摘要:

摘要:【目的】从饲喂高精料的本地山羊瘤胃内分离到一株利用乳酸并能产生大量丙酸的菌株L9，并进一步研究了该菌在调控瘤胃微生物发酵中的作用。【方法】采用厌氧培养技术，结合形态、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析结果。【结果】该菌株被鉴定为反刍兽新月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)。该菌株体外代谢特性研究表明，L9可利用乳酸作为唯一碳源，该菌在24 h内可对 90 mmol/L的乳酸完全降解。体外摸拟瘤胃急性酸中毒的发酵试验结果表明，以淀粉为底物时，与对照组相比，添加菌株L9可显著降低瘤胃微生物体外培养体系中乳酸浓度，提高pH值，提高总挥发性脂肪酸和丙酸浓度，并显著降低乙酸与丙酸的浓度比（P<0.05）。【结论】结果显示，菌株L9是一株可代谢乳酸，促进丙酸生成，提高总挥发性脂肪酸浓度的有益瘤胃细菌。

摘要:【目的】为了从南沙海域中分离获得微生物菌种资源，【方法】本文通过沉积物采样、可培养菌分离及16S rRNA鉴定，【结果】从22个站点的沉积物样品中获得349株细菌，分属于87个种。发现产芽孢细菌分布最广，并在10个站点的分离株中占多数；它们是Bacillus，Halobacillus，Brevibacillus，Paenibacillus，Pontibacillus和Thalassobacillus。其中芽孢杆菌（Bacillus）无论在数量上还是种类上都最多，分别属于34种，其中有8个可能的新种。此外，g-Proteobacteria是分离率较高的另一亚群；其中，假单胞菌（Pseudomonas），海杆菌（Marinobacter），食烷菌（Alcanivorax）属的细菌最多。统计还发现，在深度750~2000 m之间，低GC含量的细菌最丰富，而深度2000 m以下，分离株则全部为g-Proteobacteria。【结论】南沙沉积物可培养微生物中产芽孢细菌及 g-Proteobacteria比较丰富；其中，产芽孢细菌的多样性最高，具有进一步研究开发价值。

摘要:Pseudomonas fluorescens 2P24是分离自麦田的植物病害生物防治菌株，产生抗生素2, 4-二乙酰基间苯三酚（2,4-diacetylphloroglucinol；2,4-DAPG）是其主要防病机制。菌株2P24中小RNA基因rsmZ正调控抗生素2,4-DAPG的产量。【目的】本文研究上游调控因子对RsmZ转录表达的影响，以进一步理解抗生素产生机制。【方法】构建了rsmZ: : lacZ的转录融合结构，将含有该结构的报告载体转入2P24的多个调控基因缺失突变体中，检测相应的缺失基因对rsmZ转录水平的调控作用。【结果】结果表明，反应调控因子GacA对rsmZ基因的转录具有正调控作用，二硫键合成蛋白DsbA对其负调控；双因子调控系统PhoP/PhoQ突变后，rsmZ基因的转录明显滞后。【结论】小RNA基因rsmZ在菌株2P24中受到多个基因的调控，并在信号传递网络中起到重要作用。

摘要:一株来自大棚温室甜椒根际的绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis G-05，可分泌抗生物质吩嗪-1-羧酸，并具有抑制辣椒疫霉的生物防治功效。【目的】为了系统研究该菌株的生物防治功能及抗生物质合成与分泌机制。【方法】首先通过生化法和16S rDNA同源比对法对该菌株进行系统分类的初步鉴定，再根据基因的同源性从G-05基因组DNA中克隆长1.4 kb的gacS基因的部分保守区段，采用抗庆大霉素基因（gentamycin resistance cassette, aacC1）插入失活的策略构建了该基因突变株G-05S。【结果】在King’ s B（KMB）或PPM培养基中，突变株G-05S合成吩嗪-1-羧酸的能力受到明显抑制。然而，突变株G-05S分泌的吲哚乙酸与野生株相比无显著差异。互补实验表明，gacS基因的表达可以使突变株G-05S的吩嗪-1-羧酸的合成恢复到野生株水平。【结论】由此推测，GacS(Global activator sensor )对不同次生代谢物的调控具有特异性。

摘要:【目的】从高产甘油生产菌株产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）基因组中克隆了NAD+依赖3-磷酸甘油脱氢酶编码基因（CgGPD），但是该基因及其上游调控序列具体的功能还是未知的。本文研究了CgGPD基因及其上游调控序列的功能。【方法】本文以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）及其渗透压敏感型突变株为宿主，构建3种不同的酵母表达载体导入酵母细胞，研究了不同酵母转化子在渗透压胁迫条件下CgGPD基因表达对细胞的耐高渗透压胁迫应答及其细胞的甘油合成能力的影响。【结果】实验结果表明无论是以来源于S. cerevisiae 的TPI启动子还是来源于CgGPD基因的启动子，过量表达CgGPD基因的转化子均能够显著加速葡萄糖消耗速度和提高甘油合成能力，在gpd1/gpd2突变株中表达CgGPD基因能够消除细胞对外界高渗透压的敏感性，同时转化子胞内甘油大量积累。【结论】CgGPD基因在野生型酵母S. cerevisiae W303-1A表达显著提高细胞的甘油合成能力，在gpd/1gpd2突变株中能够互补GPD1基因的功能，CgGPD基因表达受渗透压诱导 调控。

摘要:【目的】在不影响酵母正常代谢前提下，构建亚硫酸盐分泌量提高的基因工程菌株，增加二氧化硫生成量，有效地解决啤酒老化问题。【方法】以适量高产二氧化硫工业啤酒酵母突变株M8总DNA为模板，PCR方法得到带有不同长度5′端非编码区的基因片段SSU1-1、SSU1-2，以大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒YEp352构建表达载体pSU1和pSU2，转化实验室酵母YS58，验证SSU1多克隆表达对其二氧化硫生成量的影响。进而将pSU2转化工业啤酒酵母M8，利用亚硫酸盐抗性筛选转化子，并对其二氧化硫和硫化氢生成量及其啤酒抗老化性能进行测定和分析。【结果】实验室酵母转化子pSU1-4和pSU2-3二氧化硫生成量较原株明显提高而硫化氢生成量基本不变，工业啤酒酵母转化子Y2二氧化硫生成量比原株M8提高74.4%，TBA值下降14.9%，DPPH自由基清除率提高38.2%，硫化氢生成量基本不变。【结论】SSU1基因的多拷贝表达有效提高了亚硫酸盐转运蛋白Ssu1p表达量，增加了亚硫酸盐分泌量，啤酒抗氧化能力得到明显增强，而对酵母硫代谢途径中亚硫酸盐还原为硫化物代谢过程没有影响。

摘要:【目的】探究智能电子舌伏安法结合特定的统计分析系统是否适用于示踪食品致病性细菌生长情况的快速监测。【方法】利用智能电子舌――多频大幅脉冲传感系统的伏安法，监测液体培养基中3种食源性致病菌的16个时段生长情况所致液体基质变化过程的综合信息；结合主成分分析法对获得的复杂综合信息数据进行统计学分析，按获得的主成分得分图分析检测样品。【结果】监测能力强的电极、频率段分别是：金黄色葡萄球菌的为钨电极的100 Hz、铂电极的1 Hz、银电极的10 Hz和钛电极的10 Hz频率段；大肠杆菌O157:H7的为金电极的100 Hz、铂电极的1 Hz、钛电极的1 Hz和钨电极的100 Hz频率段；枯草芽孢杆菌的为钯电极的1、10和100 Hz 3个频率段。【结论】本试验首次用多频大幅脉冲传感系统伏安法结合主成分分析法，能够有效的监测样品细菌的生长情况，有望成为一种具有多种优点的新型检测细菌生长情况的快速监测系统。

摘要:【目的】研究铜绿假单胞菌弹性蛋白水解能力相关基因。【方法】应用人工Mu转座技术构建铜绿假单胞菌野生型菌株PA68的转座突变文库，从2000多个突变子中筛选得到4株弹性蛋白水解能力改变的突变子，并通过克隆及测序获得转座子插入位点侧翼的序列。将铜绿假单胞菌弹性蛋白酶结构基因lasB的转录启始区序列整合入载体pDN19lacΩ并将该重组质粒电转化入野生型菌株PA68及4个突变株中，对报告基因在不同菌株中的表达水平进行测定。【结果】发现4个突变株中Mu转座子分别插入lasA、galU、xcpZ和ptsP 4个基因。ptsP基因失活的突变株中，lasB基因的转录水平是野生型菌株的7%，xcpZ和lasA基因的失活使lasB基因的转录水平分别降低为野生株的54%和75%，galU基因的插入失活使lasB基因的转录上升了1倍。【结论】推测ptsP和galU基因很可能直接或间接地调控着弹性蛋白酶的生物合成。

摘要:【目的】通过研究(R)-专一性羰基还原酶和甲酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的共表达，解决较高底物浓度下不对称转化反应的辅酶限制性问题。【方法】分别以近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)和博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)基因组为模板，采用PCR方法扩增得到(R)-专一性羰基还原酶基因（rcr）和甲酸脱氢酶基因（fdh），克隆到共表达载体pETDuetTM-1中进行表达。共表达质粒pETDuet-rcr-fdh转化稀有密码子优化型菌株E. coli Rosetta，获得重组菌E. coli Rosetta/pETDuet-rcr-fdh。【结果】在30℃条件下，经1 mmol/L IPTG诱导表达8 h后，SDS-PAGE结果表明(R)-专一性羰基还原酶和甲酸脱氢酶均有明显的表达，其相对分子质量分别为37 kDa和 40 kDa。以高浓度(6 g/L)2-羟基苯乙酮为底物时，0.1 g重组菌细胞催化产生(R)-苯基乙二醇，产物光学纯度为100% e.e.，产率为85.9%。与无甲酸脱氢酶参与辅酶再生循环的重组菌E. coli Rosetta/pETDuet-rcr相比，产物光学纯度和产率分别提高了1.3和2.7倍。【讨论】该重组菌的构建为基因工程法生物合成(R)-苯基乙二醇的工业应用奠定了基础。

摘要:【目的】在专一性PCR和变性梯度胶电泳(DGGE)的协助下，从废水处理装置的微生物群落中分离较难分离的功能菌Thauera。【方法和结果】本研究首先使用Thauera特异性PCR-DGGE的方法鉴定了焦化废水处理装置反硝化池生物膜中的Thauera在6种培养基、好氧/厌氧条件下的生长情况。挑选Thauera多样性较高的培养基1/10 NB与MMQ在好氧条件下进行分离培养。然后使用Thauera特异性PCR方法确定分离得到的菌落是否呈阳性，并使用DGGE的方法检验其是否为纯菌。使用不同培养基对含有Thauera的混合菌落进行进一步纯化，DGGE检测发现MMP培养基对混合细菌菌落Q20中的Thauera有明显的富集作用。经过Thauera特异性PCR结合DGGE检测对Thauera属细菌进行追踪，将混合菌落在MMP培养基上多次划线，最终分离得到纯菌。通过这种方法，从反硝化池样品中分离获得了3株在样品中最为主要的Thauera菌株。【结论】以特异性分子标记为导向分离培养细菌，不仅提高了分离效率及细菌筛选的灵敏度，还能协助分离常规方法难以分离的细菌。

摘要:【目的】trag(transfer gene G)是利用IVIAT(in vivo induced antigen technology)通量筛选鉴定的猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2，SS2）感染相关因子，研究该基因在猪链球菌（Streptococcus suis，SS）中的分布情况,研究康复血清与免疫血清在免疫印迹中的反应性有无，间接证明其在体内感染与体外培养时表达差异。【方法】鉴于我国分离株trag与GenBank公布的SS2北美株89/1591的trag序列有95.8%的同源性，据此设计和合成一对检测引物，对SS2我国江苏及四川流行株、其他临床分离株和参考株及SS1、SS1/2、SS9、SS7及C群猪源链球菌共43株进行PCR扩增。另设计一对引物，扩增5株SS代表菌株trag的完整阅读框，并对扩增产物进行测序。据软件分析后，选择TRAG(Transfer protein G?)免疫原性良好的区域片段的核酸设计表达引物，PCR扩增后定向克隆至表达载体pET28a(+)构建表达质粒，表达蛋白转印到PVDF膜上，分别与SS2猪康复血清和猪高免血清反应。【结果】trag在SS2中94%(30/32)阳性，SS9中67%(4/6)阳性，SS7阳性，SS1、SS1/2及C群菌阴性。5株细菌TRAG的氨基酸序列与SS2中国株98HAH33、05ZYH33及北美株89/1591同源性>97%。所获得重组蛋白只能被康复血清识别。【结论】从SS 致病株中检出感染相关基因trag，提示该基因可能与SS 致病性有关，重组蛋白的免疫转印结果表明，TRAG可能与SS2体内感染相关。

摘要:【目的】探讨肠球菌溶血菌株及非溶血菌株对小鼠巨噬细胞RAW264.7表达TNF-а的影响。【方法】用多粘菌素B抑制排除内毒素污染对实验的影响。肠球菌溶血菌株、非溶血菌株各11株，以菌/细胞比 30∶1 感染RAW264.7细胞1 h，加入200 mg/mL氨苄青霉素继续培养24 h，分别于感染后3、6、9、24 h，用ELISA方法检测不同观测点细胞培养液中肿瘤坏死因子TNF-a的含量，并用逆转录-聚合酶链反应方法（RT-PCR）比较肠球菌溶血、非溶血菌株感染6 h后TNF-a mRNA表达的差异。【结果】未感染的RAW264.7细胞培养液中检测不到TNF-a。肠球菌溶血株感染组细胞培养上清液中各观测点的TNF-a的平均含量 (pg/mL) 均比非溶血株性组高。经t检验，P<0.01，差别有显著性。RT-PCR法检测其mRNA的表达也有相同结果：TNF-a mRNA在肠球菌溶血株感染细胞中的相对表达量比非溶血株感染的细胞高，经t检验，P<0.05，差别有统计学意义。【结论】肠球菌溶血株比非溶血株更能促进小鼠巨噬细胞RAW264.7产生TNF-а炎症因子。

摘要:【目的】研究口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV) poly(C)区段的序列长度与FMDV毒力之间的关系。【方法】首先利用NheⅠ/NotⅠ线化FMDV pGEM-XJ/AKT/69全长重组质粒，制备体外转录本，借助Lipofectamine 2000转染BHK-21细胞，获得基因工程毒。随后，在细胞传代过程中，收取不同代数病毒培养液，提取总RNA进行poly(C)的长度测定，并进行乳鼠致病性试验和BHK-21细胞TCID50的测定。【结果】我们发现，基因工程毒在BHK-21上连续传代至第6代时，可见明显的致细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)；在经过一代乳鼠接种之后再重新适应到BHK-21细胞的过程中，poly(C)区段出现了缩短现象；乳鼠致病性试验和BHK-21细胞TCID50测定结果表明，尽管基因工程毒与母本毒相比毒力偏低，但含有不同长度poly(C)的基因工程毒之间并无显著差异。【结论】poly(C)区段的序列长度在12~17个C之间改变对FMDV基因工程毒的毒力无明显的影响。

摘要:【目的】了解广东部分地区2002~2007年环境水中嗜肺军团菌的基因型及遗传学关系。【方法】参考欧洲军团菌感染工作组（the European Working Group for Legionella Infections, EWGLI）制定的分型草案（1.2版），采用PstⅠ酶对我室保存的2株标准菌株及41株不同时间、不同地点的嗜肺军团菌环境分离株进行扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism, AFLP）分析，电泳图谱与EWGLI进行比对。【结果】AFLP分型结果稳定，重复性好；43株嗜肺军团菌，其不同来源菌株呈现多态性分布，经AFLP分析得到33个基因型，辨别力指数为99.79%，其中Kingmed AFLP 011为优势基因型。按Dice系数≥0.8，可分为18个群，Kingmed AFLP D群为优势群，占总菌株数的34.88%。由电泳图谱的相似性，初步推断存在EWGLI 001 Lugano型、002 Lugano、012 Rome、013 London、014 London型、015 Dresden型、021 Lyon等7个基因型，以及多个未报道的新基因型。【结论】广东地区嗜肺军团菌的基因型十分丰富，AFLP技术是其分子流行病学研究的有效手段。

摘要:传染性法氏囊病病毒 (IBDV)是双链，双节段RNA病毒，其基因组由A、B两个节段组成，编码结构蛋白VP1-VP4和非结构蛋白VP5。【目的】利用反向遗传操作构建拯救VP5基因缺失重组IBDV。【方法】利用体外定点突变技术，缺失IBDV Gt株VP5基因，通过多重PCR在基因组两端分别引入锤头状核酶序列(HamRz)和丁肝病毒核酶序列(HdvRz)。将带有核酶序列的IBDV基因组插入载体pCAGG的b肌动蛋白启动子下游，构建了IBDV感染性克隆pCAGGmGtA △VP5HRT，将该感染性克隆与pCAGGmGtBHRT共转染DFⅠ细胞。【结果】RT-PCR和间接免疫荧光均显示获得重组病毒，将其命名为rmGtA △VP5。IBDV VP5基因缺失感染性克隆的成功构建为从分子水平上深入研究vp5基因功能奠定了基础。

摘要:【目的】建立一种高效检测和分析玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63内源质粒的方法。【方法】根据“链霉菌线性质粒5′末端都结合有共价蛋白”这一性质，通过改进琼脂糖包埋块制作方法，发明了一项快速高效检测链霉菌质粒种类、构型及大小的技术，称为“包埋块二次处理法”，该方法还能从正反两方面表明共价蛋白的存在与否。【结果】利用此方法高效检测出了玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中存在两种线性质粒，双向电泳验证了该方法的正确性，推测质粒大小分别约为 47 kb和53 kb。【结论】利用本研究发明的方法首次成功地检测了玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中的内源线性质粒。

摘要:本文概述了近年来蛋白质组学技术在极端微生物研究领域中存在的关键问题、解决途径和研究现状。迄今为止，虽然蛋白质组学技术快速发展，但极端微生物的蛋白质组学的研究仍然存在很多困难。由于极端微生物的蛋白质-蛋白质复合物解离不彻底，而嗜中温微生物的蛋白质解离和变性条件不适用于极端微生物合成的大多数蛋白质等特殊问题，致使蛋白质组学技术还没有广泛应用于嗜盐、嗜热/冷、嗜酸/碱等微生物的研究中。当然，蛋白质组学技术应用的潜能和前景吸引人们积极尝试各种各样的方法。目前，通过研究已经有效地解决了嗜盐蛋白质的分离、嵌合膜蛋白的鉴定和新蛋白质的功能推测，证实了基因组预测的一些结论，并揭示基因组不能充分解析的某些特性和新蛋白质。极端微生物蛋白质组学的研究表明，全面展示蛋白质表达谱需要不止一种蛋白质组学方法。此外，蛋白质组学和基因组学的互相印证和结合，将加速极端微生物的研究进程，深入全面地揭示微生物适应极端环境的特殊机制，进而阐明极端微生物生存的机理，为改善胁迫因素导致的伤害提供新的研究方向。

摘要:过氧化物酶体（peroxisome，P）是真核细胞中普遍存在的细胞器，参与多种重要的代谢过程。P的产生、增殖及降解是细胞器发生机理研究的重要部分。到目前已知的P发生相关基因有30多个，但其机制仍不完全清楚。作为一种多细胞真核生物，丝状真菌在P发生机制的研究中有重要价值。近年来，随着基因组序列的应用和真菌生物技术的进展，丝状真菌中P功能及发生机制的研究取得了较大进展。同时，作为丝状真菌真菌中的重要类群，植物病原真菌P在致病过程中的作用也引起关注。本文对P发生机制、在丝状真菌中的研究概况，以及与植物病原真菌致病性的关系进行了 综述。