摘要
目的
建立一种双重快速检测方法,旨在快速筛查配方乳粉中克罗诺杆菌、大肠埃希氏菌O157:H7、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和单核增生李斯特氏菌等6种常见食源性致病菌。
方法
酶促等温扩增(enzymatic recombinase amplification, ERA)技术是一种新型等温扩增技术,能在25-42 ℃的条件下,仅需10-30 min完成对微量DNA或RNA的指数级扩增。基于该技术,本研究设计了针对克罗诺杆菌的ERA检测引物探针,同时筛选适用于ERA检测体系的大肠埃希氏菌O157:H7、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和单核增生李斯特氏菌的引物探针,确定了每种单一菌种的ERA检测引物探针。通过引物探针的两两组合分析及方法优化,建立双重ERA检测方法。通过人工模拟污染试验和实际样品检测,确定双重ERA检测方法的检出限和准确性。
结果
建立了3组双重ERA法,能够快速检测6种食源性致病菌,检测时间仅需16 min 10 s。灵敏度检测结果显示,克罗诺杆菌和大肠埃希氏菌O157:H7、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌2种组合的DNA检测灵敏度均为1 ng/μL,而沙门氏菌和单核增生李斯特氏菌的DNA检测灵敏度为1
结论
本研究建立的双重ERA方法具有较高的特异性和灵敏度,从DNA提取到最终获得检测结果该方法仅需约20 min,并能同时检测6种致病菌,显著提高了检测效率,对食源性致病菌的快速筛查具有重要意义。
配方乳粉,作为一种专为婴幼儿设计的食品,其营养成分与母乳相似,旨在满足婴幼儿生长发育所需的各类营养物
配方乳粉中的高风险致病菌主要包括大肠埃希氏菌、沙门氏菌、克罗诺杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和单核增生李斯特氏菌
传统的食源性致病菌检测通常结合微生物培养法和生化分析2种方法,我国现行国标GB/T 4789系列标准也主要采用这2种方法进行测定。尽管传统的微生物检测方法在准确性方面表现良好,但检验流程繁琐、耗费时间较长、灵敏度相对较低等问题,极大限制了检测的时效
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
实验用菌分别来源于美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, DSM)、英国典型菌种保藏中心(National Collection of Type Cultures, NCTC)、比利时细菌菌种保藏中心(Bacteria Collection, LMG)、中国医学细菌菌种保藏管理中心(National Center for Medical Culture Collections, CMCC)和中国检验检疫微生物菌种保藏管理中心(Inspection and Quarantine Culture Collections, IQCC),以上所有菌均保藏于IQCC。信息详见
Strains number | Genus name | Bacterial strains | Source |
---|---|---|---|
1 | Cronobacter | Cronobacter sakazakii | ATCC 29544 |
2 | Cronobacter muytjensii | ATCC 51329 | |
3 | Cronobacter malonaticus | DSM 18702 | |
4 | Cronobacter dublinensis | DSM 18705 | |
5 | Cronobacter universalis | NCTC 9529 | |
6 | Cronobacter turicensis | DSM 18703 | |
7 | Cronobacter condimenti | LMG 26250 | |
8 | Cronobacter dublinensis subsp. lactaridi | DSM 18707 | |
9 | Cronobacter dublinensis subsp. lausannensis | LMG 23824 | |
10 | Escherichia coli | Escherichia coli O157:H7 | ATCC 43895 |
11 | Escherichia coli O157:H7 | NCTC 12900 | |
12 | Escherichia coli O157:H7 | ATCC 43889 | |
13 | Escherichia coli H11:O130 | IQCC 50170 | |
14 | Escherichia coli H7:O28ac | IQCC 30146 | |
15 | Escherichia coli H11:O78 | IQCC 30120 | |
16 | Escherichia coli | IQCC 10198 | |
17 | Escherichia coli | CMCC 44104 | |
18 | Escherichia coli | ATCC 11775 | |
19 | Escherichia hermannii | IQCC 10117 | |
20 | Bacillus cereus | Bacillus cereus | ATCC 10876 |
21 | Bacillus cereus | CMCC 63303 | |
22 | Bacillus cereus | ATCC 11778 | |
23 | Bacillus cereus | ATCC 33019 | |
24 | Others | Listeria monocytogenes | ATCC 13932 |
25 | Salmonella enterica | ATCC 43971 | |
26 | Staphylococcus aureus | ATCC 12600 | |
27 | Yersinia enterorcolitica | ATCC 27729 | |
28 | Vibrio parahaemolyticus | ATCC 33847 | |
29 | Streptococcus hemolytic-β | CMCC 32210 | |
30 | Vibrio parahaemolyticus | IQCC 12312 | |
31 | Listeria ivanovii | ATCC 19119 | |
32 | Pseudomonas aeruginosa | ATCC 25619 | |
33 | Shigella flexneri | CMCC 51571 | |
34 | Pseudomonas Fluorescens | ATCC 17397 |
1.1.2 主要试剂和仪器
脑心浸液肉汤培养基(brain heart infusion, BHI)、脑心浸液琼脂培养基(brain heart infusion Agar, BHIA)、LB肉汤培养基,Oxoid公司;PrepMa
便携式实时荧光PCR仪,艾济遗传(北京)科技有限公司;离心机,ThermoFisher Scientific公司;掌上离心机,Scilogex公司;紫外可见光分光光度仪,岛津公司;涡旋混合器,IKA公司;高压灭菌锅,Tuttnauer公司;电热恒温培养箱,Memmert公司。
1.2 菌株的分离培养和DNA提取
蘸取菌液在BHIA培养基表面划线,于37 ℃培养18 h后,挑取单菌落加入到5 mL的BHI培养基中,继续培养12 h。取1 mL菌液置于1.5 mL离心管中16 000×g离心2 min,弃去上清后加入100 μL PrepMa
1.3 引物探针的筛选
从GenBank数据库中提取阪崎克洛诺斯杆菌(Cronobacter sakazakii) ATCC 29544、莫氏克洛诺斯杆菌(Cronobacter muytjensii) ATCC 51329、丙二酸克洛诺斯杆菌(Cronobacter malonaticus) DSM 18702、都柏林克洛诺斯杆菌(Cronobacter dublinensis) DSM 18705、广泛克洛诺斯杆菌(Cronobacter universalis) NCTC 9529、苏黎士克洛诺斯杆菌(Cronobacter turicensis) DSM 18703、香料克洛诺斯杆菌(Cronobacter condimenti) LMG 26250、都柏林克洛诺斯杆菌奶粉亚种(Cronobacter dublinensis subsp. lactaridi) DSM 18707和都柏林克洛诺斯杆菌洛桑亚种(Cronobacter dublinensis subsp. lausannensis) LMG 23824,以及其他近源食源性致病菌的外膜蛋白X (outer membrane protein X, OmpX)基因序列,利用ClustalX软件进行多重序列比对,在属间保守区域和属间差异性区域设计克罗诺杆菌ERA引物探针。经过多组引物探针筛选,已经确定了可用于ERA检测体系的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单核增生李斯特氏菌引物探
在引物探针筛选过程中,探针的荧光基团统一为6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein, FAM),淬灭基团统一用黑洞猝灭剂-1 (black hole quencher, BHQ1)。在进行双重ERA法检测时,金黄色葡萄球菌探针的荧光基团换为罗丹明X (X-rhodamine, ROX),淬灭基团不变;大肠埃希氏菌O157:H7和单核增生李斯特氏菌探针的荧光基团换为花青素5 (cyanine 5, Cy5),淬灭基团换为黑洞猝灭剂-2 (black hole quencher, BHQ2)。引物探针序列和标记信息详见
Target bacteria | Sample number | Primers name | Primer sequences (5′→3′) | GenBank accession number | Target genes | Location |
---|---|---|---|---|---|---|
Cronobacter | 1# | K-F | CCTACACCGAAAAAGATCGCACCGAAGAT | CP027107.2 | ompX | 1 989 256-1 989 284 |
K-R | GAGAAGTCCAGAGCAACGTCCTGAACC | 1 989 044-1 989 070 | ||||
K-P |
CGACTGGGCGAGCATCTACGGCGTAGTGGG[FAM-dT][THF] [BHQ1-dT]TGGTTACGACAAAGCT[c3-spacer] | |||||
Escherichia coli O157:H7 | 2# | rfbE2-F | AAAGGTAAATATGTGGGAACATTTGGAGAT | AF163334.1 | rfbE | 12-41 |
rfbE2-R | AAAATCATCAGCTTGTTCTAACTGGGCTAA | 234-263 | ||||
rfbE2- |
TGGAATGGTTGTCACGAATGACAAAACAC[Cy5-dT]T[THF]A [BHQ2-dT]GACCGTTGTTTAC[c3-spacer] | |||||
Bacillus cereus | 3# | L-F | ATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAG | KY224970.1 | 16S rRNA | 777-811 |
L-R | CAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCA | 1 048-1 083 | ||||
L-P |
CTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGC[FAM-dT][THF] AAG[BHQ1-dT]TAACGCATTAAGC[c3-spacer] | |||||
Staphylococcus aureus | 4# | J-F | CTTATAGGGATGGCTATCAGTAATGTTTCG | 0R726991.1 | nuc | 22-51 |
J-R | TCTATTTACGCCATTATCTGTTTGTGATGC | 145-174 | ||||
J- |
ACGCAAAGAGGTTTTTCTATTTCGCTAC[ROX-dT]A[THF] [BHQ1-dT]TGTTTAGTGTTAAC[c3-spacer] | |||||
Salmonella | 5# | S-F | ATATTACCAGATATATATTAGAGCAATGGAAAA | CP043222.1 | fimY | 28 653-28 685 |
S-R | ATAGCCGAGGTAGTTATCAGTTGTAATTATTG | 28 849-28 879 | ||||
S-P |
TTTAAGAAATGCCAAAGACTGCGCCTGCCG[FAM-dT]T[THF] [BHQ1-dT]CACTCTCCAACGCCG[c3-spacer] | |||||
Listeria monocytogenes | 6# | D-F | TCGATCACTCTGGAGGATACGTTGCTCAATTC | LC259949.1 | hlyA | 1 473-1 504 |
D-R | GTTACCAGGCAAATAGATGGACGATGTGAAAT | 1 599-1 630 | ||||
D- |
CATTTCTTGGGATGAAGTAAATTATGATCC [Cy5-dT]GA[THF]GG[BHQ2-dT]AACGAAATTGTTC[c3-spacer] |
a indicates that the fluorescens of the probe are uniformly modified by FAM in the primers screening process, and the quenched group is BHQ1. The fluorescens of the probe in the dual ERA detection process are listed in the table, where the quenched group is replaced by BHQ2 when Cy5 is the fluorescence group.
1.4 引物探针特异性分析
分别以克罗诺杆菌ATCC 29544、大肠埃希氏菌O157:H7 ATCC 43895、蜡样芽孢杆菌ATCC 10876为靶标菌株,并互为对照菌株,同时以
1.5 单重ERA检测
反应预混液参照荧光型核酸扩增试剂盒(ERA法)使用说明书制备:溶解剂20.0 μL,正、反向引物(10 μmol/μL)各2.1 μL,探针0.6 μL,模板1.0 μL,ddH2O 22.2 μL。取上述48.0 μL预混液溶解酶粉,振荡混匀并短暂离心。在管盖上加入2.0 μL的激活剂,小心盖好管盖,瞬时离心使激活剂进入预混液中,短暂振荡混匀并再次快速离心,放入便携式实时荧光PCR仪中反应。反应程序:第一阶段39 ℃ 1 s;第二阶段39 ℃ 16 s,共60个循环,进行FAM荧光信号收集,以无菌ddH2O为空白对照,重复实验3次。
1.6 双重ERA反应体系及检测程序
双重ERA反应体系参照荧光型核酸扩增试剂盒(ERA法)使用说明书制备预混液,每种上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL,每种探针0.4 μL,取混匀后的预混液46.0 μL至ERA酶粉反应管,模板量均为2.0 μL,向管盖滴加2.0 μL激活剂,盖紧后涡旋瞬时离心,放入便携式实时荧光PCR仪进行ERA反应。反应程序为第一阶段39 ℃ 1 s;第二阶段39 ℃ 14 s,共40个循环,进行FAM荧光信号收集,以无菌ddH2O为空白对照,重复实验3次。
1.7 双重ERA检测方法反应体系的优化
1.7.1 引物体积优化
将反应体系中3种致病菌的正、反向混合引物的体积分别调整至0.5、1.0、1.5、2.0 μL,保持其他组分不变,并相应调整ddH2O含量,使反应体系总体积保持不变,放入便携式实时荧光PCR仪中反应,每个反应设置2个平行,并重复实验3次。
1.7.2 探针体积优化
采用1.7.1筛选出的扩增效率最好的引物体积,将体系中的探针体积分别调整至0.2、0.4、0.6、0.8 μL,其他组分保持不变,余下步骤同1.7.1。
1.7.3 激活剂体积优化
采用1.7.1和1.7.2筛选出扩增效率最好的引物及探针体积,将体系中的M
1.8 双重ERA检测方法反应程序的优化
为满足快速检测需求,在1.7的最佳反应体系的基础上对反应程序进行优化,即反应程序第二阶段控制在39 ℃条件下,扩增程序分别调整为14 s、50循环;14 s、40循环;10 s、40循环;10 s、30循环,分别放入便携式实时荧光PCR仪中反应,在第二反应阶段收集FAM/ROX/Cy5荧光信号,同时以无菌ddH2O为空白对照,根据荧光扩增曲线结果确定最短反应时间,每个反应设置2个平行,并重复实验3次。
1.9 双重ERA检测方法灵敏度检测
为进一步分析建立的双重ERA检测方法的灵敏度,将模板DNA浓度分别稀释为1
1.10 人工模拟污染试验
取单菌落加入至10 mL离心管中,37 ℃培养48 h使细菌生长达到稳定期(OD600值约为2.8),作为后续实验用的种子液。将种子液以1%接种量接入BHI培养基,37 ℃培养12 h,梯度稀释后通过平板计数法对生长量进行测算,确定6种细菌在这一培养条件下的生长量。按上述操作重新培养菌液12 h,根据生长量计算,使用无菌水稀释至100 CFU/mL。
称取25 g婴儿配方乳粉作为基质,加入250 mL BHI培养基制成均质液。向均质液中分别添加2.5 mL上述100 CFU/mL的克罗诺杆菌ATCC 29544和大肠埃希氏菌O157:H7 ATCC 43895、蜡样芽孢杆菌ATCC 10876和金黄色葡萄球菌ATCC 12600、沙门氏菌ATCC 43971和单核增生李斯特氏菌ATCC 13932混合菌液,即每种菌的污染量为1 CFU/mL,37 ℃培养0、2、4、6、8 h后,按1.2方法提取基因组DNA。分析人工污染样品的检出限。实验过程中以无菌ddH2O为空白对照,重复实验3次。
1.11 市售样品检测
对37份临近保质期的婴儿配方乳粉,按1.10方法取样均质后37 ℃培养12 h,采用1.2的方法提取基因组DNA。分别以中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1870―2016《出口食品中食源性致病菌检测方法 实时荧光PCR法
2 结果与分析
2.1 ERA检测引物探针筛选
2.1.1 引物探针筛选
本研究设计了4组克罗诺杆菌引物探针,经过筛选发现引物探针组合K-F/R/P对7种克罗诺杆菌,包括阪崎克罗诺杆菌、莫金斯克罗诺杆菌、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌、尤尼沃斯克罗诺杆菌、苏黎世克罗诺杆菌、康帝蒙提克罗诺杆菌、都柏林克罗诺杆菌,以及都柏林克罗诺杆菌的2个亚种:克罗诺杆菌乳粉亚种和都柏林克罗诺杆菌洛桑亚种的扩增效果均较好(

图1 引物和探针的筛选结果
Figure 1 The screening results of primers and probes. A: Amplification results of designed the primers and probe of K-F/R/P for Cronobacter; B-G: Amplification results of six groups of primers and probes for E. coli: rfbE2-F/R/P, rfbE1-F/R/P, rfbE3-F/R/P, flic-F/R/P, STX-F/R/P, VP4-F/R/P in ERA detection system; H: Amplification results of the primers and probe of L-F/R/P for B. cereus in ERA detection system. The strain names and strain numbers corresponding to 1-23 are shown in Table 1. CK represents blank control.
2.1.2 引物探针特异性分析
沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单核增生李斯特氏菌引物探针已经过ERA试验特异性筛

图2 筛选的引物探针ERA检测特异性分析
Figure 2 Specificity analysis of ERA detection with the screened primers and probes. A: Specificity analysis results of the primers and probe of K-F/R/P for Cronobacter; B: Specific analysis results of the primers and probe of rfbE2-F/R/P for E. coli O157:H7; C: Specificity analysis results of the primers and probe of L-F/R/P for B. cereus. The strain names and strain numbers corresponding to 1, 10, 20, 24-34 are shown in Table 1. CK represents blank control.
2.2 双重ERA检测体系的确定
对筛选出的6种目标菌株的特异性引物探针进行两两组合,共构建15种不同的引物探针组合体系,采用双重ERA检测进行体系分析,结果如

图3 六种菌的双重ERA检测结果
Figure 3 Detection results of dual ERA for six bacteria. A: Dual ERA detection results of Cronobacter (FAM) and S. aureus (ROX); B: Dual ERA detection results of Cronobacter (FAM) and Salmonella (HEX); C: Dual ERA detection results of B. cereus (FAM) and E. coli O157:H7 (Cy5); D: Dual ERA detection results of B. cereus (FAM) and L. monocytogenes (Cy5); E: Dual ERA detection results of B. cereus (FAM) and Salmonella (HEX); F: Dual ERA detection results of Cronobacter (FAM) and E. coli O157:H7 (Cy5); G: Dual ERA detection results of B. cereus (FAM) and S. aureus (ROX); H: Dual ERA detection results of Salmonella (FAM) and L. monocytogenes (Cy5). CK represents blank control.
2.3 双重ERA反应体系优化
为提高扩增效率,进一步对上述建立的双重ERA反应体系进行优化,结果如

图4 双重ERA体系优化结果
Figure 4 Optimization results of dual ERA system. A-C: Dual ERA amplification results of Cronobacter (FAM) and E. coli 0157:H7 (Cy5) with optimized amounts of primers, probes and activators; D-F: Dual ERA amplification results of B. cereus (FAM) and S. aureus (ROX) with optimized amounts of primers, probes and activators; G-I: Dual ERA amplification results of Salmonella (FAM) and L. monocytogenes (Cy5) with optimized amounts of primers, probes and activators. CK represents blank control.
2.4 双重ERA检测程序优化
为建立双重ERA快速检测程序,对原始反应程序进行优化,结果如

图5 双重ERA程序优化结果
Figure 5 Optimization results of the dual ERA program. A-D: The detection results of dual ERA for Cronobacter (FAM) and E. coli O157:H7 (Cy5) in the second amplification procedure with 14 s, 50 cycles, 14 s, 40 cycles, 10 s, 40 cycles, and 10 s, 30 cycles; E-H: The detection results of dual ERA for B. cereus (FAM) and S. aureus (ROX) in the second amplification procedure with 14 s, 50 cycles, 14 s, 40 cycles, 10 s, 40 cycles, and 10 s, 30 cycles; I-L: The detection results of dual ERA for Salmonella (FAM) and L. monocytogenes (Cy5) in the second amplification procedure with 14 s, 50 cycles, 14 s, 40 cycles, 10 s, 40 cycles, and 10 s, 30 cycles. CK represents blank control.
2.5 双重ERA检测灵敏度
为分析建立的双重ERA快速检测程序的灵敏度,对模板DNA浓度梯度稀释,检测结果详见

图6 双重ERA灵敏度分析
Figure 6 Sensitivity analysis of dual ERA. A: The sensitivity analysis results of the dual ERA detection procedure for Cronobacter (FAM) and E. coli O157:H7 (Cy5); B: The sensitivity analysis results of the dual ERA detection for B. cereus (FAM) and S. aureus (ROX); C: The sensitivity analysis results of the dual ERA detection for Salmonella (FAM) and L. monocytogenes (Cy5). CK represents the blank control.
2.6 人工污染试验
使用本研究建立的双重ERA快速检测方法对人工污染的配方乳粉样品进行检测,结果详见
Time (h) | Cronobacter | Escherichia coli O157:H7 | Bacillus cereus | Staphylococcus aureus | Salmonella | Listeria monocytogenes |
---|---|---|---|---|---|---|
0 | - | - | - | - | - | - |
2 | - | - | - | - | - | - |
4 | - | - | - | - | - | - |
6 | + | + | + | + | + | + |
8 | + | + | + | + | + | + |
+: Positive; -: Negative.
2.7 市售样品检测
分别采用SN/T 1870―2016和SN/T 3932―2014的实时荧光PCR法和本研究建立的双重ERA快速检测方法对37份临近保质期的市售配方乳粉样品进行检测,37份样品中有14份检出蜡样芽孢杆菌,检出率为37.84%;有8份检出单核增生李斯特氏菌,检出率为21.62%。本研究检测结果与实时荧光PCR的检测结果一致,证明建立的双重ERA快速检测方法扩增15 min与实时荧光PCR扩增约90 min的结果等效,可实现乳粉中6种致病菌的多重快速检测。
3 讨论与结论
为了提高ERA反应通量和检测效率,本研究针对配方乳粉中6种易污染的食源性致病菌建立了双重ERA检测方法,并总结了建立多重检测方法的关键点。
3.1 引物探针筛选
双重ERA技术需在同一反应体系中加入2对引物探针,这些引物探针需要分别结合在模板DNA的特定区域,并确保能同时扩增出2个靶标核酸片段。因此,引物探针必须经过严格的设计和实验筛选,以确保其具有较高的特异性,避免引物间的非特异性结合及引物二聚体的形成;同时还需保证荧光值和出峰时间,以确保后续双重反应的扩增效率。
3.2 交叉反应性
由于不同菌株间可能存在交叉反应,在进行双重反应时,需确保不同靶标在一个反应体系中的兼容性,避免相互干扰和抑制,本研究通过两两组合分析扩增效果,确定了最优的双重组合。
3.3 反应体系优化
反应体系需包含适量的引物、探针、模板DNA和激活剂等组分。因此,需通过实验对这些组分的浓度和比例进行优化,以确保每个目标序列都能得到均衡的扩增。此外,为提高扩增效率,可在反应体系中添加适量的DMSO或甘油等辅助剂。因为DMSO能与DNA双链结合,使其解旋,增加扩增反应的特异
3.4 反应条件优化
反应体系的优化还包括温度条件、荧光采集时间和循环数的设置等。因ERA的最适反应温度一般为37 ℃,本研究主要对反应时间和循环数进行了优化。过长的反应时间和过多的循环数可能导致非特异性扩增增加,而过少则可能无法获得足够的扩增产物。通过以上四点优化,可提高检测的灵敏度、重现性和准确性。
理论上,建立三重、四重或更多重的检测方法能进一步提高检测通量,但难度也会相应提升。一方面,需要配备具有更多荧光通道的检测仪,另一方面,可能会降低扩增效率。这是因为反应体系中加入更多引物探针,会增加引物间的非特异性结合和二聚体的形成;多靶标在同一反应体系中的相互干扰和抑制也会增加;扩增的偏好性还可能导致某些DNA片段或模板被优先扩增,而其他片段的扩增较少或无扩增。本研究在建立双重ERA检测体系时发现,克罗诺杆菌和大肠埃希氏菌O157:H7、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌2种组合的灵敏度相较于沙门氏菌和单核增生李斯特氏菌组合低。这除了是自身引物探针的扩增效率存在差异外,很有可能是因为检测体系中多个引物探针、多个靶标之间出现交叉抑制或扩增的偏好性所致。这一方面可通过增加前增菌时间以提高检出率,另一方面,也可进一步筛选更优的引物探针组合以提高检测的灵敏度,减少在实际应用中的影响。
本研究通过引物探针筛选、特异性分析、双重组合的确定,建立了配方乳粉中克罗诺杆菌-大肠埃希氏菌O157:H7、蜡样芽孢杆菌-金黄色葡萄球菌、沙门氏菌-单核增生李斯特氏菌3组双重ERA检测方法。通过对反应体系、扩增程序的优化,将检测时间缩短到20 min左右。对克罗诺杆菌、大肠埃希氏菌O157:H7、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌纯培养物的检出限为1 ng/μL,对沙门氏菌、单核增生李斯特氏菌纯培养物的检出限为1
作者贡献声明
苗雅倩:负责文章的撰写和修改工作,完成双重ERA的具体实验和数据分析;杨艳歌:负责引物探针设计,设计研究方案,指导完成具体的研究内容和文章的修改;赵健淞:负责单重ERA引物探针筛选,并参与实验的讨论和数据的收集与整理工作;魏莹:负责克罗诺杆菌引物探针的筛选,为后续实验的顺利推进提供了数据支持;王秀娟:负责文章的检查和校对,确保论文的准确性和专业性;袁飞:有效协调研究成员的工作,确保各项研究任务的顺利推进和高效完成;王正亮:对本研究进行有效监督和指导,同时负责论文的整体框架构建;张峰:明确研究目标和研究内容,确保文章的逻辑性和条理性。该成果由张峰于2025年1月1日前指导完成。
利益冲突
作者声明不存在任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。
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