摘要:

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摘要:从四川鲶科鱼类养殖场濒死的大口鲇（Silurus meridionalis Chen）体内分离到3株优势菌，人工感染试验表明菌株TWN3致病性最强。通过形态学观察、生理生化测定，结合DNA的G+Cmol%、16S rDNA序列同源性和系统发育分析，确定TWN3为普通变形杆菌（Proteus vulgaris)。再根据生理生化特性，可进一步确定TWN3属于普通变形杆菌（Proteus vulgaris)中的P. vulgarisBG3。该菌株不溶血；对庆大霉素等4种药物敏感；对小鼠有较强的致病性。生长特性研究表明，该菌最适生长温度37℃、最适pH6.0、37℃时盐度1.5%生长最适。普通变形杆菌致病性广泛，但作为养殖大口鲇的致病菌国内外未见报道。另外，对该菌的分类学研究、生长特性、感染途径及防治进行了讨论。

摘要:从四川鲶科鱼类养殖场濒死的大口鲇（Silurus meridionalis Chen）体内分离到3株优势菌，人工感染试验表明菌株TWN3致病性最强。通过形态学观察、生理生化测定，结合DNA的G+Cmol%、16S rDNA序列同源性和系统发育分析，确定TWN3为普通变形杆菌（Proteus vulgaris)。再根据生理生化特性，可进一步确定TWN3属于普通变形杆菌（Proteus vulgaris)中的P. vulgarisBG3。该菌株不溶血；对庆大霉素等4种药物敏感；对小鼠有较强的致病性。生长特性研究表明，该菌最适生长温度37℃、最适pH6.0、37℃时盐度1.5%生长最适。普通变形杆菌致病性广泛，但作为养殖大口鲇的致病菌国内外未见报道。另外，对该菌的分类学研究、生长特性、感染途径及防治进行了讨论。

摘要:从土壤中筛选得到1株高产链霉亲和素的放线菌ZG0429，根据形态观察、培养特征、生理生化鉴定以及16S rRNA序列分析，初步判定该菌株为链霉菌属中的淡紫灰链霉菌（Streptomyces lavendulae）。经发酵，ZG0429的链霉亲和素产量可达201.0mg/L。进一步采用硫铵沉淀和凝胶过滤层析纯化，链霉亲和素的回收率为76.87％，纯度可以达到97.03％。该方法简单易行，成本低廉，可得到高产量、高纯度、高活性的目的蛋白，为链霉亲和素发酵产品的大规模纯化提供了依据。

摘要:从土壤中筛选得到1株高产链霉亲和素的放线菌ZG0429，根据形态观察、培养特征、生理生化鉴定以及16S rRNA序列分析，初步判定该菌株为链霉菌属中的淡紫灰链霉菌（Streptomyces lavendulae）。经发酵，ZG0429的链霉亲和素产量可达201.0mg/L。进一步采用硫铵沉淀和凝胶过滤层析纯化，链霉亲和素的回收率为76.87％，纯度可以达到97.03％。该方法简单易行，成本低廉，可得到高产量、高纯度、高活性的目的蛋白，为链霉亲和素发酵产品的大规模纯化提供了依据。

摘要:利用ITS序列分析技术对中国栽培灵芝菌株进行了亲缘关系分析。结果发现中国栽培灵芝菌株分布于5个聚类组，其中树舌亚属、紫芝组的菌株各自聚成一组，灵芝组的菌株分成3组，85.7%灵芝组菌株均聚于同一组, 表明树舌亚属、紫芝组和灵芝组间的遗传差异较大，灵芝组内虽然存在着一定的遗传差异，但总体上亲缘关系比较近，遗传多样性并不丰富。聚类结果也表明仅仅根据形态学特征并不能将灵芝属菌株进行有效的分类，利用分子生物学的技术手段对灵芝菌种进行分类是一种更有效的方法。

摘要:利用ITS序列分析技术对中国栽培灵芝菌株进行了亲缘关系分析。结果发现中国栽培灵芝菌株分布于5个聚类组，其中树舌亚属、紫芝组的菌株各自聚成一组，灵芝组的菌株分成3组，85.7%灵芝组菌株均聚于同一组, 表明树舌亚属、紫芝组和灵芝组间的遗传差异较大，灵芝组内虽然存在着一定的遗传差异，但总体上亲缘关系比较近，遗传多样性并不丰富。聚类结果也表明仅仅根据形态学特征并不能将灵芝属菌株进行有效的分类，利用分子生物学的技术手段对灵芝菌种进行分类是一种更有效的方法。

摘要:依照蜡状芽孢杆菌gerM基因的保守序列设计引物，从苏云金芽孢杆菌中扩增出640bp的DNA片段。以此为探针，从苏云金芽孢杆菌部分基因组酶切文库中成功地克隆到了一个4.5kb的DNA片段。序列分析表明，该片段包含一个完整的开放阅读框，其预测的编码产物与枯草芽孢杆菌GerM蛋白具有很高的同源性，将该基因命名为gerM。RT-PCR分析表明，gerM基因仅在芽孢形成的过程中表达。通过同源重组的策略构建了gerM基因的阻断突变株。研究表明，gerM基因的破坏影响苏云金芽孢杆菌芽孢萌发的速率和比例。

摘要:依照蜡状芽孢杆菌gerM基因的保守序列设计引物，从苏云金芽孢杆菌中扩增出640bp的DNA片段。以此为探针，从苏云金芽孢杆菌部分基因组酶切文库中成功地克隆到了一个4.5kb的DNA片段。序列分析表明，该片段包含一个完整的开放阅读框，其预测的编码产物与枯草芽孢杆菌GerM蛋白具有很高的同源性，将该基因命名为gerM。RT-PCR分析表明，gerM基因仅在芽孢形成的过程中表达。通过同源重组的策略构建了gerM基因的阻断突变株。研究表明，gerM基因的破坏影响苏云金芽孢杆菌芽孢萌发的速率和比例。

摘要:

摘要:为了研究单核细胞增生李斯特菌毒力基因启动子的结构特点与转录调控因子PrfA蛋白之间的关系，应用PCR定点突变和重组PCR技术缺失了该菌毒力基因inlC启动子上可能与PrfA蛋白结合以及诱发转录起始相关的碱基序列，构建了一系列突变启动子与lacZ报告基因融合表达质粒, 使lacZ基因的表达置于inlC突变启动子下，并分别电转化单核细胞增生李斯特菌野生株P14、PrfA蛋白高表达突变株P14a 和prfA基因等位缺失突变株A42中，检测相应的β-半乳糖苷酶活性。结果表明：位于inlC启动子转录起始点下游22bp 处的一段17bp的类似PrfA蛋白结合序列TTAACAGCGTTTGTTAA并没有增强和抑制PrfA转录调控活性的功能；甚至将其改造成“完美的” PrfA蛋白结合序列TTAACATTTGTTAA后，也不影响inlC依赖于PrfA的转录活性地表达；但是，如果缺失inlC启动子上原始的PrfA蛋白结合序列，则使inlC依赖于PrfA的转录活性完全丧失；另外，单核细胞增生李斯特菌毒力基因inlC和plcA 依赖于PrfA的转录活性的表达也与启动子上PrfA蛋白结合区(PrfA-box)距离-10区的碱基个数有关:最适为22或23bp，长于23bp或短于22bp的突变启动子的依赖PrfA的转录活性大大降低，甚至没有活性。说明除PrfA蛋白结合序列外，受PrfA调控的毒力基因启动子上还可能存在其它尚未阐明的结构和序列影响PrfA蛋白的结合以及启动转录表达。

摘要:为了研究单核细胞增生李斯特菌毒力基因启动子的结构特点与转录调控因子PrfA蛋白之间的关系，应用PCR定点突变和重组PCR技术缺失了该菌毒力基因inlC启动子上可能与PrfA蛋白结合以及诱发转录起始相关的碱基序列，构建了一系列突变启动子与lacZ报告基因融合表达质粒, 使lacZ基因的表达置于inlC突变启动子下，并分别电转化单核细胞增生李斯特菌野生株P14、PrfA蛋白高表达突变株P14a 和prfA基因等位缺失突变株A42中，检测相应的β-半乳糖苷酶活性。结果表明：位于inlC启动子转录起始点下游22bp 处的一段17bp的类似PrfA蛋白结合序列TTAACAGCGTTTGTTAA并没有增强和抑制PrfA转录调控活性的功能；甚至将其改造成“完美的” PrfA蛋白结合序列TTAACATTTGTTAA后，也不影响inlC依赖于PrfA的转录活性地表达；但是，如果缺失inlC启动子上原始的PrfA蛋白结合序列，则使inlC依赖于PrfA的转录活性完全丧失；另外，单核细胞增生李斯特菌毒力基因inlC和plcA 依赖于PrfA的转录活性的表达也与启动子上PrfA蛋白结合区(PrfA-box)距离-10区的碱基个数有关:最适为22或23bp，长于23bp或短于22bp的突变启动子的依赖PrfA的转录活性大大降低，甚至没有活性。说明除PrfA蛋白结合序列外，受PrfA调控的毒力基因启动子上还可能存在其它尚未阐明的结构和序列影响PrfA蛋白的结合以及启动转录表达。

摘要:幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori，Hp）感染是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因，与胃癌和胃粘膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤的发生也密切相关。目前所用的疫苗制造成本高、运输费用贵，然而利用转基因植物生产的植物疫苗成本低廉、服用方便是现有疫苗的良好替代品。将Hp相关蛋白与免疫佐剂CTB的融合基因（ctb-linker-cagA和ctb-linker-ureB） 利用PCR、酶切、连接等一系列方法从载体p1300-WxCLCN和p1300-WxCLUN中重组到载体pCAMBIA2301中（含35S启动子），重组载体分别命名为p2301-35SCLCN和p2301-5SCLUN。通过冻融法将载体导入农杆菌EHA105菌株中，以农杆菌介导的方法，将重组载体p2301-35SCLCN和p2301-35SCLUN转化烟草黄苗榆和心叶烟，获得了具有卡那霉素抗性再生植株，经过酶切、PCR、GUS染色和PCR-Southern鉴定结果表明，目的基因分别正确插入载体中并稳定整合到植株中，为利用植物反应器生产幽门螺杆菌疫苗奠定了坚实的基础。

摘要:幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori，Hp）感染是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因，与胃癌和胃粘膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤的发生也密切相关。目前所用的疫苗制造成本高、运输费用贵，然而利用转基因植物生产的植物疫苗成本低廉、服用方便是现有疫苗的良好替代品。将Hp相关蛋白与免疫佐剂CTB的融合基因（ctb-linker-cagA和ctb-linker-ureB） 利用PCR、酶切、连接等一系列方法从载体p1300-WxCLCN和p1300-WxCLUN中重组到载体pCAMBIA2301中（含35S启动子），重组载体分别命名为p2301-35SCLCN和p2301-5SCLUN。通过冻融法将载体导入农杆菌EHA105菌株中，以农杆菌介导的方法，将重组载体p2301-35SCLCN和p2301-35SCLUN转化烟草黄苗榆和心叶烟，获得了具有卡那霉素抗性再生植株，经过酶切、PCR、GUS染色和PCR-Southern鉴定结果表明，目的基因分别正确插入载体中并稳定整合到植株中，为利用植物反应器生产幽门螺杆菌疫苗奠定了坚实的基础。

摘要:bldA 编码天蓝色链霉菌中唯一有效识别UUA亮氨酸密码的tRNA(Leu)UUA。通过构建阿维链霉菌NRRL8165基因组亚文库，筛选得到含有阿维链霉菌bldA_a及其侧翼序列的克隆。利用λRED介导的PCR targeting技术构建了bldA_a的基因置换质粒pHL358，将其跨属接合转移进入阿维链霉菌NRRL8165，筛选得到bldA_a基因置换菌株TW10。TW10表现为光秃表型，表明bldA_a调控阿维链霉菌的形态分化。摇瓶发酵TW10菌株并对发酵产物进行HPLC分析，发现TW10菌株均不合成阿维菌素组分，提示阿维菌素的合成受bldA_a调控；考察阿维菌素生物合成基因簇，其中aveA3 和aveR 含有TTA密码，它们的翻译可能受bldA_a调控，与实验结果一致。

摘要:bldA 编码天蓝色链霉菌中唯一有效识别UUA亮氨酸密码的tRNA(Leu)UUA。通过构建阿维链霉菌NRRL8165基因组亚文库，筛选得到含有阿维链霉菌bldA_a及其侧翼序列的克隆。利用λRED介导的PCR targeting技术构建了bldA_a的基因置换质粒pHL358，将其跨属接合转移进入阿维链霉菌NRRL8165，筛选得到bldA_a基因置换菌株TW10。TW10表现为光秃表型，表明bldA_a调控阿维链霉菌的形态分化。摇瓶发酵TW10菌株并对发酵产物进行HPLC分析，发现TW10菌株均不合成阿维菌素组分，提示阿维菌素的合成受bldA_a调控；考察阿维菌素生物合成基因簇，其中aveA3 和aveR 含有TTA密码，它们的翻译可能受bldA_a调控，与实验结果一致。

摘要:为了研究中国胜红蓟黄脉病毒 (Ageratum yellow vein Chin virus，AYVCNV)和假马鞭曲叶病毒 (Stachytarpheta leaf curl virus，StaLCV) C4蛋白的功能，利用烟草脆裂病毒 (Tobacco rattle virus，TRV) 载体在本氏烟 (Nicotiana benthamiana) 中分别表达了这两种病毒的C4蛋白，结果发现它们均能在本氏烟中引起类似于病毒侵染的症状，推测AYVCNV和StaLCV的C4蛋白是病毒的致病因子；在RNA沉默的抑制试验中，AYVCNV和StaLCV的C4蛋白均能够在表达gfp基因的转基因本氏烟（16c）上抑制由gfp基因正义链引起的基因沉默的建立，证明它们都是RNA沉默的抑制子。

摘要:为了研究中国胜红蓟黄脉病毒 (Ageratum yellow vein Chin virus，AYVCNV)和假马鞭曲叶病毒 (Stachytarpheta leaf curl virus，StaLCV) C4蛋白的功能，利用烟草脆裂病毒 (Tobacco rattle virus，TRV) 载体在本氏烟 (Nicotiana benthamiana) 中分别表达了这两种病毒的C4蛋白，结果发现它们均能在本氏烟中引起类似于病毒侵染的症状，推测AYVCNV和StaLCV的C4蛋白是病毒的致病因子；在RNA沉默的抑制试验中，AYVCNV和StaLCV的C4蛋白均能够在表达gfp基因的转基因本氏烟（16c）上抑制由gfp基因正义链引起的基因沉默的建立，证明它们都是RNA沉默的抑制子。

摘要:从实验室保藏的光合细菌中筛选出一株对亚硒酸钠还原效率较高的菌株S3，其亚硒酸钠还原产物通过透射电子显微镜及EDX (Electron-Dispersive X-ray)分析确定为红色单质硒。菌株S3的形态学特征、生理生化特征及光合色素扫描结果与固氮红细菌(Rhodobacter azotoformans)的特征基本一致；16S rDNA序列(GenBank登录号为DQ402051)在系统发育树中与固氮红细菌同属一个类群，序列同源性为99%。根据上述结果将菌株S3鉴定为固氮红细菌。初步研究了该菌株还原亚硒酸钠的特性，首次报道固氮红细菌具有还原亚硒酸盐产生红色单质硒的能力，为今后利用微生物方法治理环境中硒污染、利用微生物方法获得活性红色单质硒以及对微生物还原亚硒酸盐产生红色单质硒的机理研究奠定了良好的基础。

摘要:从实验室保藏的光合细菌中筛选出一株对亚硒酸钠还原效率较高的菌株S3，其亚硒酸钠还原产物通过透射电子显微镜及EDX (Electron-Dispersive X-ray)分析确定为红色单质硒。菌株S3的形态学特征、生理生化特征及光合色素扫描结果与固氮红细菌(Rhodobacter azotoformans)的特征基本一致；16S rDNA序列(GenBank登录号为DQ402051)在系统发育树中与固氮红细菌同属一个类群，序列同源性为99%。根据上述结果将菌株S3鉴定为固氮红细菌。初步研究了该菌株还原亚硒酸钠的特性，首次报道固氮红细菌具有还原亚硒酸盐产生红色单质硒的能力，为今后利用微生物方法治理环境中硒污染、利用微生物方法获得活性红色单质硒以及对微生物还原亚硒酸盐产生红色单质硒的机理研究奠定了良好的基础。

摘要:以北京棒杆菌（Corynebacterium pekinense）野生株AS1.299和突变株PD-67的基因组为模板，用PCR方法扩增了邻氨基苯甲酸合成酶（AS）基因（trpEG）片段和前端控制序列。核酸序列分析结果表明，该片段全长3374bp，包含3个ORF，推测分别为前导肽基因trpL、AS componentⅠ基因trpE和AS componentⅡ基因trpG。C. pekinense野生株AS1.299与突变株PD-67相比较，trpL基因完全一样；trpE基因有6个碱基的突变，导致了5个氨基酸残基的改变；trpG基因有1个碱基的突变，导致了1个氨基酸残基的改变；同时它们在-35序列处还有一个A→G的突变。通过同源性比较发现，C. pekinense AS1.299与Corynebacterium glutamicum ATCC 13032和Brevibacterium lactofermentum的亲缘关系是很近的。trpL基因上游存在启动子区域，并能被Escherichia coli的RNA聚合酶所识别，实现异源互补。野生型和突变型AS基因在C. pekinense AS1.299和PD-67中都得到表达，并且重组菌相对于宿主菌的酶活都有了很大提高。摇瓶发酵实验结果表明，带有突变型AS基因的PD-67重组菌生长比较慢，稳定期比PD-67推迟24h，但产生的L-色氨酸比PD-67高22.39%。

摘要:以北京棒杆菌（Corynebacterium pekinense）野生株AS1.299和突变株PD-67的基因组为模板，用PCR方法扩增了邻氨基苯甲酸合成酶（AS）基因（trpEG）片段和前端控制序列。核酸序列分析结果表明，该片段全长3374bp，包含3个ORF，推测分别为前导肽基因trpL、AS componentⅠ基因trpE和AS componentⅡ基因trpG。C. pekinense野生株AS1.299与突变株PD-67相比较，trpL基因完全一样；trpE基因有6个碱基的突变，导致了5个氨基酸残基的改变；trpG基因有1个碱基的突变，导致了1个氨基酸残基的改变；同时它们在-35序列处还有一个A→G的突变。通过同源性比较发现，C. pekinense AS1.299与Corynebacterium glutamicum ATCC 13032和Brevibacterium lactofermentum的亲缘关系是很近的。trpL基因上游存在启动子区域，并能被Escherichia coli的RNA聚合酶所识别，实现异源互补。野生型和突变型AS基因在C. pekinense AS1.299和PD-67中都得到表达，并且重组菌相对于宿主菌的酶活都有了很大提高。摇瓶发酵实验结果表明，带有突变型AS基因的PD-67重组菌生长比较慢，稳定期比PD-67推迟24h，但产生的L-色氨酸比PD-67高22.39%。

摘要:根据漆酶铜结合保守区氨基酸序列设计简并引物，从新型漆酶合成菌株栓菌420（Trametes sp. 420）基因组DNA扩增得到一新的漆酶同工酶基因（lacC）片段，应用长距离反向PCR技术获得其两端侧翼序列。克隆得到的lacC序列长3640bp，包括长2263bp的开放读码框及5′和3′-非编码区。lacC cDNA序列长1560bp，编码一519aa的多肽。推导的LacC蛋白序列内部存在有10个潜在的N-糖基化位点和4个铜原子结合区。将不含自身信号序列的lacC cDNA以pPIC9载体为媒介克隆到表达载体pPIC9K上，转化毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115细胞。重组菌在含有0.3mmol/L CuSO4和0.8%丙氨酸的BMM培养基中20℃培养9d，重组漆酶（rLacC）产量达到1.62×104U/L。用发酵粗酶液对终浓度50mg/L的染料进行脱色实验，结果表明，6U/L的rLacC对测试的三甲基类和偶氮类染料具有良好的脱色作用，小分子介体ABTS和HBT能够提高rLacC对染料的脱色效率和脱色速度。

摘要:根据漆酶铜结合保守区氨基酸序列设计简并引物，从新型漆酶合成菌株栓菌420（Trametes sp. 420）基因组DNA扩增得到一新的漆酶同工酶基因（lacC）片段，应用长距离反向PCR技术获得其两端侧翼序列。克隆得到的lacC序列长3640bp，包括长2263bp的开放读码框及5′和3′-非编码区。lacC cDNA序列长1560bp，编码一519aa的多肽。推导的LacC蛋白序列内部存在有10个潜在的N-糖基化位点和4个铜原子结合区。将不含自身信号序列的lacC cDNA以pPIC9载体为媒介克隆到表达载体pPIC9K上，转化毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115细胞。重组菌在含有0.3mmol/L CuSO4和0.8%丙氨酸的BMM培养基中20℃培养9d，重组漆酶（rLacC）产量达到1.62×104U/L。用发酵粗酶液对终浓度50mg/L的染料进行脱色实验，结果表明，6U/L的rLacC对测试的三甲基类和偶氮类染料具有良好的脱色作用，小分子介体ABTS和HBT能够提高rLacC对染料的脱色效率和脱色速度。

摘要:通过气相色谱法（GC）快速分析8种真菌的脂肪酸成分，发现匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）具有较高的γ-亚麻酸含量，利用RT-PCR和RACE方法获得了全长为1475bp的匍枝根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的cDNA序列，其中开放阅读框为1380bp，编码459个氨基酸。生物信息学分析所克隆的基因具有△6-脂肪酸脱氢酶的典型结构：N端具有细胞色素b5结构、具有3个保守的组氨酸区序列和跨膜结构；把该基因的开放阅读框序列连接到表达载体pYES2.0，构建重组表达载体pYRnD6D，并将其转入缺陷型酿酒酵母INVScl中进行表达。GC分析表明，该序列在酵母中获得了表达，表达产物表现出△6-脂肪酸脱氢酶的酶学活性，能将底物亚油酸转化为γ-亚麻酸。新生成的γ-亚麻酸占酵母细胞总脂肪酸的12.25%。

摘要:通过气相色谱法（GC）快速分析8种真菌的脂肪酸成分，发现匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）具有较高的γ-亚麻酸含量，利用RT-PCR和RACE方法获得了全长为1475bp的匍枝根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的cDNA序列，其中开放阅读框为1380bp，编码459个氨基酸。生物信息学分析所克隆的基因具有△6-脂肪酸脱氢酶的典型结构：N端具有细胞色素b5结构、具有3个保守的组氨酸区序列和跨膜结构；把该基因的开放阅读框序列连接到表达载体pYES2.0，构建重组表达载体pYRnD6D，并将其转入缺陷型酿酒酵母INVScl中进行表达。GC分析表明，该序列在酵母中获得了表达，表达产物表现出△6-脂肪酸脱氢酶的酶学活性，能将底物亚油酸转化为γ-亚麻酸。新生成的γ-亚麻酸占酵母细胞总脂肪酸的12.25%。

摘要:在甘油厌氧发酵生产1,3-丙二醇的过程中，需要消耗还原当量NADH，NADH的有效供给决定了1,3-丙二醇的产量和得率。采用PCR方法从Candida boidinii基因组中克隆编码甲酸脱氢酶基因fdh，将fdh基因片段插入载体pMAL^TM-p2X中，构建表达载体pMALsup>TM-p2X-fdh，并转入1,3-丙二醇生产菌Klebsiella pneumoniae YMU2，获得重组菌Klebsiella pneumoniae F-1。研究了重组质粒的稳定性和IPTG诱导fdh基因过量表达的条件。结果表明，重组质粒具有良好的稳定性；fdh基因表达的蛋白分子量为40.2kDa；IPTG诱导表达研究表明，在IPTG浓度为0.5mmol/L时，诱导4h后甲酸脱氢酶表达明显；发酵过程中甲酸脱氢酶比酶活达到5.47U/mg；与出发菌株K. pneumoniae YMU2相比，重组菌F-1合成1,3-丙二醇的浓度提高了12.5％。

摘要:在甘油厌氧发酵生产1,3-丙二醇的过程中，需要消耗还原当量NADH，NADH的有效供给决定了1,3-丙二醇的产量和得率。采用PCR方法从Candida boidinii基因组中克隆编码甲酸脱氢酶基因fdh，将fdh基因片段插入载体pMAL^TM-p2X中，构建表达载体pMALsup>TM-p2X-fdh，并转入1,3-丙二醇生产菌Klebsiella pneumoniae YMU2，获得重组菌Klebsiella pneumoniae F-1。研究了重组质粒的稳定性和IPTG诱导fdh基因过量表达的条件。结果表明，重组质粒具有良好的稳定性；fdh基因表达的蛋白分子量为40.2kDa；IPTG诱导表达研究表明，在IPTG浓度为0.5mmol/L时，诱导4h后甲酸脱氢酶表达明显；发酵过程中甲酸脱氢酶比酶活达到5.47U/mg；与出发菌株K. pneumoniae YMU2相比，重组菌F-1合成1,3-丙二醇的浓度提高了12.5％。

摘要:以红色荧光蛋白作为报告蛋白研究了里氏木霉的纤维素酶合成机理。构建了里氏木霉的表达盒，通过该表达盒使红色荧光蛋白的基因整合到里氏木霉的基因组DNA上，并受纤维二糖水解酶基因启动子的调控，得到重组菌株T. reesei TR2。在不同的条件下培养T. reesei TR2，红色荧光蛋白的表达情况可以反映在不同条件下里氏木霉合成纤维素酶的情况。在诱导的情况下，红色荧光蛋白随时间变化的情况与培养液中纤维素酶活性的变化相似，培养至36h后可以观察到荧光，并且不断增强，到菌丝自溶时荧光减弱。另一方面，诱导后里氏木霉菌丝的各个部位均可以观察到荧光，而且分布均匀，表明菌丝的各个部位在纤维素酶合成过程中所起的作用相同。在非诱导的情况下，培养时间较长时也可以观察到较弱的荧光，表明在此条件下里氏木霉仍可以合成少量的纤维素酶，这一结果为解释纤维素诱导里氏木霉合成纤维素酶的机理提供了另一个试验依据。

摘要:以红色荧光蛋白作为报告蛋白研究了里氏木霉的纤维素酶合成机理。构建了里氏木霉的表达盒，通过该表达盒使红色荧光蛋白的基因整合到里氏木霉的基因组DNA上，并受纤维二糖水解酶基因启动子的调控，得到重组菌株T. reesei TR2。在不同的条件下培养T. reesei TR2，红色荧光蛋白的表达情况可以反映在不同条件下里氏木霉合成纤维素酶的情况。在诱导的情况下，红色荧光蛋白随时间变化的情况与培养液中纤维素酶活性的变化相似，培养至36h后可以观察到荧光，并且不断增强，到菌丝自溶时荧光减弱。另一方面，诱导后里氏木霉菌丝的各个部位均可以观察到荧光，而且分布均匀，表明菌丝的各个部位在纤维素酶合成过程中所起的作用相同。在非诱导的情况下，培养时间较长时也可以观察到较弱的荧光，表明在此条件下里氏木霉仍可以合成少量的纤维素酶，这一结果为解释纤维素诱导里氏木霉合成纤维素酶的机理提供了另一个试验依据。

摘要:根据抗菌肽天蚕素A(cecropinA，CA)N端第1～7个氨基酸残基，马盖宁 (magainin，M)N端第2～12个氨基酸残基,以毕赤酵母偏爱的密码子设计合成了杂合肽CA(1～7)-M(2～12)基因，同载体pPICZα-A连接后转化Pichia pastoris受体菌SMD1168，在醇氧化酶(AOX)启动子调控下，分子量约1.9kDa的CecA-Mag杂合抗菌肽获得表达，抗菌特性研究表明，该表达产物具有广谱抗菌活性，对多数G-菌及G+菌均有较好的抑菌活性。初步抑菌活性测定，显示该杂合肽对金黄色葡萄球菌、耐氨苄青霉素的大肠杆菌及枯草芽孢杆菌有良好的抑杀活性。酸稳定实验显示pH为3.2时仍具有相当高的活性。热稳定性实验显示该杂合肽100℃加热5min后仍具有抑菌活性。这些特点使得重组抗菌肽CecA-mag 在疾病防治和动物饲料添加剂等方面显露出很好的应用前景。

摘要:根据抗菌肽天蚕素A(cecropinA，CA)N端第1～7个氨基酸残基，马盖宁 (magainin，M)N端第2～12个氨基酸残基,以毕赤酵母偏爱的密码子设计合成了杂合肽CA(1～7)-M(2～12)基因，同载体pPICZα-A连接后转化Pichia pastoris受体菌SMD1168，在醇氧化酶(AOX)启动子调控下，分子量约1.9kDa的CecA-Mag杂合抗菌肽获得表达，抗菌特性研究表明，该表达产物具有广谱抗菌活性，对多数G-菌及G+菌均有较好的抑菌活性。初步抑菌活性测定，显示该杂合肽对金黄色葡萄球菌、耐氨苄青霉素的大肠杆菌及枯草芽孢杆菌有良好的抑杀活性。酸稳定实验显示pH为3.2时仍具有相当高的活性。热稳定性实验显示该杂合肽100℃加热5min后仍具有抑菌活性。这些特点使得重组抗菌肽CecA-mag 在疾病防治和动物饲料添加剂等方面显露出很好的应用前景。

摘要:STK11蛋白（serine/threonine kinase 11）是近年来发现的具有多种重要功能的蛋白，可参与调控细胞周期、p53介导的细胞凋亡、ras诱导的细胞转化、细胞极化等多种生物学过程。利用大肠杆菌高效表达有活性的人STK11蛋白，可为其结构和功能的深入研究打下良好基础。利用本室克隆的人STK11 cDNA和原核表达载体pET-44a(+)构建带有Nus融合标签的诱导型表达载体pET-Nus-STK11，在不同的大肠杆菌宿主中诱导表达。SDS-PAGE和Western blot检测表明，在BL21(DE3)宿主中表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在，占菌体总蛋白的8.9%；在Rosetta-gami (DE3)pLysS宿主中主要表达为可溶性蛋白，占菌体总蛋白的16.7%。而经纯化和包涵体蛋白复性处理后，以Chariot介导重组融合蛋白进入人肝癌细胞SMMC-7721检测其对细胞生长和细胞周期的影响。与对照组相比，BL21(DE3)中表达的Nus-STK11蛋白几乎无抑制活性；而Rosetta-gami (DE3)pLysS中表达的Nus-STK11蛋白可以显著抑制SMMC-7721细胞的生长，抑制率达47.05%，并导致细胞周期的G₀/G₁期阻滞，证实表达的重组融合蛋白具有明显的生物学活性。上述结果为在大肠杆菌中成功表达有活性的重组STK11蛋白的首次报道。

摘要:STK11蛋白（serine/threonine kinase 11）是近年来发现的具有多种重要功能的蛋白，可参与调控细胞周期、p53介导的细胞凋亡、ras诱导的细胞转化、细胞极化等多种生物学过程。利用大肠杆菌高效表达有活性的人STK11蛋白，可为其结构和功能的深入研究打下良好基础。利用本室克隆的人STK11 cDNA和原核表达载体pET-44a(+)构建带有Nus融合标签的诱导型表达载体pET-Nus-STK11，在不同的大肠杆菌宿主中诱导表达。SDS-PAGE和Western blot检测表明，在BL21(DE3)宿主中表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在，占菌体总蛋白的8.9%；在Rosetta-gami (DE3)pLysS宿主中主要表达为可溶性蛋白，占菌体总蛋白的16.7%。而经纯化和包涵体蛋白复性处理后，以Chariot介导重组融合蛋白进入人肝癌细胞SMMC-7721检测其对细胞生长和细胞周期的影响。与对照组相比，BL21(DE3)中表达的Nus-STK11蛋白几乎无抑制活性；而Rosetta-gami (DE3)pLysS中表达的Nus-STK11蛋白可以显著抑制SMMC-7721细胞的生长，抑制率达47.05%，并导致细胞周期的G₀/G₁期阻滞，证实表达的重组融合蛋白具有明显的生物学活性。上述结果为在大肠杆菌中成功表达有活性的重组STK11蛋白的首次报道。

摘要:迄今为止的研究报道表明，对氯苯胺的生物降解只能以邻位途径或修饰邻位途径进行。采用HPLC、液相色谱质谱联用技术（LC/MS）对Diaphorobacter PCA039菌株降解对氯苯胺的中间代谢产物进行了分析和鉴定，结果表明，对氯苯胺经PCA039菌株的降解形成了氯代邻苯二酚，5-氯-4草酰巴豆酸，5-氯-2-氧戊烯酸，5-氯-2-氧-4-羟戊酸，氯代乙酸等中间代谢产物，这些都是典型的间位代谢途径(meta-pathway)的中间物质，说明Diaphorobacter PCA039菌株以间位裂解途径对对氯苯胺进行降解。这对于对氯代胺的生物降解代谢研究、代谢机理及其遗传表达调控研究具有意义。

摘要:迄今为止的研究报道表明，对氯苯胺的生物降解只能以邻位途径或修饰邻位途径进行。采用HPLC、液相色谱质谱联用技术（LC/MS）对Diaphorobacter PCA039菌株降解对氯苯胺的中间代谢产物进行了分析和鉴定，结果表明，对氯苯胺经PCA039菌株的降解形成了氯代邻苯二酚，5-氯-4草酰巴豆酸，5-氯-2-氧戊烯酸，5-氯-2-氧-4-羟戊酸，氯代乙酸等中间代谢产物，这些都是典型的间位代谢途径(meta-pathway)的中间物质，说明Diaphorobacter PCA039菌株以间位裂解途径对对氯苯胺进行降解。这对于对氯代胺的生物降解代谢研究、代谢机理及其遗传表达调控研究具有意义。

摘要:苏云金芽胞杆菌幕虫亚种T02菌株的伴胞晶体在芽胞外壁内侧形成，呈现晶胞粘连的现象。在此菌株中克隆了cry26Aa和cry28Aa两个基因，并对晶胞粘连现象与质粒的相关性做了系统研究。通过消除幕虫亚种T02菌株的质粒，得到了仅消除cry26Aa所在质粒的菌株BMB1151和无质粒的菌株BMB1152。通过穿梭载体将cry26Aa和cry28Aa两个基因分别和同时转化无质粒突变株BMB1152并表达，形成的晶体与芽胞独立存在不能粘连，表明在幕虫亚种染色体背景下仅仅cry的表达不能形成晶胞粘连现象，从而推断晶胞粘连现象可能与幕虫亚种两个基因所在的质粒有关；进一步的研究发现将cry26Aa在仅消除cry26Aa所在质粒的突变株BMB1151中表达，形成的晶体与芽胞也分别独立存在不能粘连，从而进一步推断幕虫亚种晶胞粘连现象与cry26Aa所在质粒有关。

摘要:苏云金芽胞杆菌幕虫亚种T02菌株的伴胞晶体在芽胞外壁内侧形成，呈现晶胞粘连的现象。在此菌株中克隆了cry26Aa和cry28Aa两个基因，并对晶胞粘连现象与质粒的相关性做了系统研究。通过消除幕虫亚种T02菌株的质粒，得到了仅消除cry26Aa所在质粒的菌株BMB1151和无质粒的菌株BMB1152。通过穿梭载体将cry26Aa和cry28Aa两个基因分别和同时转化无质粒突变株BMB1152并表达，形成的晶体与芽胞独立存在不能粘连，表明在幕虫亚种染色体背景下仅仅cry的表达不能形成晶胞粘连现象，从而推断晶胞粘连现象可能与幕虫亚种两个基因所在的质粒有关；进一步的研究发现将cry26Aa在仅消除cry26Aa所在质粒的突变株BMB1151中表达，形成的晶体与芽胞也分别独立存在不能粘连，从而进一步推断幕虫亚种晶胞粘连现象与cry26Aa所在质粒有关。

摘要:研究苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的溶原性及其噬菌体的生物学特性，从生产菌株MZ1中分离了两株溶原性噬菌体。MZ1经诱导后产生直径约为3mm和1mm的噬斑，分离获得属长尾噬菌体科的噬菌体MZTP01和MZTP02两株；分别对6株和7株不同亚种的Bt菌株具有侵染力；免疫血清与相应噬菌体的中和反应K值分别为45和326，且两者无相关抗原性。MZTP01抵抗酸、碱、紫外线和热的能力比MZTP02强，但抵抗有机溶剂的程度比MZTP02弱。MZTP01的潜伏期为80min，裂解量为55；MZTP02的潜伏期为40min，裂解量为175。核酸结构分析均表明为线性dsDNA分子。两基因组DNA的凝胶电泳表明分子量均在9.4～23kb之间，并被HindⅢ酶切分别产生8条和9条清晰条带。该菌株被证明为二元溶原菌，可能是造成生产损失的主要原因；为防治溶原性噬菌体提供了生物学信息。

摘要:研究苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的溶原性及其噬菌体的生物学特性，从生产菌株MZ1中分离了两株溶原性噬菌体。MZ1经诱导后产生直径约为3mm和1mm的噬斑，分离获得属长尾噬菌体科的噬菌体MZTP01和MZTP02两株；分别对6株和7株不同亚种的Bt菌株具有侵染力；免疫血清与相应噬菌体的中和反应K值分别为45和326，且两者无相关抗原性。MZTP01抵抗酸、碱、紫外线和热的能力比MZTP02强，但抵抗有机溶剂的程度比MZTP02弱。MZTP01的潜伏期为80min，裂解量为55；MZTP02的潜伏期为40min，裂解量为175。核酸结构分析均表明为线性dsDNA分子。两基因组DNA的凝胶电泳表明分子量均在9.4～23kb之间，并被HindⅢ酶切分别产生8条和9条清晰条带。该菌株被证明为二元溶原菌，可能是造成生产损失的主要原因；为防治溶原性噬菌体提供了生物学信息。

摘要:以蔬菜-秸秆废物为堆肥原料,在堆肥化过程中应用Biolog方法研究不同阶段细菌群落的动态变化。聚类分析与主成分分析表明,细菌群落结构在一次发酵期间发生着剧烈变化,二次发酵期间趋于稳定。能转化Biolog板上第一、二类碳源的细菌是蔬菜-秸秆废物堆肥化进程中的主要细菌种群,且与木质纤维素的转化有关;第四、六类碳源可表征堆肥中耐受高温的细菌,其中第四类碳源转化细菌与木质纤维素的降解有关,而第六类碳源转化细菌属于易降解有机物转化细菌。

摘要:以蔬菜-秸秆废物为堆肥原料,在堆肥化过程中应用Biolog方法研究不同阶段细菌群落的动态变化。聚类分析与主成分分析表明,细菌群落结构在一次发酵期间发生着剧烈变化,二次发酵期间趋于稳定。能转化Biolog板上第一、二类碳源的细菌是蔬菜-秸秆废物堆肥化进程中的主要细菌种群,且与木质纤维素的转化有关;第四、六类碳源可表征堆肥中耐受高温的细菌,其中第四类碳源转化细菌与木质纤维素的降解有关,而第六类碳源转化细菌属于易降解有机物转化细菌。

摘要:为获得高效甲烷氧化微生物体系，从农业土壤中采样，以甲烷作为唯一碳源进行好氧选择性传代培养，得到生长性能稳定、生长优于Methylosinus trichosporium OB3b纯培养的具有甲烷单加氧酶（Methane Monooxygenase，MMO）活性甲烷氧化混合菌。利用MMO的共代谢特性，分别以苯酚和环氧丙烷作为目标对象，考察该混合菌对有机污染物的降解及用于生产有用化学物质的催化特性。结果表明，所得混合菌具有高效降解苯酚能力，对初始浓度为600mg/L的苯酚，经过11h培养，苯酚降解率可达99％。另外，以该混合菌为催化剂可以实现丙烯氧化生产环氧丙烷。通过降低磷酸盐浓度可以有效提高环氧丙烷的积累浓度，最大可至5mmol/L。此外，采用纯种分离方法结合PCR扩增、16S rRNA和MMO功能基因分析技术对混合菌群结构进行解析。结果表明，该混合菌群由Ⅱ型甲烷氧化菌及其它至少4种非甲烷氧化菌组成，它们分别属于Methylosinus trichosporium 和Acinetobacter junii、Cupriavidus metallidurans、Comamonas testosteroni和Stenotrophomonas maltophilia。采用PCR方法从混合菌及纯化菌株M. trichosporiums Y9 总DNA中都能扩增得到mmoB、mmoX和pmoA基因片段，表明该甲烷氧化菌同时具有sMMO和pMMO两种形式的MMO。通过对从甲烷氧化混合菌中分离纯化得到的甲烷氧化菌进行PCR产物测序，结果发现其与Methylosinus trichosporium的同源性为99.9％。

摘要:为获得高效甲烷氧化微生物体系，从农业土壤中采样，以甲烷作为唯一碳源进行好氧选择性传代培养，得到生长性能稳定、生长优于Methylosinus trichosporium OB3b纯培养的具有甲烷单加氧酶（Methane Monooxygenase，MMO）活性甲烷氧化混合菌。利用MMO的共代谢特性，分别以苯酚和环氧丙烷作为目标对象，考察该混合菌对有机污染物的降解及用于生产有用化学物质的催化特性。结果表明，所得混合菌具有高效降解苯酚能力，对初始浓度为600mg/L的苯酚，经过11h培养，苯酚降解率可达99％。另外，以该混合菌为催化剂可以实现丙烯氧化生产环氧丙烷。通过降低磷酸盐浓度可以有效提高环氧丙烷的积累浓度，最大可至5mmol/L。此外，采用纯种分离方法结合PCR扩增、16S rRNA和MMO功能基因分析技术对混合菌群结构进行解析。结果表明，该混合菌群由Ⅱ型甲烷氧化菌及其它至少4种非甲烷氧化菌组成，它们分别属于Methylosinus trichosporium 和Acinetobacter junii、Cupriavidus metallidurans、Comamonas testosteroni和Stenotrophomonas maltophilia。采用PCR方法从混合菌及纯化菌株M. trichosporiums Y9 总DNA中都能扩增得到mmoB、mmoX和pmoA基因片段，表明该甲烷氧化菌同时具有sMMO和pMMO两种形式的MMO。通过对从甲烷氧化混合菌中分离纯化得到的甲烷氧化菌进行PCR产物测序，结果发现其与Methylosinus trichosporium的同源性为99.9％。

摘要:

摘要:从海南、广西与广东三省的红树林区采集了181个样品,不进行微生物分离而直接作发酵剂接种到发酵培养基进行发酵,取发酵上清液进行抗细菌、抗真菌与肿瘤细胞毒活性的测定。同时对样品进行可培养微生物的分离与生物活性测定。结果显示:不同样品类型的生物活性差异较大。在15个具有强抗活性的样品中,有5个样品分离到的单株菌均无任何生物活性,说明这5个样品的生物活性可能是由微生物的群体作用产生的,也可能是某种没有培养出的微生物产生的。初步表明了探索微生物混合培养获得生物活性代谢产物的可能性。

摘要:从海南、广西与广东三省的红树林区采集了181个样品,不进行微生物分离而直接作发酵剂接种到发酵培养基进行发酵,取发酵上清液进行抗细菌、抗真菌与肿瘤细胞毒活性的测定。同时对样品进行可培养微生物的分离与生物活性测定。结果显示:不同样品类型的生物活性差异较大。在15个具有强抗活性的样品中,有5个样品分离到的单株菌均无任何生物活性,说明这5个样品的生物活性可能是由微生物的群体作用产生的,也可能是某种没有培养出的微生物产生的。初步表明了探索微生物混合培养获得生物活性代谢产物的可能性。

摘要:

摘要:通过在Magainin1-12(GIGKFLHSAKKF)的N端添加碱性氨基酸片段Hexapeptide(RRWQWR)以增强其对细胞膜的吸附能力来提高Magainin1-12的抗菌活性。利用Hexapeptide和Magainin1-12的基因序列,结合酵母偏爱密码子设计出新的融合基因Hex-Mag,通过重叠区扩增基因拼接法(Gene splicing by overlap extension,gene SOEing)利用PCR扩增出基因片段,再将融合基因进行酶切并纯化后导入穿梭质粒pPIC9中,构建受乙醇氧化酶1基因(AOX1)的启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒,转化GS115毕赤酵母宿主菌,经表型筛选,阳性克隆用甲醇诱导表达。表达出的融合肽Hex-Mag分子量约2.3kDa,其耐热性强,在100℃条件下,其活性可维持3h以上。琼脂糖孔穴扩散法检测显示Hex-Mag对多种革兰氏阴性菌和阳性菌具有抑制活性,与Magainin1-12相比,其活性有明显增强,N端正电荷增加的预期效应得到初步体现。

摘要:通过在Magainin1-12(GIGKFLHSAKKF)的N端添加碱性氨基酸片段Hexapeptide(RRWQWR)以增强其对细胞膜的吸附能力来提高Magainin1-12的抗菌活性。利用Hexapeptide和Magainin1-12的基因序列,结合酵母偏爱密码子设计出新的融合基因Hex-Mag,通过重叠区扩增基因拼接法(Gene splicing by overlap extension,gene SOEing)利用PCR扩增出基因片段,再将融合基因进行酶切并纯化后导入穿梭质粒pPIC9中,构建受乙醇氧化酶1基因(AOX1)的启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒,转化GS115毕赤酵母宿主菌,经表型筛选,阳性克隆用甲醇诱导表达。表达出的融合肽Hex-Mag分子量约2.3kDa,其耐热性强,在100℃条件下,其活性可维持3h以上。琼脂糖孔穴扩散法检测显示Hex-Mag对多种革兰氏阴性菌和阳性菌具有抑制活性,与Magainin1-12相比,其活性有明显增强,N端正电荷增加的预期效应得到初步体现。

摘要:用5株传染性法氏囊病病毒（IBDV）单克隆抗体（mAb）从噬菌体随机肽库中得到了5个含有不同IBDV抗原表位的模拟肽序列。在此基础上，将5个抗原表位用GGGS四肽连接构建多表位基因5epis。将该基因合成、克隆后，构建原核表达质粒pET-5epis，在大肠杆菌中表达重组多表位蛋白r5EPIS，经SDS-PAGE分析，r5EPIS占菌体总蛋白的15%、分子量10kDa。用IBDV单克隆抗体和多克隆抗体对r5EPIS进行免疫印迹对比分析，结果表明，r5EPIS具有IBDV特异性和免疫反应性。将r5EPIS经皮下注射免疫兔，400μg/只/次，免疫2次，间隔7d，用IBDV间接ELISA检测血清抗体，第一次免疫7d后抗体效价为1∶4000，第二次免疫14d后抗体效价升高到1∶256000，说明r5EPIS可诱导机体产生IBDV特异性抗体。用r5EPIS加免疫佐剂经肌肉注射免疫鸡，50μg/只/次，免疫2次后，血清抗体效价可达到1∶12800，用200个ELD50IBDV超强毒株GX8/99攻击实验鸡，r5EPIS免疫组全部存活，而单用佐剂对照组的死亡率为86.7%（13/15），证明r5EPIS可诱导机体产生抗IBDV感染的保护性免疫应答，预示构建的5epis可作为IBD多表位疫苗研究的候选基因。

摘要:用5株传染性法氏囊病病毒（IBDV）单克隆抗体（mAb）从噬菌体随机肽库中得到了5个含有不同IBDV抗原表位的模拟肽序列。在此基础上，将5个抗原表位用GGGS四肽连接构建多表位基因5epis。将该基因合成、克隆后，构建原核表达质粒pET-5epis，在大肠杆菌中表达重组多表位蛋白r5EPIS，经SDS-PAGE分析，r5EPIS占菌体总蛋白的15%、分子量10kDa。用IBDV单克隆抗体和多克隆抗体对r5EPIS进行免疫印迹对比分析，结果表明，r5EPIS具有IBDV特异性和免疫反应性。将r5EPIS经皮下注射免疫兔，400μg/只/次，免疫2次，间隔7d，用IBDV间接ELISA检测血清抗体，第一次免疫7d后抗体效价为1∶4000，第二次免疫14d后抗体效价升高到1∶256000，说明r5EPIS可诱导机体产生IBDV特异性抗体。用r5EPIS加免疫佐剂经肌肉注射免疫鸡，50μg/只/次，免疫2次后，血清抗体效价可达到1∶12800，用200个ELD50IBDV超强毒株GX8/99攻击实验鸡，r5EPIS免疫组全部存活，而单用佐剂对照组的死亡率为86.7%（13/15），证明r5EPIS可诱导机体产生抗IBDV感染的保护性免疫应答，预示构建的5epis可作为IBD多表位疫苗研究的候选基因。

摘要:利用PCR技术扩增出PPVNS1基因抗原区。将目的基因与原核表达载体pGEX-4T-1进行连接并转化,重组质粒经鉴定并测序。测序结果表明,目的基因插入的位置、大小和读码框均正确,通过试验摸索并确定了表达NS1基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为1.0mmol/L,诱导时间为10h,温度为37℃,其表达量占全菌蛋白的29.8%。表达产物经SDS-PAGE分析,得到分子量约为52kDa的重组蛋白且以包涵体形式存在。重组蛋白经Westernblot检测,结果证明重组蛋白可被PPV阳性血清识别。用8mol/L尿素变性溶解包涵体,再用稀释方法和还原型、氧化型谷胱甘肽系统相结合的方法对重组蛋白进行复性。ELISA检测表明,复性后的重组蛋白有良好的生物活性。

摘要:利用PCR技术扩增出PPVNS1基因抗原区。将目的基因与原核表达载体pGEX-4T-1进行连接并转化,重组质粒经鉴定并测序。测序结果表明,目的基因插入的位置、大小和读码框均正确,通过试验摸索并确定了表达NS1基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为1.0mmol/L,诱导时间为10h,温度为37℃,其表达量占全菌蛋白的29.8%。表达产物经SDS-PAGE分析,得到分子量约为52kDa的重组蛋白且以包涵体形式存在。重组蛋白经Westernblot检测,结果证明重组蛋白可被PPV阳性血清识别。用8mol/L尿素变性溶解包涵体,再用稀释方法和还原型、氧化型谷胱甘肽系统相结合的方法对重组蛋白进行复性。ELISA检测表明,复性后的重组蛋白有良好的生物活性。

摘要:根据GenBank公开序列自行设计一对引物,通过RT-PCR扩增出小鼠肝炎病毒的全长S1基因,并将其插入真核表达质粒pVAX1中,构建出重组真核表达质粒pVAX1-S1。将重组质粒转染COS-7细胞,采用间接免疫荧光检测出S1蛋白的体外表达。将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中,构建出运送DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207(pVAX1-S1)。分别以5×10⁸CFU、1×10⁹CFU、2×10⁹CFU剂量的重组菌口服接种6周龄BALB/c小鼠,试验结果表明,重组菌对小鼠具有良好的安全性。以1×10⁹CFU剂量的重组菌口服免疫小鼠,抗体检测结果显示,在二免后两周和三免后两周,重组菌免疫组的血清抗体水平与SL7207(pVAX1)空载体免疫组间分别存在显著性差异(P<0.05)和极显著性差异(P<0.01)。在三免后两周重组菌免疫组出现了较高水平的肠黏膜抗体。

摘要:根据GenBank公开序列自行设计一对引物,通过RT-PCR扩增出小鼠肝炎病毒的全长S1基因,并将其插入真核表达质粒pVAX1中,构建出重组真核表达质粒pVAX1-S1。将重组质粒转染COS-7细胞,采用间接免疫荧光检测出S1蛋白的体外表达。将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中,构建出运送DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207(pVAX1-S1)。分别以5×10⁸CFU、1×10⁹CFU、2×10⁹CFU剂量的重组菌口服接种6周龄BALB/c小鼠,试验结果表明,重组菌对小鼠具有良好的安全性。以1×10⁹CFU剂量的重组菌口服免疫小鼠,抗体检测结果显示,在二免后两周和三免后两周,重组菌免疫组的血清抗体水平与SL7207(pVAX1)空载体免疫组间分别存在显著性差异(P<0.05)和极显著性差异(P<0.01)。在三免后两周重组菌免疫组出现了较高水平的肠黏膜抗体。

摘要:

摘要:通过特异引物扩增环境中氨氧化细菌16S rDNAV2保守区域,将该片段克隆到T-easy载体上,PCR产物经测序和定量PCR扩增体系鉴定,证实PCR扩增产物为氨氧化细菌16S rDNA保守序列,以含该序列的重组质粒作为定量PCR监测氨氧化细菌数量的DNA标准品。用荧光定量PCR技术比较了五氯酚(PCP)对好氧颗粒污泥和活性污泥中氨氧化细菌数量的影响。结果表明,不加PCP的反应器中,好氧颗粒污泥和活性污泥中氨氧化细菌的数量分别为4.28×10⁷±5.44×10⁶cells/(g干污泥)和2.51×10⁹±8.61×10⁸cells/(g干污泥)。随着PCP浓度的增加(0~50mg/L),PCP对氨氧化细菌数量的影响不大(P>0.05),而且,污泥中氨氧化细菌的数量与氨氮的去除率无直接的正相关关系(P>0.05),PCP主要是抑制氨氧化细菌的代谢活性导致污泥氨氮去除效率降低。

摘要:通过特异引物扩增环境中氨氧化细菌16S rDNAV2保守区域,将该片段克隆到T-easy载体上,PCR产物经测序和定量PCR扩增体系鉴定,证实PCR扩增产物为氨氧化细菌16S rDNA保守序列,以含该序列的重组质粒作为定量PCR监测氨氧化细菌数量的DNA标准品。用荧光定量PCR技术比较了五氯酚(PCP)对好氧颗粒污泥和活性污泥中氨氧化细菌数量的影响。结果表明,不加PCP的反应器中,好氧颗粒污泥和活性污泥中氨氧化细菌的数量分别为4.28×10⁷±5.44×10⁶cells/(g干污泥)和2.51×10⁹±8.61×10⁸cells/(g干污泥)。随着PCP浓度的增加(0~50mg/L),PCP对氨氧化细菌数量的影响不大(P>0.05),而且,污泥中氨氧化细菌的数量与氨氮的去除率无直接的正相关关系(P>0.05),PCP主要是抑制氨氧化细菌的代谢活性导致污泥氨氮去除效率降低。

摘要:将梅山猪γ干扰素基因定向插入逆转录病毒载体pLXSN(neor),构建逆转录病毒重组质粒,利用脂质体介导法将重组质粒转染逆转录病毒包装细胞系PA317,转染细胞经含G418(400μg/mL)培养基筛选一周后获得稳定产毒的PA317细胞系。从细胞培养上清中提取RNA,进行RT-PCR检测,扩增到目的片段;将上清感染猪肾细胞(PK-15),经含G418(400μg/mL、600μg/mL和800μg/mL)的DMEM筛选一周,间接免疫荧光表明表达的猪γ干扰素主要锚定于细胞膜。收取PK-15细胞上清,在牛肾细胞(MDBK)上进行干扰素抗病毒活性检测,结果显示重组病毒表达的猪γ干扰素抗水泡性口炎病毒(VSV)的活性为1200IU/10⁶cells.48h。以表达的干扰素处理PK-15细胞后,经细胞病变抑制法测定,重组猪γ干扰素可以抵抗口蹄疫病毒(FMDV)感染。试验结果表明猪γ干扰素基因已成功插入逆转录病毒基因组并在PK-15细胞中表达,表达的重组猪γ干扰素具有较强的抗病毒生物活性。

摘要:将梅山猪γ干扰素基因定向插入逆转录病毒载体pLXSN(neor),构建逆转录病毒重组质粒,利用脂质体介导法将重组质粒转染逆转录病毒包装细胞系PA317,转染细胞经含G418(400μg/mL)培养基筛选一周后获得稳定产毒的PA317细胞系。从细胞培养上清中提取RNA,进行RT-PCR检测,扩增到目的片段;将上清感染猪肾细胞(PK-15),经含G418(400μg/mL、600μg/mL和800μg/mL)的DMEM筛选一周,间接免疫荧光表明表达的猪γ干扰素主要锚定于细胞膜。收取PK-15细胞上清,在牛肾细胞(MDBK)上进行干扰素抗病毒活性检测,结果显示重组病毒表达的猪γ干扰素抗水泡性口炎病毒(VSV)的活性为1200IU/10⁶cells.48h。以表达的干扰素处理PK-15细胞后,经细胞病变抑制法测定,重组猪γ干扰素可以抵抗口蹄疫病毒(FMDV)感染。试验结果表明猪γ干扰素基因已成功插入逆转录病毒基因组并在PK-15细胞中表达,表达的重组猪γ干扰素具有较强的抗病毒生物活性。

摘要:采用高效离子交换色谱和激光光散射仪对不同生长阶段的青枯菌进行色谱表征。青枯菌经过色谱分离得到3个特征峰。通过对延滞期、对数生长期和稳定期青枯菌细胞浓度、发酵液pH值、细胞表面黏附的胞外酸性多糖(EPSⅠ)含量与青枯菌色谱行为的关系研究,发现在8h时,青枯菌运动能力强,细胞表面EPSⅠ少,吸附力弱,绝大多数菌体直接随流动相流出形成峰1;随着培养时间延长,细胞表面黏附的EPSⅠ量增多,与树脂吸附力增强,保留时间延长。因此分析3个色谱峰的形成与青枯菌的运动性、以及细胞表面EPSⅠ与阴离子交换树脂的吸附作用有关。并通过比较3个色谱峰青枯菌细胞表面EPSⅠ含量的差异和观察青枯菌经过4%甲醛固定处理后色谱行为的变化加以进一步验证。高效离子交换色谱为细菌完整细胞的研究提供了一种新的分析方法。

摘要:采用高效离子交换色谱和激光光散射仪对不同生长阶段的青枯菌进行色谱表征。青枯菌经过色谱分离得到3个特征峰。通过对延滞期、对数生长期和稳定期青枯菌细胞浓度、发酵液pH值、细胞表面黏附的胞外酸性多糖(EPSⅠ)含量与青枯菌色谱行为的关系研究,发现在8h时,青枯菌运动能力强,细胞表面EPSⅠ少,吸附力弱,绝大多数菌体直接随流动相流出形成峰1;随着培养时间延长,细胞表面黏附的EPSⅠ量增多,与树脂吸附力增强,保留时间延长。因此分析3个色谱峰的形成与青枯菌的运动性、以及细胞表面EPSⅠ与阴离子交换树脂的吸附作用有关。并通过比较3个色谱峰青枯菌细胞表面EPSⅠ含量的差异和观察青枯菌经过4%甲醛固定处理后色谱行为的变化加以进一步验证。高效离子交换色谱为细菌完整细胞的研究提供了一种新的分析方法。

摘要:甲烷氧化细菌中的关键酶系甲烷单加氧酶是一个含双核铁的多组份氧化酶,常温、常压下能够催化甲烷转化为甲醇。对甲烷氧化细菌Methylomonas sp.GYJ3中溶解性甲烷单加氧酶基因和16SrDNA进行了测序与分析。利用已知相关基因数据库信息,设计了PCR引物和测序引物,获得了满意的测序结果。全长的溶解性甲烷单加氧酶基因为5690bp,部分16S rDNA的序列长度为1280bp。与已发表的甲烷氧化细菌中甲烷单加氧酶进行了比较,结果表明MMOX组份中氨基酸序列的同一性为78%到99%,基因序列的同一性为71%到97%,6个组份中orfY片段的同一性相对较低。MMOX氨基酸序列的多序列联配表明,MMOX序列具有高度保守性,特别是在双核铁中心区域。16S rDNA进化分析显示Methylomonas sp.GYJ3与γ蛋白细菌是相关联的,基于MMOX氨基酸序列的进化分析证明,与Methylomonas sp.GYJ3最近似的菌株是Ⅰ型甲烷氧化细菌Methylomonas sp.KSWⅢ。综合分析表明,菌株GYJ3属于Ⅰ型甲烷氧化细菌Methylomonas sp.属。这个结果为Ⅰ型甲烷氧化细菌也能表达溶解性甲烷单加氧酶提供了新的证据。羟基化酶的理论等电点是6.28，理论分子量为248874.41Da.

摘要:甲烷氧化细菌中的关键酶系甲烷单加氧酶是一个含双核铁的多组份氧化酶,常温、常压下能够催化甲烷转化为甲醇。对甲烷氧化细菌Methylomonas sp.GYJ3中溶解性甲烷单加氧酶基因和16SrDNA进行了测序与分析。利用已知相关基因数据库信息,设计了PCR引物和测序引物,获得了满意的测序结果。全长的溶解性甲烷单加氧酶基因为5690bp,部分16S rDNA的序列长度为1280bp。与已发表的甲烷氧化细菌中甲烷单加氧酶进行了比较,结果表明MMOX组份中氨基酸序列的同一性为78%到99%,基因序列的同一性为71%到97%,6个组份中orfY片段的同一性相对较低。MMOX氨基酸序列的多序列联配表明,MMOX序列具有高度保守性,特别是在双核铁中心区域。16S rDNA进化分析显示Methylomonas sp.GYJ3与γ蛋白细菌是相关联的,基于MMOX氨基酸序列的进化分析证明,与Methylomonas sp.GYJ3最近似的菌株是Ⅰ型甲烷氧化细菌Methylomonas sp.KSWⅢ。综合分析表明,菌株GYJ3属于Ⅰ型甲烷氧化细菌Methylomonas sp.属。这个结果为Ⅰ型甲烷氧化细菌也能表达溶解性甲烷单加氧酶提供了新的证据。羟基化酶的理论等电点是6.28，理论分子量为248874.41Da.

摘要:从丝状真菌中筛选到一株产α-半乳糖苷酶的菌株F63,对该菌株进行了形态观察和18SrDNA序列分析,该菌株属于青霉属。采用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和分子筛层析等方法分离纯化了该菌株的一种α-半乳糖苷酶。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳,此酶蛋白的分子量约为82kDa。该α-半乳糖苷酶反应的最适pH为5.0,最适温度为45℃。此α-半乳糖苷酶的热稳定性在40℃以下,pH稳定性为pH5.0-6.0。与已报道的α-半乳糖苷酶的活性都受到Ag⁺的强烈抑制不同的是,该α-半乳糖苷酶受Ag⁺的抑制作用不显著。以pNPG为底物的Km值为1.4mmol/L和V_max=1.556mmol/L.min^-1.mg^-1。该酶可以有效降解蜜二糖、棉子糖和水苏糖,但不能降解末端含α-半乳糖苷键的多糖。通过利用质谱技术对纯化的α-半乳糖苷酶进行鉴定以及内肽的N端测序证明该蛋白为一种新的α-半乳糖苷酶。

摘要:从丝状真菌中筛选到一株产α-半乳糖苷酶的菌株F63,对该菌株进行了形态观察和18SrDNA序列分析,该菌株属于青霉属。采用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和分子筛层析等方法分离纯化了该菌株的一种α-半乳糖苷酶。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳,此酶蛋白的分子量约为82kDa。该α-半乳糖苷酶反应的最适pH为5.0,最适温度为45℃。此α-半乳糖苷酶的热稳定性在40℃以下,pH稳定性为pH5.0-6.0。与已报道的α-半乳糖苷酶的活性都受到Ag⁺的强烈抑制不同的是,该α-半乳糖苷酶受Ag⁺的抑制作用不显著。以pNPG为底物的Km值为1.4mmol/L和V_max=1.556mmol/L.min^-1.mg^-1。该酶可以有效降解蜜二糖、棉子糖和水苏糖,但不能降解末端含α-半乳糖苷键的多糖。通过利用质谱技术对纯化的α-半乳糖苷酶进行鉴定以及内肽的N端测序证明该蛋白为一种新的α-半乳糖苷酶。

摘要:采用bacitracin-Sepharose 4B亲和层析的方法得到凝胶电泳均一的来自极端嗜盐古生菌(Natrinema sp.)R6-5的胞外嗜盐蛋白酶。经SDS-PAGE分析该酶亚基分子量为62kDa。PMSF对它的活性完全抑制,表明它是一种丝氨酸蛋白酶,该酶反应的最适NaCl浓度为3mol/L,最适温度为45℃,最适pH值为8.0。在高盐条件下能维持高活性并十分稳定,具有重要的潜在应用价值。

摘要:采用bacitracin-Sepharose 4B亲和层析的方法得到凝胶电泳均一的来自极端嗜盐古生菌(Natrinema sp.)R6-5的胞外嗜盐蛋白酶。经SDS-PAGE分析该酶亚基分子量为62kDa。PMSF对它的活性完全抑制,表明它是一种丝氨酸蛋白酶,该酶反应的最适NaCl浓度为3mol/L,最适温度为45℃,最适pH值为8.0。在高盐条件下能维持高活性并十分稳定,具有重要的潜在应用价值。

摘要:为了探讨甲醛致真核生物与原核生物DNA-蛋白质交联(DNA-protein crosslinks,DPC)的作用,以毕赤酵母(Pichia pastoris)和大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α为材料,采用KCl-SDS沉淀法检测液态甲醛染毒后酵母菌与大肠杆菌中DPC含量。结果表明,低浓度(25μmol/L)甲醛不能引起酵母菌和大肠杆菌的DPC(P>0.05),而较高浓度(125和625μmol/L)甲醛可引起酵母菌和大肠杆菌明显的DPC(P<0.05);另外,酵母菌的DPC系数是大肠杆菌的DPC系数的10倍左右。这表明甲醛致真核细胞和原核细胞的DPC作用具有剂量效应关系,而且真核细胞的DPC系数比原核细胞的DPC系数更高。

摘要:为了探讨甲醛致真核生物与原核生物DNA-蛋白质交联(DNA-protein crosslinks,DPC)的作用,以毕赤酵母(Pichia pastoris)和大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α为材料,采用KCl-SDS沉淀法检测液态甲醛染毒后酵母菌与大肠杆菌中DPC含量。结果表明,低浓度(25μmol/L)甲醛不能引起酵母菌和大肠杆菌的DPC(P>0.05),而较高浓度(125和625μmol/L)甲醛可引起酵母菌和大肠杆菌明显的DPC(P<0.05);另外,酵母菌的DPC系数是大肠杆菌的DPC系数的10倍左右。这表明甲醛致真核细胞和原核细胞的DPC作用具有剂量效应关系,而且真核细胞的DPC系数比原核细胞的DPC系数更高。

摘要:酮糖单磷酸途径最初在甲基营养菌中发现,现在被认为是在细菌中广泛存在的和甲醛同化作用及脱毒相关的一条途径,该途径的关键酶是6-磷酸己酮糖合成酶和6-磷酸己酮糖异构酶。文章将介绍来源于各种细菌的核酮糖单磷酸途径的生理作用及其两个关键酶基因的组织结构、表达调控机制与应用前景。

摘要:酮糖单磷酸途径最初在甲基营养菌中发现,现在被认为是在细菌中广泛存在的和甲醛同化作用及脱毒相关的一条途径,该途径的关键酶是6-磷酸己酮糖合成酶和6-磷酸己酮糖异构酶。文章将介绍来源于各种细菌的核酮糖单磷酸途径的生理作用及其两个关键酶基因的组织结构、表达调控机制与应用前景。

摘要:新型产电微生物(Electricigens)的发现,使得微生物燃料电池概念的内涵发生了根本性的变化,展现了广阔的应用前景。这种微生物能够以电极作为唯一电子受体,把氧化有机物获得的电子通过电子传递链传递到电极产生电流,同时微生物从中获得能量而生长。这种代谢被认为是一种新型微生物呼吸方式。以这种新型微生物呼吸方式为基础的微生物燃料电池可以同时进行废水处理和生物发电,有望可以把废水处理发展成一个有利可图的产业,是MFC最有发展前景的方向。

摘要:新型产电微生物(Electricigens)的发现,使得微生物燃料电池概念的内涵发生了根本性的变化,展现了广阔的应用前景。这种微生物能够以电极作为唯一电子受体,把氧化有机物获得的电子通过电子传递链传递到电极产生电流,同时微生物从中获得能量而生长。这种代谢被认为是一种新型微生物呼吸方式。以这种新型微生物呼吸方式为基础的微生物燃料电池可以同时进行废水处理和生物发电,有望可以把废水处理发展成一个有利可图的产业,是MFC最有发展前景的方向。

摘要:对国家自然科学基金2000~2006年度资助微生物学各分支学科面上项目的数量和经费情况进行了总结分析,试图详细地展示我国微生物学各分支学科基础研究概况,指明了在未来一段时间里国家自然科学基金资助微生物学学科的重点研究方向。

摘要:对国家自然科学基金2000~2006年度资助微生物学各分支学科面上项目的数量和经费情况进行了总结分析,试图详细地展示我国微生物学各分支学科基础研究概况,指明了在未来一段时间里国家自然科学基金资助微生物学学科的重点研究方向。