摘要:

摘要:芽孢萌发的营养诱导剂通过与特异的萌发受体结合激活下游的萌发过程, 从而使芽孢经过一系列的遗传变化及生化反应恢复营养生长。从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)中克隆到一个与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)gerA 操纵子和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)gerR 操纵子同源的gerA 操纵子。苏云金芽孢杆菌gerA 操纵子含有3个开放读码框: gerAA、gerAC 和gerAB, 该操纵子在产孢起始3个小时后开始转录。gerA 的破坏阻断了L-丙氨酸诱导的芽孢萌发并且延迟了肌苷诱导的萌发。在L-丙氨酸诱导芽孢萌发的过程中D-环丝氨酸能够提高芽孢的萌发率。

摘要:根据马传贫强毒株EIAV-L和疫苗株EIAV-FDD表面蛋白gp90的N-连接糖基化的变化规律,采用PCR定点突变的方法, 对全长感染性克隆pLGFD3-8上的N-连接糖基化的差异区域进行改造后, 构建成含有3个N-连接糖基化位点突变的感染性克隆pLGN191N236N246。将其转染驴胎皮肤细胞(FDD),通过用逆转录酶活性、间接免疫荧光和RT-PCR方法检测而确定其感染性。结果表明, 在FDD细胞中盲传三代后, 在细胞培养物中可检测到逆转录酶活性, RT-PCR和间接免疫荧光检测均呈阳性, 电镜下见到典型的EIAV颗粒。这一结果可能对N-连接糖基化在我国马传贫弱毒疫苗致弱机理的作用研究而奠定良好的基础。

摘要:为构建乳酸乳球菌食品级分泌表达载体, 通过PCR扩增质粒pMG36e的p32启动子片段及乳酸乳球菌MG1363未知分泌蛋白(Usp45)基因的核糖体结合位点、分泌信号肽和成熟肽前11个氨基酸的编码序列(SPusp45), 克隆到食品级载体pSH91中, 构建食品级分泌性表达载体pSQ; 克隆报告基因金黄色葡萄球菌核酸酶(NucA)成熟肽的编码序列nucA到pSQ中分泌信号后, 转化乳酸乳球菌MBP71, 构建了乳酸乳球菌食品级分泌性表达系统L lactis/pSQ-nucA; 通过TB-D法和酶谱法检测 L lactis/pSQ-nucA的表达形式、表达量并与以前构建的L lactis/pSQZ-nucA系统表达能力进行比较, 结果发现L lactis/pSQ-nucA能够分泌性表达NucA, 分泌性表达的NucA量大约是胞内NucA的10倍; L lactis/pSQ-nucA的表达量高于lactis/pSQZ-nucA。为进一步目的蛋白的的分泌性表达及食品级疫苗的研制奠定了基础。

摘要:产单核细胞李斯特菌的毒力因子与该菌在细胞间扩散、传播有着直接的关系, 其中肌动蛋白聚集因子ActA是细菌由细胞浆扩散至相邻细胞所必须的因子, 而广谱磷脂酶C则参与具有双层膜吞噬体的裂解过程。[方法]本研究中利用同源重组技术成功构建了毒力因子ActA 和 PC-PLC双缺失的突变株, [目的]并对突变株的毒力和免疫应答潜能进行评价。[结果]Western blot 和磷脂酶活性测定实验, 分别从蛋白质水平上证实actA和plcB基因的缺失。突变株的毒力显著降低, 对小鼠半数致死剂量比野生型菌株提高约103倍, 但仍然保持较好地诱导T细胞应答的能力, 并且能完全保护野生型细菌致死剂量的攻击。实验结果不仅表明ActA 和 PC-PLC是产单核细胞李斯特菌的重要毒力因子, 而且证实安全性提高的突变株依然保持有较强地诱导细胞免疫应答的能力。[结论]因此, 该突变株的获得不仅对李斯特菌病的预防具有重要作用, 而且为构建预防人类和动物疫病的疫苗载体奠定了基础, 此外对于阐明LM毒力因子的致病机理与免疫保护作用提供了条件。

摘要:从大庆油田地层水中分离到一组能高效产生生物表面活性剂的菌株, 采用sfp基因PCR鉴定的方法从中分离到一株芽孢杆菌ZW-3, 该菌株能够产生大量表面活性物质, 采用细菌生理生化鉴定结合16S rDNA序列的系统发育学分析确定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis), 通过薄层层析色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)分析其代谢产物, 初步鉴定为脂肽(Lipopeptide); 该脂肽生物表面活性剂理化性质显示它能使培养基的表面张力从68.92mN/m降低25.19mN/m、原油/水的界面张力从23.53mN/m降低到4.57mN/m, 与1.8%的NaOH溶液复配可以将油水界面张力降低到1.2×10-3mN/m, 其临界胶束浓度为33.3mg/L(3.24×10-5mol/L), 并具有较好的乳化活性和发泡性能, 说明该菌株代谢的脂肽生物表面活性剂在提高石油采收率中具有广泛的应用前景。

摘要:口蹄疫病毒3C蛋白酶在病毒的致病机理、聚蛋白前体的加工和RNA的复制上起着很重要的作用,是当前抗病毒研究的一个重要靶点。本研究从AsiaⅠ型 FMDV适应细胞毒中提取RNA, 用RT-PCR技术扩增3C基因, 首先克隆到pGEM-T载体, 再亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBac B中, 构建出重组转移载体pMel-3C。最后将含有目的基因的转移载体与线性化的杆状病毒DNA共转染Sf9细胞, 通过噬斑筛选和PCR鉴定, 获得了重组杆状病毒。重组病毒经扩增后以10个MOI感染Sf9细胞, 接种病毒72 h后收获细胞, 样品经SDS-PAGE和Western blot证实3C蛋白获得表达, 分子量约23kDa, 与预测蛋白大小一致, 且能被FMDV感染阳性血清所识别。本研究为空衣壳的体外组装及新型抗病毒药物设计的研究奠定了基础。

摘要:RecA/Rad51/RadA家族蛋白是细胞内重要的重组修复蛋白, 在功能上非常保守。研究发现在细菌、真核生物、甲烷古菌和嗜盐古菌细胞内RecA/Rad51/RadA均可以受紫外线辐射诱导转录。而对极端嗜热古菌中的RadA辐射可诱导性仍存在争议。通过体外表达极端嗜热古菌Sulfolobus tokodaii的RadA蛋白, 制备抗体, 利用免疫学方法并结合RT-PCR分析, 对嗜热古菌S. tokodaii中RadA的辐射诱导进行了研究。经过100J/m2和200J/m2 UV辐照处理, radA基因的转录分别上调了2倍和3倍, 同时RadA蛋白的表达分别上升了1.5倍和1倍。实验结果表明S. tokodaii中RadA可以被紫外线辐射诱导表达, 证实了极端嗜热古菌S. tokodaii细胞中存在DNA损伤诱导反应的观点。

摘要:从南海南部陆坡表层沉积物中扩增了细菌和古菌16S rDNA序列, 并对克隆子文库进行系统发育分析。细菌序列以变形杆菌(Proteobacteria)居多, 其次是浮霉菌(Planctomycete)、酸杆菌(Acidobacteria)和candidate division OP10, 另外还有少量铁还原杆菌(Deferrobacteres)、candidate division OP3、OP11、OP8、TM6、疣微菌(Verrucomicrobia)和螺旋体(Spirochaetes)。古菌序列分别来自泉古生菌(Crenarchaeota)和广古生菌(Euryarchaeota), 以Marine Benthic Group B (MBGB)、Marine Crenarchaeotic GroupⅠ(MGⅠ)、Marine Benthic Group D(MBGD)和South African Gold Mine Eu-ryarchaeotic Group(SAGMEG)为主。少量序列为C3、甲烷杆菌(Methanobacteriales )和Novel Eu-ryarchaeotic Group(NEG)。结果表明海底表层沉积物中有丰富多样的微生物群落。

摘要:【目的】以猪源支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica, Bb)百日咳杆菌黏附素(PRN)基因的原核表达产物为抗原建立检测PRN抗体的间接ELISA方法。【方法和结果】利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)表达系统对PRN基因在大肠杆菌中进行融合表达。SDS-PAGE和Western blot 检测证实该基因获得高效表达, 产物易于纯化且具有良好的免疫学活性。通过凝血酶酶切GST-PRN并回收, 获得不含GST载体蛋白的PRN蛋白片段。以PRN蛋白片段为抗原建立检测天然PRN抗体的间接ELISA方法。该方法对猪巴氏杆菌病等7种常见细菌性疾病阳性血清的检测结果均为阴性, 其敏感性比乳胶凝集试验提高4～128倍, 能检测到人工感染14 d后的仔猪血清抗体IgG, 对临床送检的1,229份猪血清的检测阳性率为32.7%。ELISA方法对阳性猪场的监测结果预示了保育期仔猪的合群导致猪群大量感染支气管败血波氏杆菌。【结论】该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点, 可用于猪群PRN抗体水平监测和猪波氏菌病流行病学调查。

摘要:【目的】通过建立的小鼠呼吸道感染模型评价重组百日咳杆菌黏附素蛋白(GST-PRN)对小鼠的免疫保护效力。【方法和结果】在主动免疫保护试验中, GST-PRN免疫组小鼠能产生较高的PRN抗体水平, 在使用3×LD50的支气管败血波氏杆菌HH0809株进行呼吸道气雾攻毒后, 其保护率为100% (20/20), 但载体蛋白GST和PBS对照组小鼠的存活率仅为15% (3/20)和20% (4/20)。在被动免疫保护试验中, 腹腔免疫GST-PRN兔抗血清能100% (10/10)保护小鼠抵抗10×LD50的HH0809株的腹腔攻击, 但GST兔抗血清和PBS免疫组小鼠的存活率均为0 (0/10和0/9)。【结论】研究结表明重组PRN蛋白具有良好的免疫学活性, 可作为亚单位疫苗或疫苗添加成分。

摘要:将猪胸膜肺炎放线杆菌血清3型分离株的ApxⅡA、ApxⅢA、ApxⅣA基因和血清5型分离株的ApxⅠA基因分别克隆到原核表达载体pGEX-5X-3, 并在大肠杆菌BL21中进行表达。SDS-PAGE结果表明重组菌表达的最佳条件为诱导时间2小时和IPTG终浓度1mmol/L。通过硫酸铵盐析和Sephadex G-200凝胶过滤层析纯化表达产物。Western blot检测结果显示表达产物具有免疫活性。按照不同组合将表达产物与弗氏佐剂等比例混合, 制备3种亚单位疫苗。并在30日龄和45日龄免疫小白鼠, 在60日龄分别用血清1、3、5、7和10型胸膜肺炎放线杆菌攻毒。血清1、5和7型胸膜肺炎放线杆菌攻毒后, 3种亚单位疫苗分别提供58.4%、66.6%和91.7%的保护率。试验结果表明重组蛋白具有免疫保护作用, 且含有四种融合蛋白的亚单位疫苗免疫保护效果最佳。

摘要:构建pDsRed-Monomer-C1/vacA N端真核表达载体, 研究幽门螺杆菌空泡毒素单一毒力决定簇对THP-1巨噬细胞细胞因子分泌的影响。PCR扩增vacA目的基因片段, 克隆入真核表达载体pDsRed-Monomer-C1中, 经酶切、PCR及测序鉴定后, 转染 THP-1巨噬细胞中, Western blot和荧光显微镜鉴定VacA蛋白在细胞中的表达; 电子显微镜和中性红摄入法观察巨噬细胞的空泡样变; ELISA法检测巨噬细胞培养上清TNF-a、IL- 1b含量。重组质粒转染THP-1巨噬细胞24h, 部分细胞胞浆中出现大小不等的空泡, 且重组质粒组培养上清中TNF-a、IL-1b含量明显高于空质粒组和阴性对照组(P<0.001), 二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC)下调细胞因子的分泌。结果显示, 成功构建pDsRed-Monomer-C1/vacA真核表达载体; VacA蛋白瞬时高表达上调THP-1巨噬细胞分泌TNF-a、IL-1b; 核因子kB(nuclear factor kappaB, NF-kB)可能参与调节VacA诱导的THP-1巨噬细胞的分泌。

摘要:研究穿透支原体(Mpe)脂质相关膜蛋白(LAMPs)能否诱导小鼠巨噬细胞凋亡, 并阐明其可能的分子机制, 以了解Mpe潜在的致病性。用Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒和DNA Ladder方法检测Mpe LAMPs诱导体外培养的小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞的凋亡。以间接免疫荧光和Western blotting方法检测经Mpe LAMPs处理的小鼠巨噬细胞NF-κB的激活和NF-κB抑制剂吡咯啉烷二甲基硫脲(PDTC)对细胞凋亡的影响。结果表明：Mpe LAMPs能诱导小鼠巨噬细胞发生早期或晚期凋亡; Mpe LAMPs能诱导激活小鼠巨噬细胞的NF-κB, 使其从细胞浆中转位到细胞核内; PDTC能显著地抑制经处理的小鼠巨噬细胞的NF-κB的激活, 且能抑制Mpe LAMPs诱导的巨噬细胞发生凋亡。因此, Mpe LAMPs诱导小鼠巨噬细胞凋亡可能与NF-κB的激活有关, 因而Mpe可能是一个重要的致病因素。

摘要:新城疫是危害养禽业发展的重要传染病。新城疫病毒(NDV)具有高度传染性和高致病性, 融合蛋白(F)的F1/F2 裂解位点存在多个碱性氨基酸并由此形成的泛组织嗜性一直以来被认为是NDV致病的主要决定因素。本研究利用已经构建NDV弱毒LaSota疫苗株反向遗传操作平台, 将LaSota病毒F蛋白的碱裂解位点由GGRQGR↓L分别突变为GRRQRR↓F和GRRQRR↓L, 在未加入TPCK胰酶的情况下分别成功拯救出突变修饰LaSota 疫苗病毒株rL-FmF 和rL-FmL, 通过测定鸡胚平均致死时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)和静脉内致病指数(IVPI)等指标对其毒力进行评估, 结果rL-FmF 和rL-FmL的ICPI值由LaSota的0.36分别上升为1.18和1.05, 但MDT均大于90小时, IVPI仍然均为0, 表明碱裂解位点的突变可显著增强致病力。为了检测外源基因插入对病毒致病力的影响, 进一步以rL-FmF为载体, 分别构建并拯救出表达H5亚型禽流感病毒血凝素HA和增强绿色荧光蛋白EGFP基因的重组病毒rL-FmF-HA和rL-FmF-EGFP, 经测定ICPI分别为0.67和1.10, 但MDT均大于90小时, IVPI仍然均为0。结果表明, 对rLaSota病毒F蛋白裂解位点2个非碱性氨基酸突变为碱性氨基酸, 无论F2蛋白氨基端为F或L, 均可显著增强其脑内接种致病力, 接近中发型毒株标准, 但对静脉内接种致病能力均无显著影响, 而对鸡胚致死能力均保持rLaSota病毒缓发型特点(MDT≥90); 外源基因的重组、表达可不同程度致弱病毒, 其致弱程度与外源基因及其表达产物性质有关。结果提示, 影响NDV致病力不仅仅局限于F蛋白裂解位点氨基酸序列; 通过F裂解位点修饰及HA基因插入可以获得致病力较高但基本接近缓发型标准的重组病毒。

摘要:【目的】探索犬细胞毒性T细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)胞外区作为免疫佐剂的可行性。【方法】根据已发表序列设计引物, 用RT-PCR扩增CTLA-4胞外区编码序列, 用PCR扩增犬细小病毒(canine parvovirus, CPV)VP2蛋白主要抗原表位基因片段VP2S, 将VP2S克隆入含和不含CTLA-4胞外区基因片段的原核表达质粒pQE-31; 用获得的重组质粒pQE-CTLA-4-VP2S和pQE-VP2S转化大肠杆菌, 并进行诱导表达; 用相同剂量的重组蛋白VP2S和CTLA-4-VP2S免疫小鼠, 用间接ELISA和血凝抑制试验比较两个免疫组的抗体水平。【结果】经过30次循环PCR扩增后, 琼脂糖凝胶电泳显示预期大小的扩增产物; 序列测定结果显示, 克隆的毕格犬CTLA-4胞外区与已发表序列的核苷酸同源性为99.2%, 氨基酸序列同源性为98.4%, 结合B7分子的六肽基序(MYPPPY)无变化; VP2S与已发表CPV VP2的核苷酸序列同源性为99%, 氨基酸序列同源性为98.6%; 经IPTG诱导后, 两种重组大肠杆菌表达预期的29kDa VP2S和42kDa CTLA-4-VP2S重组蛋白, 两者均能被CPV抗血清识别; 间接ELISA和血凝抑制试验结果显示, CTLA-4-VP2S免疫组的抗体产生时间为初免后第2周, 抗体高峰期为初免后第4周, 而VP2S免疫组的抗体产生时间为初免后第4周, 抗体高峰期为初免后第5周, 两个试验组高峰期ELISA抗体效价和血凝抑制抗体效价分别相差100倍和10倍。【结论】犬CTLA-4胞外区可作为分子佐剂促进CPV VP2蛋白抗体的产生。

摘要:根据柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv. citri, Xac)独有的蛋白基因序列和锁式探针公共连接序列分别设计特异性的锁式探针及其扩增引物, 优化系列反应条件, 建立了特异性的柑桔溃疡病菌滚环扩增体系。初步检测结果表明该体系能够特异性地检出Xac的菌体细胞及其DNA, 而检测不出供试的其它植物病原细菌和柑桔叶面常见的多种附生细菌; 对Xac靶片段克隆质粒DNA的检测灵敏度为102 copy/mL, 对Xac菌悬液的检测灵敏度为20 cfu/mL, 比常规PCR的检测灵敏度稍高。用滚环扩增技术和常规PCR技术对田间采集的实际样品进行了检测, 两种方法的检测结果没有显著差异(P>0.01)。由于锁式探针的公共连接序列对扩增的条件要求一致, 本体系的建立可以为植物病原微生物多靶标检测和病害检疫检验提供新的技术支撑。

摘要:【目的】建立流式微球一步法快速免疫检测马铃薯A病毒(PVA)的新方法。【方法】以荧光微球为反应载体, 通过在微球表面进行双抗夹心免疫反应形成微球-捕获抗体-PVA-标记FITC检测抗体的复合物, 利用流式细胞仪荧光检测系统收集荧光信号。【结果】通过实验优化检测条件, 最佳捕获抗体工作浓度为4μg/mL、最佳检测抗体工作浓度为1:25倍稀释、最佳反应时间为2h; 与马铃薯Y病毒、莴苣花叶病毒、番茄环斑病毒等均未出现交叉反应; 阳性样品经64倍稀释后依然可检出, 检测灵敏度是传统微孔板ELISA的4倍。【结论】流式微球一步法能灵敏、快速、简便的检测马铃薯A病毒。

摘要:为了在Epstein-Barr病毒(EBV)172kb的基因组中引入突变以研究基因功能, 建立了一种简单有效的基因操作方法。在载体pcDNA3.1(+)上操作, 将两端含有重组蛋白FLP识别位点(FRT)的卡那霉素筛选标记基因(kan)与鼻咽癌(NPC)来源的、包含LMP1基因全长ORF的gDNA“无缝”连接(无外源序列插入)。连接后的kan-LMP1线性DNA片段经转化、由λ噬菌体中redαβγ系统介导在E.coli中发生同源重组(ET克隆), 用kan-LMP1替代了BAC-EBV(p2089)中相应的LMP1基因区域, 然后经过重组蛋白FLP对FRT-kan-FRT特异性的识别, 切除了引入的kan基因, 留下一个69bp的FRT“疤痕”。通过抗性筛选和对菌液进行PCR扩增可以鉴定突变子。这种经改进并程序化的方法, 也适应于引入其它突变或在其它BAC-疱疹病毒基因组中引入突变。

摘要:通过分泌和感知一系列信号分子, 细菌能够根据自身菌体密度的变化调控基因的表达, 从而控制一系列重要的表现型, 包括毒力因子的产生, 生物膜的形成以及菌体发光等。这种广泛存在的信号机制被称为群体感应。在沙雷氏菌种中已经发现了多套群体感应机制。粘质沙雷氏菌AS-1从土壤中分离, 其中含有LuxI/LuxR 的同类蛋白, 被称为 SpnI/SpnR。粘质沙雷氏菌AS-1合成AHLs分子N-hexanoyl-L-homoserine lactone (C6-HSL) 和N-(3-oxohexanoyl)-L- homoserine lactone (3-oxo-C6-HSL)作为其信号分子, 通过群体感应感知菌体密度来控制基因的表达。通过基因替代的方法制得了spnR基因破坏的变异株, 命名为粘质沙雷氏菌AS-1R。对粘质沙雷氏菌AS-1R的研究表明SpnR蛋白消极的调控沙雷氏菌红色色素的产生, 运动性以及生物膜的形成等一系列由群体感应控制的性状; 另一方面, 作为一种天然的群体感应抑制剂, 卤化呋喃能够有效的抑制粘质沙雷氏菌AS-1的群体感应, 但并不干扰AHL-SpnR的相互作用。为运用粘质沙雷氏菌群体感应调节抑制其致病性提供了方法和依据, 同时也为卤化呋喃对群体感应抑制机理的研究提供了新的思路。

摘要:从山西太原晋阳湖水样中分离得到一株能以甲烷为唯一碳源生长的菌株 ME16。气相色谱分析表明ME16菌株能利用甲烷。ME16菌株的16S rDNA序列与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, ATCC 10145, AF094713)相似性为99%。该菌株最适培养条件为30℃、2%接种量、25%甲烷含量和培养基pH为6.0。用电化学法研究了ME16固定化细胞体系中不同含量甲烷对溶氧的响应时间以及溶氧变化与甲烷含量的关系。结果表明, 加入固定化细胞后, 溶氧变化在100s内达到平衡, 溶氧消耗量与通入甲烷气体含量在0~16%呈线性关系, 相关系数为0.9954。对样品气体8次测量, RSD为3.34%, 表明该反应体系重现性良好, 为该菌株进一步研究甲烷传感器奠定基础。

摘要:抗癌药物紫杉醇已在临床上广泛应用, 但受原料红豆杉树木短缺的制约, 存在巨大的供需差距, 而内生真菌发酵生产紫杉醇是解决紫杉醇药源问题的很有前景的途径之一。结合课题组多年来开展的科学试验研究工作, 概述了内生真菌发酵生产紫杉醇的优势、产紫杉醇内生真菌的分离研究现状和生物多样性及提高内生真菌生物合成紫杉醇量的途径。

摘要:砷广泛分布于自然界中, 近年来砷污染及砷中毒事件在全球范围内的频繁发生, 严重威胁着全球上千万人口的健康。砷的迁移与转化等地球化学行为的研究对探明环境中砷的来源以及砷污染整治的方法至关重要。越来越多的研究表明, 自然界中的微生物广泛参与了砷的地球化学循环, 在砷的迁移与转化过程中起到关键作用。综述了近年来砷的微生物转化及其相关酶类与编码基因等的研究进展, 同时结合作者的工作分析与展望了砷的微生物转化在环境与医学中的应用前景。

摘要:杆菌属的芽胞作为益生菌已经应用于人和动物的食品生产和细菌疗法。目前, 芽胞作为一种新型的疫苗载体, 开始用于破伤风、炭疽等疫苗的研究。与目前的第二代疫苗相比, 细菌芽胞热稳定性好, 遗传操作方便, 是一种理想的疫苗载体。本文就其作为疫苗载体的相关研究进行综述。