摘要:

摘要:通过小片段基因组文库的构建获得工业生产菌HS007的若干基因组片段, 并以大肠杆菌—链霉菌穿梭质粒pHJL400为载体, 构建了5个插入了特异性标记序列及抗性筛选标记的重组质粒pHJL02AFOH, pHJL07AFOH, pHJL08AFOH, pHJL10AFOH和pHJL12AFOH。利用这些质粒转化工业生产菌株HS007, 获得具有特异性标记序列和相应抗性的标记菌株02-72, 07-44, 08-02, 10-81和12-58, 其中02-72和12-58的生产能力不受插入片段的影响。利用重组质粒pSP02AFOH上抗性标记两端两个FRT序列的分子内重组去除抗性标记, 并以大肠杆菌—链霉菌穿梭质粒pGH112替换该质粒的载体部分, 得到重组质粒pGH02FH。以pGH02FH转化标记菌株02-72, 获得具有特异性标记序列而没有相应抗性的菌株02-72-36。发酵结果表明, 标记片段的插入不影响菌株02-72-36的生产能力。本方法建立了链霉菌工业菌种基因组标记的技术平台。

摘要:设计含有与面包酵母(Saccharomyces cerevisiae BY-6)编码酸性海藻糖酶ATH基因内部部分序列同源的长引物, 以质粒pUG6为模板进行PCR构建带有Cre/loxP系统的敲除单元, 转化面包酵母获得G418阳性克隆。将铜抗性基因(CUP1-MT1)导入Cre 重组酶表达质粒pSH47, 得到重组质粒pSH-CUP, 并转化阳性克隆, 以铜抗性筛选面包酵母转化子。半乳糖诱导表达Cre酶切除Kanr 基因。重组质粒pSH-CUP的构建, 不仅解决了酵母转化子筛选标记问题和非酵母基因的引入, 而且使 LoxP-kanMX-loxP基因敲除体系在进行真核生物基因敲除时更加方便可行。

摘要:从油井采出水中分离到一株高温产胞外聚合物的细菌MS-1, 经16S rDNA基因序列分析属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。该菌能在60℃生长并产生胞外聚合物, 其中胞外多糖含量为48.3%～54.5%, 主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成, 摩尔比分别是2.04：1.00：0.89。胞外聚合物中蛋白含量为 37. 2%~42.4%, 主要由甲硫氨酸、亮氨酸、天门冬氨酸、丙氨酸、组氨酸和丝氨酸组成。利用透射电镜和环境扫描电镜对胞外聚合物的形成进行了观察。该菌的分离和研究为高温油藏的微生物调剖和驱油奠定了生物学基础。

摘要:采用以异戊二烯为唯一碳源的选择性平板筛选模型, 从钱塘江沿岸杭州市九堡段土壤中新筛选到一株产辅酶Q10的细菌菌株E03, 经形态、生理生化、Biolog碳源利用试验和16S rDNA序列分析, 确定 E03属于鞘氨醇属(Sphingomonas sp.), 命名为Sphingomonas sp. ZUTE03。摇瓶试验确定了该菌发酵生产辅酶Q10的最佳碳源为葡萄糖15 g/L, 氮源为硫酸铵10 g/L, 初始pH8.0, 发酵温度25℃, 并考察了该菌转化茄尼醇产辅酶Q10的发酵工艺, 以合适溶剂为溶解体系, 于发酵培养基中摇床培养12 h后, 加入终浓度为0.75 g/L的茄尼醇粗品, 转化12 h, 辅酶Q10产值可达96.88 mg/L。

摘要:壳聚糖在医学、食品、环保、日化用品等领域有着广泛而重要的应用。近年来, 壳聚糖由于对不同的菌类都具有良好的抑菌效果而被研究者们密切关注。然而, 有关壳聚糖抑菌机制的研究却并不多, 其抑菌机制也没有被完全阐明。在本研究中, 我们发现很多金属离子可以对壳聚糖的抑菌效果产生影响, 高浓度金属离子(0.5%)可以使壳聚糖完全丧失抑菌活性。还发现金黄色葡萄球菌和白色念珠菌在壳聚糖的作用下会发生钾离子和ATP的渗漏, 而且五万分子量的壳聚糖引起钾离子和ATP的渗漏大约比五千分子量壳聚糖多2到4倍。不同分子量的壳聚糖对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌都具有较好的抑菌效果, 但是引起钾离子和ATP的渗漏量却存在很大差异, 这说明小分子量壳聚糖很可能存在与大分子量壳聚糖不同的抑菌机制。

摘要:从嗜热菌库中分离到两株能水解生淀粉的菌株173和174, 通过扩增和测定两株菌的16S rDNA序列并进行比对结果表明, 所分离两株菌属于Geobacillus属的细菌。液体摇瓶发酵菌株173、174, 其产生的生淀粉酶(简称RSDE173、RSDE174)活力分别达14.5 U/mL和12.9 U/mL。通过生淀粉吸附－熟淀粉洗脱系统和TOYOPEARL HW-55F系统进行分离纯化, 得到纯化的RSDE173和RSDE174, 纯化倍数分别为50和29, 活力回收率分别为34%和41%。有关RSDE173和RSDE174酶学性质研究显示, 对熟淀粉水解的最适作用温度均为70℃, 而对生淀粉水解则分别在50℃~60℃和40℃~60℃下表现出高水解活力; 对不同底物的最适作用pH值均为5.0~5.5; 它们对大多数试验离子的敏感性较低, 但个别离子如Co2+、Cu2+对RSDE173或Cu2+对RSDE174的酶活力有一定的抑制作用。纯化的这两种生淀粉酶对不同来源生淀粉的底物专一性并不相同。RSDE173底物专一性顺序为红薯淀粉＞小麦淀粉＞玉米淀粉＞木薯淀粉＞糯米淀粉; 而RSDE174的糯米淀粉＞小麦淀粉＞红薯淀粉＞玉米淀粉＞木薯淀粉。RSDE173对生红薯淀粉有很好的降解, 其水解糊化淀粉与生红薯淀粉的比值为1.48; 而RSDE174优先降解生糯米淀粉, 其相应比值为1.69。

摘要:二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid, DHA)是具有各种重要生理功能的高度不饱和脂肪酸。以海洋真菌Thraustochytrium sp. FJN-10为研究对象, 利用RT-PCR结合RACE, 获得了两个碳链延长酶(TFD6和TFD5)的完整基因, 其中TFD6 cDNA全长816 bp, 编码271个氨基酸; TFD5 cDNA全长831 bp, 编码276个氨基酸。将TFD6、TFD5酶切后分别连接到HindⅢ/XbaⅠ处理过的pYES2载体, 醋酸锂法转化酿酒酵母感受态细胞, 成功构建了延长酶酵母表达系统。气相色谱分析表明TFD6可延长C18:3n-6至C20:3n-6, TFD5可延长C20:5n-3至C22:5n-3。

摘要:借助生物信息学, 对已克隆的地霉属脂肪酶全长基因序列进行同源比对, 根据保守序列设计引物, 在基因组DNA和cDNA水平上, 于国内首次克隆了Geotrichum candidum Y162脂肪酶基因。G. candidum Y162脂肪酶基因全长1692bp, 不含内含子, 编码包括19个氨基酸信号肽在内的563个氨基酸。与NCBI GenBank中已报道的地霉属脂肪酶氨基酸序列有86％的一致性。将该基因克隆到pPIC9K表达载体上, 转化毕赤酵母GS115, 摇瓶发酵96h后毕赤酵母分泌表达55 U/mL重组脂肪酶, 实现了脂肪酶的高效表达。酶学性质研究表明, 该重组脂肪酶对C9位顺式双键的甘油酯具有明显的底物特异性; 对甲醇、甘油等有机溶剂呈现耐受性; 最适温度和最适pH分别为50℃和8.0, 在pH 6.0~10.0及60℃以下能保持60%以上的酶活力。底物特异性、有机溶剂、温度及pH耐受性赋予该重组酶良好工业应用潜力。

摘要:利用PCR技术扩增出BmDNV-3 NS1基因, 将目的基因与原核表达载体pET-30a进行连接, 转化BL21 star菌并在该菌中表达, 经Western blot鉴定表达的产物为BmDNV-3 NS1蛋白, 纯化NS1蛋白并制备兔多克隆抗体。同时BmDNV-3 NS1基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-HTb-eGFP中, 转化BmDH10BAC感受态细胞, 提取的重组Bacmid通过脂质体包埋转染家蚕BmN细胞, 再以收获的重组病毒感染家蚕幼虫。家蚕BmN细胞和幼虫感染重组病毒2d后均观察到绿色荧光, 经SDS-PAGE分析真核表达的产物与预测的NS1-eGFP融合蛋白大小不一致, 说明NS1-eGFP融合蛋白被昆虫内源性的蛋白酶降解。降解的产物用NS1蛋白抗体进行Western blot鉴定为BmDNV-3 NS1蛋白。

摘要:通过基因工程的方法构建奈瑟氏淋球菌表面蛋白A(Neisseria gonorrhoeae surface protein A, nspA)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(B subunit of Escherichia coli heat-labile enterotoxin, ltB)融合基因的原核表达载体, 对其进行表达与鉴定, 为后续融合蛋白LTB-NspA的生物活性分析及其作为淋球菌粘膜免疫疫苗的研究奠定基础。用PCR法从标准菌株分别扩增出nspA、ltB基因, 用重组PCR法通过接头将ltB与nspA融合, 将其插入pET-30a中, 转入BL21中表达。经测序、SDS-PAGE和Western blot分析, 证实成功构建了ltB-nspA融合基因的原核表达载体, 并在BL21中表达。ltB-nspA融合基因的成功表达, 为进一步研究其生物活性及淋球菌粘膜免疫疫苗的研究奠定了一定基础。

摘要:菌蜕系统是一个自身具有佐剂性质的新型疫苗体系, 不含细胞质内容物但具有细菌的完整表面抗原结构, 可诱导机体的体液、细胞免疫应答及增强黏膜免疫反应。本研究通过将带有裂解基因E的质粒pElysis转化至嗜水气单胞菌J-1株中, 对Ah J-1(pElysis)进行温度诱导, 温度从28℃升至42℃, 每隔15min检测菌液的OD600值, 测定其溶菌动力学, 并做无菌检验, 用扫描电镜观察裂解后的细菌形态, 研究其作为口服疫苗对银鲫的效果。结果显示, 通过温度诱导, 嗜水气单胞菌J-1(pElysis)OD值在诱导30min后开始持续下降, 75min时开始趋于平稳, 到120min溶菌效率达99.99%, 诱导16h后进行无菌检验, 证实其无活菌。扫描电镜观察绝大部分菌体经诱导后形成菌蜕, 细胞两端有溶菌通道。动物试验表明, 用菌蜕口服免疫的银鲫, 在第5周产生较高的凝集抗体, 达到27, 并能维持2周; 而甲醛灭活苗组为26, 维持时间仅一周; 生理盐水对照组效价仅2。攻击试验表明, 菌蜕疫苗组和甲醛灭活疫苗组对嗜水气单胞菌强毒株J-1的攻击均有保护作用, 其相对保护率分别为16/20(78.95%)和12/20(57.9%), 显示菌蜕疫苗比普通灭活疫苗能更有效地激活机体的免疫保护。

摘要:采用PCR从猪丹毒丝菌C43311株基因组中扩增出编码表面保护性抗原A的spaA基因片段, 将其克隆到pMD18-T载体并对插入片段进行测序。用spaA基因N端免疫保护区(spaA-N)的特异引物从重组质粒pMD18-spaA中扩增得到spaA-N片段, 将其定向插入原核表达载体pGEX-6p-2中, 构建重组表达质粒pGEX-spaA-N, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 在IPTG诱导下表达融合蛋白GST-SpaA-N, 用SDS-PAGE和Western印迹检测表达产物。测序结果表明spaA基因片段大小为1881bp, 与已报道的不同血清型菌株spaA基因的核苷酸序列比较, 核苷酸序列同源性在93％～99％之间。SDS-PAGE结果显示表达蛋白约为64kDa, 与预期的大小相近。Western印迹检测结果表明, 表达的融合蛋白GST-SpaA-N能与C43311株SpaA蛋白的抗血清发生特异性反应, 证明原核融合表达蛋白具有免疫反应性。

摘要:将5个toxA基因片段N1518、C2345、N3172、N3388和C2115分别克隆到合适的原核表达载体pET-28a(b,c)系统, 其中pET28a-N1518和pET28b-C2115在大肠杆菌成功表达, 获得大小分别为57kDa和78kDa的融合蛋白rPMT-N和rPMT-C, Western blot检测证实两种表达产物均具有反应原性。分别以200μg rPMT-N和rPMT-C对小白鼠进行体内生物学活性试验, 结果两种表达蛋白均不能致死小白鼠; 体外细胞毒性试验证实896ng/mL的rPMT-N能使Vero细胞发生病变, 而rPMT-C对Vero细胞无明显毒性作用。将rPMT-N和rPMT-C制成亚单位疫苗, 同时设天然PMT及无菌PBS对照组, 间隔2周分2次皮下免疫小白鼠。二免后2周用8.2×105 CFU的HN-13株T+Pm进行腹腔攻毒, 结果rPMT-N组保护率为90.0%(9/10), rPMT-C组保护率为50.0%(5/10), 天然PMT组保护率为80.0%(8/10)。综上试验表明, rPMT-N具有良好的生物学活性和免疫原性, 可作为PAR疫苗添加成分, 显示了良好的应用前景。

摘要:根据GenBank发表的H1亚型猪流感HA基因序列设计引物, 扩增出HA基因片段, 将其克隆到pFastBacGP67B杆状病毒载体上, 筛选阳性重组转座载体pFastBacGP67B-H1, 转化含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受态细胞, 构建杆状病毒表达载体获得重组转座子(rBacmid-H1), 在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞, 获得重组杆状病毒(rBV-H1), 再感染细胞, 收获目的蛋白。通过血凝试验、免疫印迹法、免疫组化分析表明该蛋白得到表达, 且具有良好的生物学活性。利用表达的蛋白作为猪流感间接ELISA的抗原, 初步建立H1亚型猪流感的间接ELISA检测方法, 并对内蒙古、辽宁和黑龙江等地送检的93份猪血清进行了检测, 阳性率为31.18%, 为研制开发快速、准确、简便的H1亚型猪流感鉴别诊断试剂盒奠定基础。

摘要:选取13株国内2001～2004年分离的新城疫流行病毒(Newcastle disease virus, NDV), 经蚀斑纯化, 克隆其融合蛋白(F)和血凝素-神经氨酸酶(HN)基因, 结合疫苗株La Sota、Clone30和国内标准强毒株F48E9等的基因序列, 进行遗传变异分析。利用纯化的病毒制备特异阳性血清, 进行鸡胚交叉中和试验, 确定不同NDV毒株之间的抗原相关性, 并与NDV不同毒株之间的HN和F基因核苷酸(氨基酸)同源性进行相关比较。结果表明: 病毒中和指数与HN基因的核苷酸(氨基酸)同源性显著相关(P<0.01, r=0.35), 与F基因呈弱相关(P<0.05, r=0.20), 而与F基因前374bp的核甘酸同源性不相关。这表明, NDV的分子变异已经对NDV的抗原性变异产生了影响, 研制新型的疫苗成为必然。

摘要:C3d是补体C3的裂解产物之一, 与抗原相连时可以明显提高抗原分子的免疫原性。CR2/CD21在其功能发挥过程中起到重要作用, P29为编码C3d与CR2结合区域的基因。从健康AA肉鸡肝脏中RT-PCR克隆C3d cDNA, 设计引物克隆P29至pUC19载体, 利用同裂酶 BamH I和Bgl II构建pUC-P29.n。酶切获得P29.n, 将其克隆至真核表达载体pCDNA3.1(+)。最后RT-PCR扩增新城疫F基因, 定向克隆至真核表达载体pCDNA-P29.n中P29.n的上游, 构建完成新城疫F基因疫苗。3周龄SPF鸡进行基因免疫, 结果pCDNA-F-P29.4、pCDNA-F-P29.6较pCDNA-F都能够提高HI抗体水平及保护力, 虽然HI抗体水平不及灭活苗, 但是能够抵抗致死量病毒的攻击, 并且pCDNA-F-P29.6效果更好。目前发表的关于C3d的佐剂作用的文章多是关于鼠C3d, 相应的抗原不能够自然感染鼠类, 关于鸡C3d的报道较少。研究结果为进一步开发和利用鸡C3d奠定了基础。

摘要:根据从GenBank中检索到的木霉菌β-1, 3-葡聚糖酶基因序列设计引物, 以高产β-1, 3-葡聚糖酶菌株——绿色木霉LTR-2的cDNA为模板, 采用PCR方法扩增得到内切β-1, 3-葡聚糖酶基因(glu)。将glu克隆至载体pMD18-T上, 进行了全序列测定。序列分析表明该基因由2289个核苷酸残基组成, 含有一个开放阅读框架, 可以编码762个氨基酸, 与报道基本相同。翻译后的氨基酸序列含有两个β-1, 3-葡聚糖酶的保守区RVVYIPPGTY和AASQNKVAYF。基因与已发表的木霉β-1, 3-葡聚糖酶基因有较高的同源性, 其中和哈茨木霉bgn3.1和绿木霉bgn13.1的同源性达到93%。序列已经提交GenBank, 登录号为EF176582。将glu基因插入到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)穿梭载体pPIC9K中, 获得重组质粒pGLU14, 经线性化后转化毕赤酵母菌株KM71。经大量平板筛选, 获得能有效分泌表达β-1, 3-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌株KGLU14, 菌落PCR扩增证实了glu基因已经整合到酵母基因组中。SDS电泳结果表明其β-1, 3-葡聚糖酶的分子量大约为80kDa, 和理论推测值大致相同。摇瓶发酵结果表明, 培养基中β-1, 3-葡聚糖酶的活力可达889U/mL。

摘要:从湖南、云南采集的19份酸性土壤样品分离到50株放线菌, 在pH4.5和pH7.0的培养基上都能生长。从新疆、青海、云南的14份碱性土壤样品中分离到38株放线菌, 在pH10.0和pH7.0的培养基上均能生长。因此, 这些菌株属于中度嗜酸或中度嗜碱放线菌。利用脉冲电泳技术和普通凝胶电泳在其中12株放线菌中检测到线型质粒, 其中3株放线菌中检测到环型质粒。这是首次在中度嗜酸和中度嗜碱的放线菌中报道线型和环型质粒。

摘要:首次对家蚕核型多角体orf25基因进行了描述。扩增Bm25基因, 亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-2, 在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达含有GST标签的融合蛋白。IPTG诱导后高效表达GST-Bm25融合蛋白。纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用制备的抗GST-Bm25融合蛋白的多克隆抗体进行表达时相分析显示: 24 h p.i.检测到30 kDa的蛋白条带。RT-PCR方法, 在18-72 h p.i 检测到Bm25基因的转录本。结论: 以上数据表明Bm25基因编码一晚期表达的30kDa蛋白。

摘要:基于禽大肠杆菌Ⅰ型菌毛黏附素fimH 基因的已知序列, 利用λ噬菌体的Red重组系统构建禽致病性大肠杆菌国内分离株A2(血清型O2:K89)Ⅰ型菌毛黏附素fimH 基因缺失突变株A2△fimH::Cat, 在二次重组中利用携带能够表达FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20(温度敏感性)以去除上述缺失突变株中抗性基因标志, 结合PCR扩增和测序结果, 证明fimH 基因缺失株A2△fimH 的正确构建。通过fimH 基因互补试验使A2△fimH 缺失突变株恢复了与野生株具有相同的凝集活性。红细胞和酵母细胞凝集试验结果表明, 野生株呈现良好的凝集效果, 并能被0.5%甘露糖完全抑制, 而A2△fimH 缺失突变株未呈现任何凝集现象。体外生长试验结果表明,在同样的培养条件下, A2△fimH 缺失突变株生长周期的各个阶段都要稍慢于野生株。禽致病性大肠杆菌国内分离株Ⅰ型菌毛黏附素fimH 基因缺失突变株成功构建, 为进一步深入研究禽大肠杆菌Ⅰ型菌毛与机体相互作用的分子机制, 肠道外感染的致病机理及对国内禽大肠杆菌病的防控策略奠定了一定基础。

摘要:益生菌是指一类活的, 摄入足够量就能够对人体产生有益作用的微生物, 目前广泛应用于食品发酵、工业乳酸发酵以及医疗保健领域。随着市场上商品化益生菌的不断出现, 它所带来的安全性问题也更加引起人们的关注。目前益生菌主要存在四个方面的安全问题：致病性和感染能力; 有害的代谢活动; 过度的免疫反应和可能的基因转移。传统的益生菌安全性评价方法具有一定的局限性。我们需要针对目前益生菌安全性存在的问题建立一套包含基因组学, 代谢组学, 蛋白质组学等研究内容的评估方法, 对益生菌的安全性进行系统全面的评估。本文总结了一些对于益生菌安全性的研究进展和研究方法, 以提示我国应尽快完善益生菌及其制品的安全性评价方法指标并建立安全性评价体系, 使益生菌更好的为人们的健康服务。

摘要:聚乳酸(Polylactic Acid, PLA) 是一种新兴的, 由可再生资源—— 乳酸聚合而成的高分子聚酯。因为其具有优良的物理化学性能、生物相容性及生物可降解性, 且对环境及人体无毒害作用,而被认为是一种最具潜力的绿色生物塑料。作为环境友好材料, 聚乳酸日益受到人们的重视。基于可循环利用的考虑, 其生物降解的研究也成为当前研究的一个重要方面。本文综述了PLA生物降解领域的相关进展, 包括降解的微生物学、相关酶学及分子生物学, 系统阐述了PLA可能的生物降解机制, 并对生物系统处理PLA废弃物的可行性进行了探讨。

摘要:Ⅰ型蛋白磷酸酶(PP1)属丝/苏氨酸磷酸酶的一种, 在生物体中广泛存在, 参与调节多种重要的生理功能, 包括转录、翻译、代谢、细胞生长及分化等。PP1分子结构表面的3个凹槽及β12-β13 Loop环结构,它在底物与抑制剂的结合方面起决定作用。近期研究发现, Loop环结构除了是抑制剂的结合部位之外, 对整个酶分子的结构和性质都起重要作用。功能研究也证明PP1还参与HIV-1转录过程的调节, 并且与老年性痴呆等多种疾病密切相关。主要对PP1的组织分布、分子结构、酶学特性、催化机制以及生物学功能等方面进行了相应的综述。