摘要:

摘要:利用位于染色体不同位点的多个基因序列进行分析是原核生物分类与系统发育研究的一个热点。本文采用atpD和glnⅡ两个持家基因的部分序列对9株分离自我国合欢、金合欢和银合欢的根瘤菌进行系统发育研究, 并与以16S rDNA基因序列构建的系统发育树进行比较。结果表明三者在属水平上基本一致, CCBAU43060、CCBAU61139位于Rhizobium-Agrobacterium系统发育分支内; CCBAU51471、CCBAU35220、CCBAU51276和CCBAU61158属于Mesorhizobium, CCBAU35234、CCBAU61178和CCBAU35085位于Bradyrhizobium系统发育分支; 在属内种间个别菌株(CCBAU61158、CCBAU43060、CCBAU61178)的系统发育地位存在差别, 表明属内种间存在较广泛的基因交流。因此利用16S rDNA确定属水平的分类地位比较可靠, 但利用系统发育的方法研究属内种间亲缘关系应采用多个功能保守的持家基因同时进行分析才能得出比较可靠的 结论。

摘要:采用3对古菌特异性引物扩增瘤胃古菌16S rRNA基因分别建立的克隆库来研究晋南牛瘤胃古菌的多样性。每个克隆库随机挑选100个克隆。引物Arch f364/1386建立的克隆库中, 克隆分为四类, 分别与四种甲烷短杆菌1Y (61%)、SM9 (23%)、NT7 (14%)和AK-87(2%)相似。引物1Af/1100Ar建立的克隆库中, 克隆分为两类, 分别与Methanobacterium aarhusense(72%) 和Methanosphaera stadtmanae DSM 3091 (28%)相似。引物Met86F/Met1340R建立的克隆库反映的古菌种类较为全面, 除以上四种甲烷短杆菌(所占比例分别为47%、26%、11%和3%)外, 还有Methanomicrobium mobile(2%)、以及类似Methanobacterium aarhusense(1%)和Methanosphaera stadtmanae(3%)的序列, 还有7%的未匹配序列。系统进化分析表明, 这些克隆属于Methanobrevibacter、Methanobacterium、Methanosphaera、Methanomicrobium, 和未知广域古菌等5个分支。有25类属于广域古菌的未知序列, 提示瘤胃中存在大量的未知产甲烷菌

摘要:以pBeloBAC11为载体,成功构建了苏云金芽胞杆菌YBT-1765的基因组人工染色体(BAC)文库和质粒BAC文库。根据已克隆的包含复制子ori165在内的3.6kb片段中编码复制蛋白Rep165的核苷酸序列设计探针, 通过染色体步移方式, 对质粒文库和基因组文库进行筛选, 得到13个覆盖YBT-1765菌株中质粒pBMB165不同区域的克隆子。通过HindⅢ和BamHⅠ酶切分析, 建立了质粒pBMB165的物理图谱和线状重叠连锁图, 并测算出该质粒的大小为82kb。根据部分核苷酸序列初步统计了pBMB165上转座因子的存在机率。YBT-1765菌株基因组文库的构建和物理图谱的绘制为克隆苏云金芽胞杆菌大质粒提供了一套可行的方案, 成功解决了大质粒难克隆的问题。

摘要:葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)是链霉菌磷酸戊糖途径中第一个酶 (“看家”酶), 也是形成NADPH的关键酶, 由zwf1和zwf2基因编码。以温敏型质粒pKC1139为基础构建了用于阻断龟裂链霉菌zwf2的重组质粒pKC1139-zwf2′, 通过大肠杆菌GM2929去甲基化pKC1139-zwf2′后电转至原始龟裂链霉菌M4018感受态细胞, 筛选得到转化子。转化子进一步通过PCR鉴定和点杂交印迹分析鉴定, 证明是zwf2基因阻断的阳性突变子命名为M4018-Δzwf2。以原始菌株为对照, 突变子摇瓶发酵结果表明：突变子的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶酶活是原始菌的50%左右, 但土霉素生物合成水平则提高了27%; 在细胞生长方面, 二者均在第4d进入生长稳定期而开始大量合成土霉素, 发酵结束时细胞菌体浓度基本相同, 但突变子的单位菌丝体土霉素生物合成能力则提高了31%。因此, zwf2的阻断有利于土霉素的生物合成, 而对细胞生长没有明显影响。

摘要:原核生物细胞能量和物质代谢的途径是一个很复杂的网络, 改变代谢途径中的基因会对能量和物质流产生怎样的影响, 仍然不是很清楚。以往的文献和研究已经将大肠杆菌的腺嘌呤核苷酸补救合成途径研究的很透彻。使用HPLC对删除了add基因的大肠杆菌细胞内腺苷类核苷酸分析表明, 在腺嘌呤核苷酸补救途径中单一基因的途径操作不能有效改变腺嘌呤类核苷酸的代谢流向。实验中通过删除大肠杆菌JM83株中的add基因(编码腺苷脱氨酶[EC:3.5.4.4][1, 2]), deoD基因(编码嘌呤核苷磷酸酶[EC:2.4.2.1][3, 4]), amn基因(编码AMP核苷酶 [EC:3.2.2.4][5])并引入外源ado1基因(来自酵母编码腺苷激酶[EC:2.7.1.20][6,7,8]), 构建了菌株J991+ (add-, deoD-, amn-, ado1+, JM83), 将其在含腺苷的LB培养基培养, 使用HPLC分析其胞内腺苷类能量物质发现, ATP, ADP, AMP胞内含量都有所增加, 分别都比对照JM83菌株提高一倍左右, 大大加强了腺苷转化AMP的代谢流量, 实现了改变物质代谢流向并使ATP积累的目的。该菌种实现了高产ATP代谢通路的构建, 为下游生物工程发酵提供了较野生菌更高效的菌种, 有望通过发酵工程优化培养, 大幅提高ATP产量。同时, “尝试改变AMP的浓度而非直接针对ATP调节代谢途径, 达到ATP积累的目”这一思路为同类研究提供参考。最后也表明在腺嘌呤核苷酸补救代谢途径中, 为达到物质代谢流改变的目的, 多基因联合操作较之单基因敲除更为有效。

摘要:从土壤中筛选得到1株可转化美伐他汀(compactin)生产普伐他汀(pravastatin)的放线菌Z314, 根据形态观察、培养特征、生理生化鉴定以及16S rRNA序列分析, 初步判定该菌株为链霉菌属中的黄质产色链霉菌(Streptomyces xanthochromogenes)。经发酵条件优化, 该菌株转化美伐他汀生产普伐他汀的产量可达1580mg/L, 转化率为49.45%。发酵液经中空纤维素过滤、大孔树脂吸附和HPLC纯化, 普伐他汀的回收率为45.06%, 纯度为99.02%, 为进一步产业化开发奠定了基础。

摘要:从土壤中筛选获得一株具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶产生菌, 综合其形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列同源分析结果, 将其鉴定为成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)B1。通过单因子试验和正交试验, 对B1菌株产转糖基β-半乳糖苷酶的培养条件进行了优化。最佳培养基主要组份为：乳糖1%, 酵母粉1%, 蛋白胨0.5%；发酵条件为：初始pH7.5, 发酵温度25℃, 发酵时间26 h。在该培养条件下产酶量为9.7U/mL。利用薄层层析技术研究了pH、温度、底物浓度和反应时间对该菌株全细胞以乳糖为底物生成低聚半乳糖的影响, 确定最适反应条件为：pH7.5缓冲液配制的30%乳糖溶液; 50℃反应12h。最优化反应的转糖基产物经HPLC、TLC和MS分析, 确定低聚半乳糖产量为40.7%, 组分为转移二糖、三糖和四糖。

摘要:通过PCR的方法从六六六降解菌Sphingomonas sp. BHC-A 扩增出完整的脱氯化氢酶基因linA。将其克隆到含有mini-Tn5 的自杀性质粒pUT4K上, 构建成质粒pUT/mini-Tn5-linA. 通过三亲杂交, 在辅助质粒RK600的帮助下, 将pUT/mini-Tn5-linA 转移到一株高效降解多菌灵菌株Rhodococcus sp. DJL-6 中。利用mini-Tn5的转座作用将linA基因整合到DJL-6的染色体DNA上, 得到工程菌株DJL-6A。该工程菌具有同时降解多菌灵和六六六的功能, 且对于初始浓度为0.05 μg/mL 和 5 μg/mL 的六六六的降解活性与亲本菌株BHC-A相当。在不加任何选择压力的条件下工程菌株进行连续传代, 结果证明linA基因可以持续稳定的存在于宿主的染色体DNA上。

摘要:从湖南、湖北、云南等地磷矿开采场的土壤样品中筛选到一株溶磷能力较强的菌株P21, 结合生理生化指标和16S rDNA序列分析鉴定其属于草生欧文氏菌菠萝变种(Erwinia herbicola var.ananas)。该菌能溶解磷酸三钙、羟基磷灰石、磷酸铁、磷酸锌, 其中对磷酸三钙和羟基磷灰石的每升液体培养基溶解量分别高达1206.20mg、529.67mg。溶磷菌草生欧文氏菌菠萝变种P21对产地不同的8种磷矿石溶解能力不同, 对云南晋宁和昆阳、四川雅安、贵州锦屏等地磷矿石有较强的溶解能力, 每升液体培养基溶磷量分别为96.64mg、78.46mg、67.07mg、65.24mg, 对其它产地的磷矿石溶解能力较差。实验表明, 培养液的pH下降与溶磷菌P21的溶磷量无直接关系。

摘要:耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans R1)有着极强的辐射抗性。研究其抗辐射的机理对于处理放射性废料有着潜在的应用价值。在耐辐射球菌的基因组中, 许多序列的功能未知。其中DRB0099尤为引人注意。将DRB0099缺失突变构建该基因的突变株。对野生型和突变体进行比较后发现, 在正常生长条件下的前期阶段(0~16 h), 突变体生长速度比野生型慢。16 h 以后, 野生型逐渐进入稳定生长期。这时, 突变株的生长速度高于野生型。但是, 野生型的浓度一直高于突变株。表明在DRB0099被删除后, 耐辐射球菌的生长可能受到了阻滞。在紫外线照射的条件下, 尽管野生型随着照射剂量的增加, 存活率越来越低, 但是要比突变体高许多。野生型具有比突变体更强的修复DNA双链断裂的能力。DRB0099可能直接参与了对DNA的修复。突变体对H2O2的敏感程度高于野生型, 表明野生型耐辐射球菌在对抗活性氧保护其蛋白质、DNA或者DNA修复方面具有比突变体更强的功能。在低浓度H2O2处理条件下, 尽管野生型和突变体的存活率都出现下降趋势, 但二者的差值并不大。随着H2O2剂量的增加, 二者的差值越来越大。表明随着活性氧浓度的增加, 蛋白质和DNA损伤的数量增加, 失去DRB0099基因功能的突变体比野生型更容易受到损伤。在紫外线照射处理或者H2O2处理条件下, DRB0099能够保护蛋白质和DNA。

摘要:Wolbachia是广泛分布于节肢动物生殖组织中的细胞质遗传的一类共生菌, 可以引起宿主生殖行为的改变。烟粉虱是重要的农业害虫, 已有的研究表明烟粉虱中存在Wolbachia的感染, 但所检测到的感染率不高, 并且迄今在烟粉虱中所检出的Wolbachia均属于B组群。该研究从我国河北、新疆、北京、山东、浙江、广西、海南、广州和福建采集到18个烟粉虱地理种群, 首先基于ITS1 rDNA克隆测序鉴定了烟粉虱的生物型, 然后采用自行设计的Wolbachia 16S rDNA及wsp基因的专用引物对所采集到的烟粉虱种群进行了分子检测。结果表明几乎所有的烟粉虱自然种群中都存在Wolbachia感染, 同时还发现B/Q生物型烟粉虱中主要感染A组群Wolbachia, 而非B/Q生物型烟粉虱中存在大量的超感染现象。该研究显示烟粉虱自然种群中Wolbachia的感染率比预想的要高得多, 而分子检测方法的灵敏度可能是影响Wolbachia感染率研究的关键因素之一。

摘要:根据Sanger研究所公布的猪链球菌2型(SS2)P1/7株的自溶素序列，设计检测引物，取SS2我国2次流行株、其它临床分离株和参考株，及猪链球菌1型、1/2型、7型和9型，共33株，分别以其DNA为模板，PCR扩增。结果表明，SS2除无毒株T15阴性外，其他临床分离株27株(含人源2株)均阳性；其它猪链球菌为，SS7阳性，SS1、SS1/2和SS9均阴性。同时设计引物向两侧扩增，以四川流行株ZY05719和江苏流行株HA9801的DNA为模板，扩增自溶素ORF完整的编码基因，软件分析结果显示，该基因含有6个重复的“GBS_Bsp-like”域和1个“N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶”域，与SS2欧洲株有较高同源性(99.8%)，但与SS2加拿大株差异较大。在DNASTAR分析所编码蛋白的抗原性的基础上，另设计引物，以ZY05719株DNA为模板，PCR扩增具有良好免疫原性的片段基因，并定向克隆至表达载体pET30a(+)中，进行重组表达，SDS-PAGE和Western blot表明，所获得重组自溶素具有良好反应原性。

摘要:胸膜肺炎放线杆菌(APP)是重要的猪呼吸道病原菌, 给世界养猪业造成严重的经济损失。信号标签突变(STM)技术是在宿主动物体内鉴定病原菌毒力因子的高通量方法。通过体外传代选育出APP血清1型和3型萘啶酸抗性菌株, 再以萘啶酸抗性菌株为受体菌, 以携带mini-Tn10的标签质粒(pLOF/TAG1-48)的E. coli CC118 λ pir或S17-1 λ pir为供体菌, 在或不在E. coli DH5α (pRK2073)的辅助下, 进行三亲本或两亲本接合, 通过抗性筛选、PCR和Southern杂交鉴定转座突变株。结果表明: 体外萘啶酸加压传代很容易选育出萘啶酸抗性APP菌株, 该抗性的产生与DNA促旋酶A亚基基因gyrA的突变有关。在APP与E. coli接合实验中, 两亲本接合比三亲本接合操作更简单, 效率也较高; APP不同菌株在接合和转座效率上存在很大差异, 血清1型菌株高于血清3型菌株, 3型标准菌株高于地方分离株JL03-R。本研究为APP STM突变体库的构建与毒力基因的鉴定奠定了基础。

摘要:目的: 分析减毒鼠伤寒沙门菌口服感染后在小鼠体内定位的情况。方法: 将构建的红色荧光蛋白(RFP)原核质粒pYA33-DsRed, 以电穿孔法转化减毒鼠伤寒沙门菌X4550, 重组菌命名为X4550(33-DsRed)。重组菌分别感染巨噬细胞RAW264.7和骨髓源树突状细胞(BMDC), 并用流式细胞术检测红色荧光细胞荧光强度。此外, 以不同剂量重组菌口服免疫BALB/c小鼠, 并于免疫后1d、2d、3d、5d、7d取小鼠脾、肝、肠系膜淋巴结(MLN)、派伊尔氏结(PP)、腹股沟淋巴结(ILN)细胞, 检测各组织器官中的红色荧光阳性细胞百分率。结果: 重组菌对RAW264.7细胞和BMDC均具有良好的侵袭力。口服小鼠后, 第1d, 仅在MLN及PP中检测到RFP阳性细胞, 其中PP中阳性细胞达到1.4%; 第2 d, 在ILN中达到0.4%; 第3 d, 各个组织器官中RFP阳性细胞均有上升趋势, 此时在脾、肝中也检测到RFP阳性细胞。第5 d, RFP阳性细胞均减少, 第7 d则未检测到任何RFP阳性细胞。减毒鼠伤寒沙门菌具有良好的侵袭力, 其黏膜移行方式以及对免疫组织器官靶向定位性, 在优化黏膜疫苗以及提高疫苗免疫效力等方面都具有重要作用。

摘要:猪圆环病毒2型ORF2编码与病毒毒力相关的结构蛋白――核衣壳蛋白（Cap），该蛋白可以用于PCV2感染的血清学调查，但不同区域的PCV2分离株的ORF2特别是其抗原表位序列存在一定的突变。本研究将PCV2浙江分离株ORF2的主要抗原表位以及PCV1 ORF2进行了原核表达，将分别纯化的融合蛋白Cap2s 和Cap1s免疫SPF兔后制备多抗，并进一步分析了纯化蛋白的免疫原性和多抗的特性。Western blot结果表明无论Cap2s 和Cap1s均能与两个多抗发生交叉反应，而PCV2或PCV1阳性猪血清只能分别特异性地识别Cap2s 和Cap1s。IFA结果则证明两个多抗对于天然Cap蛋白无交叉反应性。利用Cap2s作为包被抗原对13个猪场的259份血清样品的PCV2抗体进行ELISA检测，平均阳性率为80.69％（209/259），而各猪场的阳性率差异较大（48.28%-100%）。以上结果表明Cap2s可作为一个型特异性抗原用于浙江省本地猪场猪群血清中PCV2抗体的监控，而其多抗也可用于免疫组化对PCV2感染进行有效诊断。

摘要:血清I型马立克氏病病毒（MDV-1）CVI988/Rispens弱毒株的VP22蛋白缺失201TKSERT206。为了进一步证实该缺失对MDV-1 VP22蛋白转导功能和效率的影响，本研究通过将不同缺失型的VP22与EGFP相融合，转染COS-1细胞，通过间接免疫荧光方法，检测VP22的蛋白转导现象。结果发现，EGFP-VP22具有微管结合、核膜结合、核酸结合、蛋白转导等特性；CVI988 VP22与GA株VP22的转导效率相当，且只有完整长度的VP22具有明显的转导功能，其中，N端1~18aa对VP22的核定位及其蛋白转导功能的发挥意义很大。这一发现为利用MDV-1 VP22携带其他目的蛋白转导，增强目的蛋白免疫原性及其治疗性功能具有重要的指导价值。

摘要:在分析鸭瘟病毒gB蛋白抗原性的基础上, 设计一对引物克隆gB蛋白N端抗原性较好的抗原域编码基因。将克隆的基因定向插入pET-32a 的EcoRⅠ和Hind Ⅲ 之间, 构建了gB蛋白主要抗原域原核表达载体pET-gB1。将pET-gB1质粒转化BL (21) 宿主菌后, 对培养和表达条件进行了优化, 实现了DPV gB蛋白主要抗原域的高效表达。免疫印迹试验表明获得的表达产物具有良好的反应原性。 应用His?Bind 亲和层析柱纯化重组DPV gB蛋白, 以纯化的重组gB1 蛋白作为检测抗原, 初步建立了检测鸭瘟病毒抗体的igB1-ELISA。结果表明, 抗原的最佳包被浓度为6.5μg/mL, 血清的最佳稀释度为1∶80, 阳性标准初步定为: 待检血清OD490>0.4, 且待检血清OD490/阴性血清OD490> 2。应用igB1-ELISA 对鸭血清样品进行检测, 结果表明igB1-ELISA 与全病毒包被的iDPV-ELISA符合率达到95.6%。

摘要:应用DNA芯片研究禽致病性大肠杆菌可能致病基因的表达。构建禽致病性大肠杆菌毒力基因、潜在毒力基因的DNA芯片，应用基因芯片技术对同属O2血清型的禽高致病性大肠杆菌E058株和低致病性大肠杆菌E526株在体外LB培养基和鸡血清培养状态下进行差异表达分析。 结果:在体外LB静置培养状态下，低致病株E526与高致病株E058相比共有16个差异基因，均为下调基因。在鸡血清静置培养中，E526与E058相比共有15个差异基因，均为下调基因。应用基因芯片成功筛选了禽致病性大肠杆菌在体内外不同条件下的毒力基因及可能毒力基因中差异表达基因，表明一些铁摄取系统相关基因对APEC的毒力较重要，同时也筛选出了一些新的可能致病基因aes-1，aes-2，aes-3, aes-4, aes-6, aes-8, aes-10, aes-13, aes-15 , aes-31等。

摘要:建立了一种基于96孔板-酶标仪的双波长紫外分光光度法高通量筛选6-羟基烟酸转化菌的方法。实验以251nm为测定波长、231nm为参比波长测定转化样品的6-羟基烟酸含量, 6-羟基烟酸与ΔA251 - 231在0.5～11μg/mL浓度范围内有良好的线性关系，服从朗伯-比尔定律，平均回收率为99.11%～100.81%。利用96孔板-酶标仪，每天筛选量可达到2000～5000个反应，达到高通量筛选要求。

摘要:枯草芽孢杆菌JA产生的抗生素对植物病原真菌具有广谱抗性，明确抗生素的种类是进一步研究的基础。用6mol/L盐酸沉淀JA菌株的去菌体培养基，再用甲醇抽提获得抗生素的粗提物。利用反相HPLC系统，将粗提物过Diamonsil C18柱，收集有抗小麦赤霉病等病原真菌活性的化合物1、2。运用电喷雾质谱法(ESI/MS)测得其分子量分别为1042.4D和1056.5D。再利用碰撞诱导解离(CID)技术获得化合物的典型结构特征离子碎片，结果表明分子量为1042.4D的化合物一级结构为Pro-Asn-Tyr-βAA-Asn-Tyr-Asn-Gln (βAA为14个碳原子的氨基脂肪酸)，属于脂肽类抗生素iturin A。化合物1、2为相差一个亚甲基(-CH2)的iturin A同系物。研究结果提供了一种从枯草芽孢杆菌发酵液中快速分离纯化和鉴定脂肽类抗生素iturin A的新方法。

摘要:利用盐析－透析－色谱流程建立快速高效纯化工程菌E.coli JM109（pHsh PL）所产碱性果胶酯裂解酶（PL）的方法，纯化后酶达到电泳纯，比酶活为1079U/mg。重组菌所产PL酶促反应适宜的pH为9~10，适宜温度为50～66℃，与酶基因来源的野生菌所产PL相比，重组菌所产PL的适宜pH范围有所扩大，并保持了野生菌PL的热稳定性。通过金属离子种类、浓度及存在时间对PL酶活力影响的考察发现：在考察的离子中除Mg2+对酶活有较好的促进作用外，其余对重组菌产PL均有抑制作用，其中Fe2+对酶活力抑制作用最强。该酶的Km值为20.93 mg/L，Vmax为105.3 μmol/min，反应的活化能Ea为21.74kJ/mol。对重组菌所产PL热稳定动力学进行分析，发现有底物情况下的失活常数kd（0.02 min-1）小于无底物情况下的失活常数kd（0.0342 min-1），说明当酶与底物结合形成复合物时对酶活具有保护作用。利用HPLC-ESI-MS对重组菌所产PL酶解产物进行测定发现，产物含有不饱和二聚半乳糖醛酸(m/z 350.82)和不饱和三聚半乳糖醛酸(m/z 527.04)，同时测定结果中没有发现不饱和半乳糖醛酸单体(m/z 175)，可以初步推测重组菌产PL不能以不饱和二聚半乳糖醛酸和不饱和三聚半乳糖醛酸为底物进一步裂解。

摘要:简要回顾了丝/苏氨酸蛋白激酶在链霉菌中的发现过程，详细介绍了链霉菌中几个研究较为深入的丝/苏氨酸蛋白激酶的功能，同时对天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor A3(2)和除虫霉菌Streptomyces avermitilis MA-4680中的丝/苏氨酸蛋白激酶的跨膜种类和蛋白结构域特点作了初步的生物信息学分析。

摘要:乳酸菌作为一种益生资源, 越来越为人们所重视。在自然界存在的乳酸菌中, 有一类虽然人们一直在利用, 但是还没有充分的研究和开发, 这类乳酸菌就是低温环境中生长的乳酸菌。国外目前所见有关低温乳酸菌的报道多集中于低温冷藏肉、鱼制品及泡菜中的乳酸菌, 集中研究和应用的菌属主要包括Leuconostoc和Lactobacillus, 而国内这方面的研究并不多见。笔者根据目前国内外低温乳酸菌的研究现状, 阐述了其存在环境、种类及相应作用, 并对其研究涉及的领域、趋势及应用前景进行了探讨和展望, 以期为国内这类乳酸菌资源的研究开发提供参考和依据。