响辉锑矿的释放。

关键词

微塑料; 假单胞菌(Pseudomonas sp.) J-1; 辉锑矿; 锑吸附

由于大量矿山开采活动的不断开展，土壤、沉积物和水生环境中的锑污染情况愈加严重，对生态系统造成巨大危害^[1-2]。辉锑矿是一种典型的硫化矿，其风化过程被认为是水体中Sb元素的主要来源^[3]。近年来，多个研究针对锑矿区修复展开，以此来缓解大量含锑化合物对生态和健康造成的风险^[4-5]。尽管锑元素及其化合物对人体有剧毒，但一些微生物仍可以在锑浓度极高的环境中生存，甚至能够利用含锑矿物为细胞生长提供能量^[6-8]。研究表明，微生物对锑的生物地球化学循环影响深远，可促进含锑矿物和岩石中Sb(III)的溶解和氧化^[9]。

微塑料作为一种新型污染物，广泛存在于多种生态系统中，其对人类健康和生态的影响一直受到研究人员的关注^[10]。一般来说，直径小于5 mm的塑料聚合物颗粒即被定义为微塑料(microplastics, MPs)^[11]。研究人员最初在海洋环境中发现了大量微塑料^[12]，之后又相继在淡水^[13]、沉积物^[14]、大气^[15]、土壤^[16]和地下水^[17]中检测到了不同程度的微塑料污染。由于微塑料在环境中的难降解性，以及在环境中的微塑料能够留存数百年甚至更长时间，从而导致环境污染治理的难度上升^[18-20]。

研究表明，矿区土壤中的微塑料形态主要有纤维状、碎片状、颗粒状、薄膜状和泡沫状，而微塑料的分布丰度具有较大差异^[21-22]。据报道，安徽省朱庄矿区表层土壤中的微塑料丰度为2 468.2-4 458.6个/m²，而潘一矿区表层土壤中的微塑料丰度为318.4-875.8个/m²，这可能是由矿区周边人类活动规模的差异所导致^[23]。矿区周边农田土壤中的微塑料以聚丙烯和聚乙烯为主，且粒径小于0.01 mm的微塑料占比高达45%，主要形状为纤维状^[24]。

研究表明，微生物与微塑料之间存在相互作用，微生物、微塑料与含锑矿物之间的作用机制较为复杂，相关研究的开展对锑污染治理和微塑料环境风险评估具有重要意义。微塑料的存在会加快土壤中微生物群落的演替速度^[25]，并改变微生物群落的组成^[26]，在细菌分类的门水平上，如放线菌门(Actinobacteria)、假单胞菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)等主导菌群的相对丰度发生了明显变化^[27]。国际原核生物命名法规(International Code of Nomenclature of Prokaryotes, ICNP)分别将上述3个门的拉丁名称修正为Actinomycetota、Pseudomonadota和Bacillota^[28]。另外，高浓度的微塑料会产生遮光效应，从而抑制藻类的光合作用并抑制其生长繁殖^[29-30]。微塑料老化后的比表面积和吸附位点增加，并在微生物作用下形成更多的生物膜^[31]，成为Sb、Cd、Cu、As等有毒金属的载体，从而影响微生物对重金属离子的溶解、吸附和氧化还原^[32-34]。

为探究微塑料对细菌介导的辉锑矿释放过程的影响，本研究选取假单胞菌(Pseudomonas sp.) J-1为研究对象。Pseudomonas sp. J-1分离自湖南省冷水江锡矿山，其能够耐受高达200 µmol/L的三价锑并促进辉锑矿的释放与氧化^[35]。微塑料选用目前被广泛使用和报道的聚丙烯(polypropylene, PP)、聚氯乙烯(polyvinyl chloride, PVC)和聚苯乙烯(polystyrene, PS)。通过监测溶液的pH、氧化还原电位、微生物量以及总体含量，结合激光共聚焦显微镜与电子显微镜等表征手段，分析不同种类、不同粒径以及不同浓度的微塑料对辉锑矿释放的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用的辉锑矿样品采集自湖南省锡矿山矿区，矿石经人工敲打成小块后使用玛瑙研钵进行研磨，过筛筛选出粒径小于400目的矿物颗粒作为实验用矿物。本研究中使用的不同粒径的PP、PS和PVC颗粒均购自广州市中新塑料有限公司。

1.2 微生物的培养与富集

本研究所使用的假单胞菌(Pseudomonas sp.)J-1分离纯化自湖南省冷水江锡矿山。Pseudomonas sp. J-1培养所需培养基为chemically defined media (CDM)培养基(g/L)：硫酸镁20.0，氯化铵10.0，硫酸钠9.9，磷酸氢二钾0.1，二水氯化钙0.7，乳酸钠50.0，七水硫酸亚铁1.3，碳酸氢钠79.8。将纯培养后的Pseudomonas sp. J-1接种到100 mL CDM培养基中，加入1.0 g研磨后的辉锑矿，在摇床中以30 ℃、150 r/min的条件培养。Pseudomonas sp. J-1稳定传代3次后，以10 000 r/min离心5 min后使用CDM培养基重悬、保存在4 ℃冰箱中，以备后续实验使用。

1.3 微塑料的种类、粒径以及浓度对辉锑矿释放的影响

取0.2 g、粒径均为13 µm的PP、PVC和PS 3种微塑料，分别加入装有100 mL CDM培养基的250 mL锥形瓶中，再向各瓶中加入0.1 g的辉锑矿和2 mL的Pseudomonas sp. J-1，以研究不同微塑料种类对Pseudomonas sp. J-1介导的辉锑矿释放的影响。取0.2 g、粒径分别为13、150、600 µm的PP，分别加入装有100 mL CDM培养基的250 mL锥形瓶中，再向各瓶中加入0.1 g的辉锑矿和2 mL的Pseudomonas sp. J-1，以研究不同微塑料粒径对Pseudomonas sp. J-1介导的辉锑矿释放的影响。取0.2 g和5.0 g、粒径均为13 µm的PP分别加入装有100 mL CDM培养基的250 mL锥形瓶中，再向各瓶中加入0.1 g的辉锑矿和2 mL的Pseudomonas sp. J-1，以研究不同微塑料浓度对Pseudomonas sp. J-1介导的辉锑矿释放的影响。

将上述锥形瓶置于30 ℃、150 r/min的恒温摇床中避光反应，每2-3 d取样1次。监测上述溶液样品的pH、氧化还原电位(oxidation reduction potential, ORP)、细胞数以及总锑浓度变化。另外设置一组不加任何微塑料的空白对照组，上述实验均设置3个平行。

1.4 不同pH对微塑料吸附锑的影响

使用酒石酸锑钾试剂配制Sb(III)浓度为10 mg/L的溶液，将上述溶液均分为3份，然后使用浓度为1 mol/L的NaOH溶液将其pH分别调节为7.2、8.6和9.4。取不同pH梯度的溶液100 mL分别加入250 mL锥形瓶中，并加入0.2 g、粒径为13 µm的PP，另设一组不加微塑料的空白对照组，每组各设3个平行。将各锥形瓶置于30 ℃、150 r/min的恒温摇床中避光反应。

1.5 假单胞菌属基因组中与微塑料耐受有关的基因分析

查阅相关文献后发现，alk基因和细胞色素P450酶编码基因与细菌对微塑料的耐受和降解高度相关^[36-38]。通过NCBI网站(https://www.ncbi. nlm.nih.gov/)搜集了5株基因组完整的假单胞菌属细菌，分别为假单胞菌属(Pseudomonas sp.) AO-1 (CP079947)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) PA96 (CP007224)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) PaSz (AP031604)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) RD1-3 (CP047697)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) UCBPP-PA14 (CP000438)。下载上述5株细菌基因组后，查找其中的alk基因和细胞色素P450酶编码基因，根据其大小、位置与方向绘制基因结构图。

1.6 溶液参数的测定

使用哈希水质分析仪(Loveland公司)测试溶液的pH，使用便携式ORP计(贝尔分析仪器有限公司)测试溶液的氧化还原电位。通过光学显微镜(MOTIC公司)，使用血细胞计数法监测样品中的微生物数量。将样品稀释100倍后，使用硫脲和抗坏血酸将样品中的Sb(V)还原为Sb(III)，随后利用原子荧光光谱法(atomic fluorescence spectrometry, AFS) (北京海光仪器有限公司)测定样品中的总锑浓度^[38]。

1.7 激光共聚焦显微镜制样

实验结束后，将处于混合状态的样品以10 000 r/min离心5 min，收集体系中的固体样品。分别使用50 mg/L的小麦胚芽凝集素(wheat germ agglutinin, WGA)溶液和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)溶液标记胞外多糖和DNA。使用激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope, CLSM) (尼康精机有限公司)在405 nm激发光下观察DAPI染色结果，在633 nm激发光下观察WGA染色结果。

1.8 扫描电子显微镜制样

将实验结束后的样品使用聚-l-赖氨酸和固定液(由1.5%多聚甲醛和2.5%戊二醛混合配制)固定于载物片上，自然风干后依次浸泡于浓度分别为25%、50%、75%、95%、100%的乙醇中脱水。使用临界点干燥仪(Quorum公司)对完成脱水处理的样品进行干燥。随后，利用场发射扫描电子显微镜(scanning electron microscope-energy dispersive X-ray spectroscopy, SEM-EDS) (TESCAN公司)，在加速电压为15 kV的条件下对微生物的形貌特征进行观察和分析。

2 结果与讨论

2.1 不同种类的微塑料对Pseudomonassp. J-1介导的辉锑矿释放的影响

结果表明，3种微塑料的加入对辉锑矿释放的影响各不相同。其中，PP的加入明显降低了溶液中总锑含量，而PVC组和PS的加入对辉锑矿溶解的影响不大(图1A)。不同实验体系中的pH值均呈现先上升后稳定的趋势。空白对照组、PVC组和PS组的pH最终稳定在9.25-9.30之间，而PP组的pH低于上述3组，最终稳定在8.71-8.78之间(图1B)。各组溶液的氧化还原电位呈下降趋势，PP组最高(54.18 mV)，而其他3组的氧化还原电位相差不大，处于15.46-26.55 mV之间(图1C)。各实验体系中的微生物量均呈上升趋势，但PP组的微生物量明显低于其他3组(图1D)。Loni等^[39]研究表明辉锑矿的溶解释放与溶液pH明显相关，随着溶液pH升高，辉锑矿的释放被促进。上述结果说明，Pseudomonas sp. J-1的生长以及对辉锑矿释放的促进过程会导致体系pH升高，而PP的加入会明显抑制Pseudomonas sp. J-1的生长，溶液中的pH升高程度也被一并抑制，从而导致辉锑矿的溶解被抑制^[35]。

图1  不同种类微塑料加入后，反应体系中的各指标参数变化情况。A：总锑浓度；B：pH；C：ORP；D：微生物量。

Figure 1  The changes in various indicator parameters in the reaction system after the addition of different types of microplastics. A: Total antimony concentration; B: pH; C: ORP; D: Microbial biomass.

PP表面具有较高的疏水性，这一特征能够抑制细菌在其表面的附着与生物膜的形成^[40]。由于PVC含有氯离子，PS具有苯环结构，导致PVC和PS的表面能较高，使得细菌更容易通过静电作用附着在其表面^[41-42]。因此，PP对微生物的附着与生物膜形成的抑制导致Pseudomonas sp. J-1的生长被明显抑制。

2.2 不同粒径的微塑料对Pseudomonassp. J-1介导的辉锑矿释放的影响

由2.1节结果可知，微塑料PP对Pseudomonas sp. J-1介导的辉锑矿释放的影响最为明显，因此选择粒径分别为13、150、600 µm的PP进一步研究微塑料的粒径对辉锑矿释放的影响。

结果表明，在Pseudomonas sp. J-1的参与下，不同粒径的微塑料对辉锑矿的释放有不同程度的影响(图2)。13 µm的PP对辉锑矿释放的抑制效果最为明显，溶液中的总锑浓度仅为9.91 mg/L；600 µm的PP对辉锑矿释放的抑制效果次之，溶液中的总锑浓度为10.88 mg/L；150 µm PP的加入对辉锑矿释放的影响不大(图2A)。相应的，溶液的pH、氧化还原电位与微生物量也呈现出对应的趋势。13 µm组的pH最低、微生物量也最少；600 µm组次之，而150 µm组的pH和微生物量较高(图2B、2D)。Sjollema等^[29]研究表明，0.05、0.5、6 µm微塑料的加入对杜氏盐藻(Dunaliella tertiolecta)细胞数产生的影响各不相同，粒径最小的0.05 µm的微塑料能够明显抑制细胞数增长。以上结果说明，粒径为13 µm的微塑料对Pseudomonas sp. J-1的生长抑制效果最强，从而导致其对辉锑矿释放的影响比150 µm和600 µm的更为明显。

图2  不同粒径的微塑料加入后，反应体系中的各指标参数变化情况。A：总锑浓度；B：pH；C：ORP；D：微生物量。

Figure 2  The changes in various indicator parameters in the reaction system after the addition of different sizes of microplastics. A: Total antimony concentration; B: pH; C: ORP; D: Microbial biomass.

2.3 不同浓度的微塑料对Pseudomonassp. J-1介导的辉锑矿释放的影响

加入0.2 g和5.0 g微塑料均能显著抑制辉锑矿的释放，且不同浓度微塑料组的总锑浓度差异不大，分别为9.9-10.0 mg/L，而空白对照组为13.0 mg/L (图3A)。然而，5.0 g微塑料的加入对溶液的pH、氧化还原电位与微生物量的影响大于0.2 g微塑料组(图3B-3D)。具体表现为，加入5.0 g微塑料后，溶液的pH和氧化还原电位基本无变化，微生物量也无明显增长。由于微塑料污染具有聚集性，且随水流变化、传播范围广，导致水体中的微塑料浓度差别较大，不同环境，例如土壤、地表水、尾矿库等的微塑料浓度也不尽相同^[43]。在一定环境中，微塑料的浓度仍有可能达到实验中使用的高浓度，因此，实验结果说明高浓度的微塑料会显著抑制水体中微生物的生长，从而阻断水体生态循环，对环境造成进一步危害。

图3  不同浓度的微塑料加入后反应体系中的各指标参数变化情况。A：总锑浓度；B：pH；C：ORP；D：微生物量。

Figure 3  The changes in various indicator parameters in the reaction system after the addition of different concentrations of microplastics. A: Total antimony concentration; B: pH; C: ORP; D: Microbial biomass.

2.4 不同pH条件下，微塑料对锑的吸附效果

上述实验结束后，体系的pH分别稳定于7.2、8.6和9.4左右。为了探究不同pH条件对微塑料吸附Sb能力的影响，设计了对应pH条件下的微塑料Sb吸附实验。实验结果显示，微塑料在实验体系中对锑有一定的吸附作用，但总体效果较弱，且不同pH组之间的吸附能力无明显差别(图4)。Zhou等^[44]研究表明，实验体系pH值由2.0升高到9.0的过程中，微塑料对Cd(II)的吸附能力呈现先上升后下降的趋势。然而，本研究的实验结果表明，pH的改变并未引起PP对Sb吸附能力的改变，这可能是由于实验条件均处于中性或弱碱性环境，pH值差距较小，导致微塑料对Sb的吸附差异不明显。

图4  不同pH值条件下微塑料对锑的吸附情况

Figure 4  The adsorption of Sb by microplastics under different pH conditions.

2.5 Pseudomonassp. J-1的激光共聚焦观察

图5为培养72 h后的Pseudomonas sp. J-1的激光共聚焦图像。从图5中可以清楚地看到，绿色部分是用WGA染液标记的胞外多糖(图5A)，红色部分为用DAPI染液标记的DNA (图5B)。胞外多糖与DNA的分布重合，且两者荧光强度较强，说明Pseudomonas sp. J-1在生长过程中会产生大量胞外多糖(图5C、5D)。胞外多糖是胞外聚合物(extracellular polymeric substance, EPS)的主要组成成分之一，自然环境中的微生物大都能够生成EPS^[45]。对于矿物而言，EPS中的有机成分可提供质子或与矿物表面形成络合物，从而促进矿物的溶解；同时，EPS中含有大量的活性官能团，如羧基、羟基等，可提供丰富的离子吸附和矿物成核中心，从而固定和富集环境中的金属离子，促进次生产物的形成^[46]。Jia等^[47]的研究表明，微生物产生的EPS可作用于辉锑矿，从而促进实验系统中辉锑矿的溶解与释放。

图5  Pseudomonas sp. J-1培养72 h后的激光共聚焦图像。A：胞外多糖荧光图像；B：DNA荧光图像；C：光学图像；D：胞外多糖和DNA荧光叠加图像。

Figure 5  CLSM images of the resuspended 72 h incubated Pseudomonas sp. J-1. A: Extracellular polysaccharide; B: DNA; C: Optical image; D: Extracellular polysaccharide and DNA overlay images.

2.6 微塑料、Pseudomonassp. J-1和辉锑矿共存系统的SEM-EDS表征

通过扫描电子显微镜图像(图6A、6C)可以观察到微塑料、Pseudomonas sp. J-1的微观形态：Pseudomonas sp. J-1为杆状，长约5 μm，而微塑料形态为条状，长度不一。视野中绝大部分为微塑料与附着于其上的Pseudomonas sp. J-1，微塑料由于实验过程长期浸泡，表面变得粗糙，从而有利于微生物的附着。微塑料表面元素主要为C元素，还发现了少量的O和S元素(图6B)。

图6  实验结束后的样品SEM观察。A、C：SEM观察下的微塑料与Pseudomonas sp. J-1形态；B、D相应位点的EDS结果。

Figure 6  SEM observation of the sample after the experiment. A, C: Morphology of microplastics and Pseudomonas sp. J-1 observed under SEM; B, D: EDS results of corresponding sites.

将小粒径的杆状微塑料进一步放大观察发现，微塑料表面附着了大量形状不规则的EPS。相较于其他部分，微塑料表面的C元素含量降低，O和S元素占比升高，还发现了3.63%的Sb元素，从表征层面说明了微塑料对锑元素的吸附作用(图6B、6D)。

结合实验与表征结果可发现，由于微塑料表面较粗糙以及较高的表面黏性，导致微生物更倾向于附着于微塑料表面，从而减少微生物与矿物的接触机会^[48]。另一方面，由于微塑料在高浓度时透光性较差，微生物在微塑料表面的聚集会进一步影响微生物接收光的强度，从而对其生长造成影响^[49]。

2.7 Pseudomonas基因组中与微塑料耐受相关的基因分析

烷烃羟化酶AlkB家族是β-氧化途径中参与微生物降解最重要的酶。已有多个研究表明，alkB基因及其产物可以通过末端或亚末端氧化途径降解烃类低聚物，从而提高微生物对微塑料的耐受性^[36-37]。细胞色素P450酶是一类亚铁血红素-硫醇盐蛋白的超家族，可识别多种底物并催化多种反应，例如C–H键羟基化、C=C双键氧化和C–C键裂解等，是一种潜在的微塑料降解羟化酶^[38]。

在假单胞菌属5株代表性菌株的基因组中均发现了与微塑料耐受与降解相关的alkB基因和编码细胞色素P450酶的基因，但数量与大小略有差异。alkB相关基因的长度较短，大多处于1 133-1 154 bp之间，而细胞色素P450酶转录基因的长度较长，处于1 256-1 334 bp之间(图7)。上述结果表明假单胞菌属具有较大的微塑料降解潜力。然而，由于鉴定微塑料降解关键酶的难度较大，相关功能基因的报道较少，这在一定程度上限制了人们对微生物降解微塑料的深入理解^[50]。

图7  假单胞菌属基因组中与微塑料降解有关基因的分布情况

Figure 7  Distribution of genes related to microplastic degradation in the genome of Pseudomonas genus.

3 结论

微塑料对假单胞菌(Pseudomonas sp.) J-1参与下辉锑矿释放存在抑制作用，且相较于聚苯乙烯(PS)和聚氯乙烯(PVC)，聚丙烯(PP)对辉锑矿溶解的抑制效果最强。低浓度微塑料前期会抑制菌群生长，随着微塑料浓度的提高，微塑料甚至使Pseudomonas sp. J-1的生长被完全抑制。聚丙烯在粒径为13 μm时对Pseudomonas sp. J-1介导的辉锑矿溶解的抑制影响最明显。微塑料能够吸附锑，但其吸附能力与溶液pH无关。本研究揭示了矿区微塑料通过抑制微生物活性间接调控锑释放的过程，明确了微塑料种类、粒径和浓度对锑元素释放及迁移的影响，为评估矿区复合污染生态风险及治理锑-微塑料协同污染提供了理论依据。

作者贡献声明

仇静旋：数据分析、图表绘制、文章撰写；曾为一：实验设计、数据收集、数据分析；王兴杰：项目管理、审阅与修改、获取基金；陈礼然：执行调研、提供资源、审阅与修改；马丽媛：提出概念、数据分析与监管、审阅与修改。

利益冲突

作者声明不存在任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。