摘要:

摘要:【目的】利用16S rRNA和HSP60基因分子标记分析鉴定形态分类特征不稳定的粘细菌种属。【方法】利用粘细菌的传统分离纯化方法从土壤中分离粘细菌，根据菌株的形态特征进行分类，PCR方法扩增菌株的16S rRNA和HSP60基因序列并进行系统发育关系分析。【结果】根据形态特征，分离得到的15株粘细菌菌株归入孢囊杆菌亚目（Cystobacterineae）的2个科3个属。其中11株粘细菌具有典型的所在种属的子实体结构，而菌株0085-4、0121-3、NM03和Myx9736的子实体结构发生了不同程度退化。15株粘细菌的16S rRNA基因序列的相似性在95.4%到99.5%之间。而HSP60基因序列差异较大。【结论】在属水平上，粘细菌形态分类特征和16S rRNA基因系统进化关系具有很好的一致性；在揭示粘细菌种间系统发育关系中，HSP60基因序列更为适用。

摘要:目的】本研究旨在采用不同的PCR引物对广东省恩平市金山温泉的高温水底沉积物微生物多样性进行初步的分析。【方法】采用改进的玻璃珠法抽提温泉沉积物中环境基因组DNA，通过对用4对引物分别扩增得到的原核微生物16S rRNA基因和真核微生物ITS序列的分析，将所得到的数据与国际基因数据库GenBank进行相似性比较并构建系统发育树。【结果】研究发现原核类群G的 14个优势克隆中7个都属于蛭弧菌属（Bdellovibrio）。与它们最相似的序列是从海洋中分离到的两个菌株 Bacteriovorax sp. NE1 (EF092445)和Bdellovibrio sp. JS5 (AF084859)，相似性分别为96％和99％。原核类群X的4个序列主要属于蓝细菌类群，其中JS－X2与在美国黄石公园温泉发现的Uncultured Cyanobacterium (L35331)有95％的相似性，并且与已经全基因组测序的嗜热蓝细菌聚球藻Thermosynechococcus elongatus BP-1 (47118315)有89％的相似性。真核类群Z有三个类群，分别是Penicillium sp.，Lodderomyces sp.和Gloeotinia sp.。其中大部分序列与青霉属相似性在88％~ 90％之间。【结论】所得到的结果显示金山温泉中的微生物多样性十分丰富。

摘要:【目的】揭示金沙江干热河谷区这一特殊地理环境下田菁根瘤菌的多样性和系统发育地位。 【方法】采用了数值分类、16S rDNA PCR-RFLP、16S rDNA和GSⅡ序列分析方法。【结果】数值分类结果表明：在93%的水平上，待测菌株分布于6个群，其中4个群分别与R.tropici、 R.etli、 S.saheli、A.rubi的参比菌株聚在一起，两个群没有参比菌株与之聚群。16S rDNA PCR-RFLP结果与数值分类基本一致，只有两个独立群有所差异。16S rDNA序列分析表明：两独立群中心菌株SCAU176 和SCAU144与R.huautlense聚在一起，与该种同源性分别为100%和98.9%。GSⅡ序列分析中SCAU176 和SCAU144单独聚在一起，与最近的参比菌株R.tropici的同源性系数在90%以下。【结论】金沙江干热河谷区田菁根瘤菌具有较为丰富的多样性，在系统发育地位上分布于Sinorhizobium、Agrobacterium和Rhizobium三个属。

摘要:苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白Cry1Ca7对重要的农业害虫甜菜夜蛾具有较高毒力。【目的】本文的研究目的是通过定点突变的方法获得毒力发生改变的毒蛋白，为下一步研究工作提供有价值的实验材料。【方法】利用重叠引物PCR技术对cry1Ca7基因进行定点突变，获得了10种突变基因，通过生物活性测定的方法确定了各突变基因表达产物对甜菜夜蛾的杀虫活性。【结果】活性降低的突变毒蛋白有G138S，T221D，T221R，N251S，439GGT440，N306R，W376F，R522E和 R570G，其中，位于DomainⅡ内的突变的活性依次是439GGT440

摘要:【目的】克隆、表达小麦蓝矮病(WBD)植原体胸苷酸激酶基因(tmk)，并分析酶活性，进一步研究胸苷酸激酶在植原体感染宿主及繁殖过程中的功能和作用机理，更好地防治植原体病害。【方法】PCR方法扩增tmk基因并进行序列分析，连接pET30a(+)表达载体后原核表达，经Ni-NTA柱层析纯化后进行酶催化活性分析。【结果】首次从小麦蓝矮病(WBD)植原体基因组中分离出胸苷酸激酶基因(tmk)，该基因包含tmk-1和tmk-2两种，大小分别为630 bp和624 bp，其编码的氨基酸序列均包含3个与结合NTP/NMP相关的保守功能区。表达的融合蛋白TMK-1活性极低，酶活仅16.4 U/mg，而 TMK-2酶活高达112.41 U/mg，且其最适催化条件为32℃、pH 7.3、1.5 mmol/L Mg2+ 和 1 mmol/L ATP。【结论】分析了胸苷酸激酶活性中心的一级结构序列及其催化活性随条件变化而改变的性质，为深入研究小麦蓝矮病植原体胸苷酸激酶在侵染寄主及其在宿主体内增殖的转录性质奠定基础。

摘要:【目的】为了探讨高致病性禽流感病毒对水禽致病性差异的分子致病机理。【方法】我们对从野鸭分离到的H5N1亚型禽流感病毒的生物学特性进行鉴定，其中A/mallard/Huadong/Y/2003(Y)是对麻鸭无致病性病毒，而 A/mallard/Huadong/S/2005(S)是对麻鸭高致病性病毒。利用反向遗传技术构建一系列单个和多个基因组合替换基因重排病毒，并验证重排病毒在麻鸭上的致病力。【结果】研究表明，PB2, PB1, PA(3P), HA单基因以及3P基因组合替换的使S病毒对麻鸭的毒力完全致弱，但相应的基因替换后仅使Y病毒对麻鸭的毒力略有上升。两病毒的其它基因对毒力影响较小。【结论】H5N1亚型禽流感病毒对麻鸭的致病力受多基因调控，且这种调控作用在不同病毒骨架上的影响不一致，强毒受影响程度远比弱毒的大。

摘要:【目的】从新疆石河子市一处碱性工业污水（pH11.0）分离﹑鉴定高产碱性淀粉酶菌株，并对其所产酶酶学特性进行研究。【方法】在碱性淀粉酶分离培养基上对所分离菌株进行筛选，分离到一株高产碱性淀粉酶菌株，并将其编号XJU-3。应用生理生化试验，脂肪酸含量，16S rDNA序列以及(G+C) mol％含量等方法对菌株进行鉴定，同时对XJU-3所产碱性淀粉酶的生物学特性进行研究。【结果】 XJU-3可在pH4.0~12.5的LB培养基上生长,最适生长温度37℃。16S rDNA序列构建的系统进化树表明XJU-3与Bacillus flexus类聚在一起，且序列同源性为99%。该菌产生的淀粉酶最适pH10.0，最适温度40℃，且在pH9.0~13.0内有较高活性和稳定性。Co2+和Mg2+能明显提高酶的活性。【结论】 XJU-3被鉴定为Bacillus flexus，由于XJU-3与B. flexus DSM 1320T在尿素水解和优势脂肪酸含量上有差异，且具有宽范围pH耐受性，因此XJU-3被认为是B.flexus的一个新菌株。XJU-3所产的碱性淀粉酶酶学特性良好，具有极大的工业应用潜力。

摘要:【目的】本研究的目的是优化Pseudoalteromonas sp. AJ5菌株的培养条件使之产生高活性的胞外k-卡拉胶酶。【方法】通过富集培养技术从刺参肠道分离出一株卡拉胶降解菌AJ5，该菌株能利用卡拉胶作为惟一碳源和能源。依据形态学和生理学特征及16S rRNA基因序列分析，将该菌株鉴定为假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）。通过单因素试验和正交试验对Pseudoalteromonas sp. AJ5菌株产胞外k-卡拉胶酶的培养条件进行了优化。【结果】单因素试验结果表明，Pseudoalteromonas sp. AJ5菌株的最佳培养条件为250 mL三角瓶装入75 mL发酵培养基、摇床转速150 r/min、接种量7%、pH8.0。单因素试验和正交试验结果显示该菌株的最佳培养基组成为k-卡拉胶 1 g/L、牛肉膏2 g/L、 NaCl 20 g/L、K2HPO4·3H2O 1 g/L、 MgSO4·7H2O 0.5 g/L、 MnCl2· 4H2O 0.2 g/L、 FePO4 · 4H2O 0.01 g/L； 培养温度为28℃，培养时间为28 h。【结论】Pseudoalteromonas sp. AJ5菌株分泌胞外k-卡拉胶酶，在最佳培养条件下，该菌株的k-卡拉胶酶活力比优化前提高了4倍。

摘要:【目的】从棉花黄萎病真菌Verticillium dahliae中克隆木聚糖酶基因，并在毕赤酵母中进行异源表达，研究酶学性质。【方法】通过多序列比对设计简并引物，扩增出真菌V. dahliae木聚糖酶基因片段，再采用基因组步行PCR技术获得全长木聚糖酶基因序列。经BLAST比对并结合GT-AG原则分析，该基因含有一个大小为63 bp的内含子，利用DpnI介导的缺失方法对含内含子的全长木聚糖酶基因进行剪接，获得该基因的全长cDNA。将克隆到的cDNA在毕赤酵母GS115进行了表达，重组酶经纯化后进行酶学性质分析。【结果】BLAST比对显示，该cDNA推测的氨基酸序列和已知木聚糖酶的最高一致性为72%。测得该酶最适反应温度为45℃，最适反应pH值为6，在pH5-9维持50%以上的活性，对山毛榉材木聚糖具有最好的水解效果。Mg2+和Ca2+对酶有激活作用，分别提高了33.7%和16.6%，EDTA，b-巯基乙醇和NaN3对酶的活性基本没有影响，Tween-80和DMSO使酶活性提高了28.4%和12.8%。【结论】本文从引起棉花黄萎病的真菌V. dahliae中克隆到的木聚糖酶基因是在GenBank上登录的第一个来自棉花黄萎病真菌的木聚糖酶基因序列。本文所用的克隆方法可以高效的从植物病原真菌和白腐真菌克隆只含一个内含子的11家族的新木聚糖酶基因，避免了摸索原始菌株酶表达诱导条件，检测酶的活性等繁琐的操作。酶学性质分析显示该酶在低聚木糖的制备，面包改良上有潜在的应用价值。

摘要:【目的】为了了解天然毛竹林根际可培养微生物种群的多样性信息，【方法】采用稀释平板法，对浙江天目山和重庆缙云山天然毛竹林根际细菌和放线菌进行了分离，并对其16S rDNA序列进行了分析。【结果】分别从天目山和缙云山天然毛竹林根际分离得到51株和31株菌落形态差异的细菌和放线菌。16S rDNA序列分析表明，天目山和缙云山毛竹根际细菌主要包括厚壁菌门（Firmicutes，分别为40%和58%）、放线菌门（Actinobacteria，分别为36.7%和10.52%）、变形菌门a亚群（Alphaproteobacteria，分别为10%和5.26%）和变形菌门 g 亚群（Gammaproteobacteria，分别为10%和26.32%），其中芽孢杆菌属（Bacillus sp.）为共同的优势菌属（分别为34.38%和42.11%）。分离的菌株中，B188、B171和B152等6株与GenBank中已报道16S rRNA基因序列的相似性从90%到96%不等，可能代表着新属或种。【结论】这表明，天然毛竹林根际具有较为丰富的可培养微生物种群多样性，并存在一些潜在的新的微生物菌种资源。

摘要:【目的】弧菌是水产养殖生物中常见的病原菌，本研究旨在寻求水产养殖病害可能的生物防治途径。【方法】本文于2006年春季、2005年秋季从沿岸海水及淡水湖采样，通过“双层平板法”分离裂解性弧菌噬菌体；对噬菌体及宿主进行电镜形态观测，同时采用16S rDNA分子测序技术鉴定宿主，并对噬菌体进行生理特性测定。【结果】从10个样品中分离出96株弧菌、2株裂解性噬菌体(Vibrio/XM/P1、Vibrio/XM/P2)，噬菌体宿主分别属于Vibrio alginolyticus（溶澡弧菌）和Vibrio anguillarum（鳗弧菌）；噬菌体头部都呈六边形，Vibrio/XM/P2有尾；两株噬菌体活性最适pH分别为7、8，最适温度分别为25℃、30℃，并都对高温和紫外线敏感；Vibrio/XM/P1对乙醚、氯仿不敏感，Vibrio/XM/P2对乙醚、氯仿敏感。

摘要:【目的】进一步研究鸡Mx蛋白第631位氨基酸的变异与鸡群抗病性的相关性。【方法】本实验利用PCR突变技术将鸡Mx蛋白基因的全长cDNA第2032位的碱基由G突变为A（既631位氨基酸的改变），并将突变的Mx基因插入真核表达载体pcDNA3.0，重组表达载体转染COS-Ⅰ细胞后，进行RT-PCR与间接免疫荧光（IFA）鉴定。【结果】对鸡Mx蛋白基因的cDNA进行PCR诱变修饰正确，构建了能够正确表达鸡Mx蛋白的重组真核表达载体；诱变修饰重组Mx蛋白对抗新城疫病毒（NDV）感染分析结果显示，重组Mx蛋白具有较强的抗新城疫病毒生物活性。【结论】为下一步研究鸡Mx蛋白的抗病机理与制备抗病转基因鸡奠定了坚实的基础。

摘要:【目的】口蹄疫病毒（FMDV）非结构蛋白（NSP）3A、3B和2C基因的表达及产物纯化与活性检测。【方法】利用原核表达系统表达了FMDV NSP 3A、3B和富含B细胞抗原位点序列的2C蛋白。利用高浓度尿素裂解包涵体，采用稀释法和氧化型、还原型谷胱甘肽系统相结合方法对2C蛋白进行复性。用金属鳌合亲合层析的方法对表达的FMDV NSP 3A、3B和2C进行纯化。采用ELISA方法对比检测了3种纯化蛋白在检测羊血清NSP抗体的效果。【结果】检测得知3A和3B为可溶性表达蛋白，2C以包涵体形式表达。通过Western-blot分析，表明纯化后蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应。纯化的3A、3B和复性后的2C融合蛋白与3ABC抗原的检测结果具有很高的符合性。【结论】该研究为建立鉴别FMDV自然感染动物和灭活疫苗免疫动物的酶联免疫电转移印迹技术（EITB）提供了所需的材料。

摘要:【目的】人和动物腹泻的主要病原菌为大肠杆菌，本文主要研究贵州省致腹泻大肠杆菌毒力因子的分布类型。【方法】采用PCR技术对各毒力因子的基因分布进行研究。【结果】共分离到333株大肠杆菌，其中产肠毒素大肠杆菌（ETEC）在腹泻的人、猪、牛群中占优势，分别为：人群73（n=112），猪群82（n=106），牛群18（n=115）。在ETEC菌株中检测到热敏肠毒素（lt）和不耐热肠毒素（st）基因，还存在lt/st并存现象。从人、猪、牛群中还检测到产志贺样毒素大肠杆菌（STEC），其中源自猪的STEC的检出率最高。大部分STEC同时携带lt、st或lt和st同时并存。编码F18菌毛的主亚基由fedA基因编码。对所分离大肠杆菌F18菌毛进行的研究结果表明，fedA基因主要与肠毒素基因共存，与stx基因并存的类型较少，25份猪源STEC菌株中仅有4份检测到fedA基因。【结论】贵州省人群、猪群和牛群致腹泻病原菌中以带F18菌毛的ETEC为主，STEC主要分布在腹泻的猪群中。

摘要:【目的】马传染性贫血病毒（EIAV）弱毒疫苗致弱机制和免疫保护机理的研究可以为慢病毒疫苗的研究提供重要的模型。为探讨IFN-g 表达水平与疫苗保护性免疫的关系，本研究旨在建立一种准确、有效地检测EIAV感染马不同T细胞亚型表达IFN-g 水平的方法。【方法】我们将分离的马传贫弱毒疫苗免疫马（FDDV）、强毒感染马（LV）和健康马的外周血单核细胞(PBMC)，体外分别经病毒（FDDV）和PMA/Inomycin激活、 BFA 阻断蛋白分泌、荧光标记马的特异性表面抗体和IFN-g 抗体等过程后，进行流式检测。【结果】疫苗免疫马产生的特异性IFN-g 水平为CD4+1.7±0.9%/CD8+ 6.1±1.2%，而强毒组则为CD4+ 0.6±0.1%/CD8+ 2.4±0.9%。【结论】本研究建立的多荧光参数流式细胞术同时检测细胞内IFN-g 染色和淋巴细胞亚型的方法，具有良好的特异性，稳定性和重复性。为研究EIAV弱毒疫苗免疫保护机制奠定了基础。

摘要:本文以稻瘟菌菌丝体为材料提取RNA，【目的】改进张学敏等人的方法，通过磁珠构建稻瘟菌cDNA文库，并用于下一步研究稻瘟菌与水稻之间的互作关系。【方法】通过共价键连接的寡聚oligo（dT）磁珠纯化mRNA，并以磁珠上的oligo（dT）为引物引导第一链cDNA的合成，再利用末端转移酶加尾法合成第二链cDNA。构建过程中避免使用限制酶和连接接头。【结果】用此方法构建的文库容量为8.9×107cfu，滴度为8.9×106 cfu/mL，随机挑取的25个克隆插入片断平均大小达到1380bp。【结论】实验结果表明用改进的方法可构建高质量的cDNA文库，并且方便快捷，所用材料少，构建时间短，利于大规模的功能基因分析。

摘要:火鸡疱疹病毒（HVT）为一种a疱疹病毒，因其与马立克氏病病毒（MDV）抗原相关性而被广泛用作预防马立克氏病（MD）的活疫苗。【目的】本研究的目的是构建HVT全基因组感染性细菌人工染色体（BAC）。【方法】利用Eco-gpt (黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶) 基因和BAC载体pBeloBAC11的基本功能序列，构建重组病毒转移载体pGAB-gpt-BAC11。通过将pGAB-gpt-BAC11与HVT感染细胞总DNA共转染原代鸡胚成纤维细胞（CEF），待出现病毒噬斑后，利用霉酚酸（MPA）阻断核酸代谢途径，经过筛选获得纯化的重组病毒purified-rHVT。提取purified-rHVT感染细胞总DNA电转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，在氯霉素抗性平板上筛选阳性克隆，并用酶切和PCR方法对其进行鉴定。随机选取BAC克隆提取BAC DNA转染次代CEF，完成HVT重组病毒的拯救。【结果】经过6轮筛选后获得纯化的重组病毒，并筛选到25个BAC分子克隆化病毒。其中BAC6、BAC8和BAC10再次启动病毒感染，产生与野生型HVT感染CEF相似的病毒噬斑形态，说明已经获得拯救出的HVT重组病毒。【结论】本研究构建了HVT全基因组感染性细菌人工染色体，建立了HVT反向遗传操作技术平台。

摘要:【目的】研究植物乳杆菌ZJ316生长和产细菌素的最佳培养基成分和发酵条件，以提高该菌产plantaricin ZJ316的能力。【方法】 改变培养基成份和发酵条件，考察不同氮源、碳源等培养基成分和不同的发酵温度等条件对ZJ316生长和产细菌素的影响。【结果】 最佳培养基为MRS培养基；优化后的培养基配方为葡萄糖10 g/L，麦芽糖10 g/L，酵母提取物10 g/L，蛋白胨10 g/L，柠檬酸三铵2 g/L，吐温80为1 mL/L，K2HPO4·3H2O 6 g/L，乙酸钠5 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05 g/L。培养基初始pH6.5，30℃静置培养24 h。【结论】通过培养基成分和发酵条件的优化，细菌素产量提高了2.3倍，为进一步研究和规模化生产奠定基础。

摘要:【目的】筛选高抗草甘膦菌株并对其进行鉴定和特性研究。【方法】从草甘膦极端污染土壤中分离高抗草甘膦菌株，并检测其草甘膦耐受能力，最适生长pH和抗生素抗性。通过生理生化特征和分子生物学特征的测定对该菌株进行鉴定。【结果】从草甘膦极端污染土壤中分离到一株高抗草甘膦的菌株SL06500，该菌株最高耐受草甘膦浓度为500 mmol/L，并且在200~500 mmol/L之间，菌株生长迅速，最适生长pH为4.0，具有氨苄青霉素、卡那霉素、四环素和氯霉素抗性。用16S rDNA的通用引物，经PCR扩增、测序得到SL06500的16S rDNA序列，该序列在GenBank的登录号为EU006066。将此序列经NCBI Blast进行核苷酸比对发现SL06500与无色杆菌属（Achromobacter）和产碱杆菌属（Alcaligenes）的Identity值均为99%。按照1994年版伯杰氏鉴定细菌学手册的命名规则，结合生理生化指标测定的结果，将菌株命名为木糖氧化产碱杆菌木糖氧化亚种SL06500 (Alcaligenes xylosoxidans subsp.xylosoxidans SL06500)。【结论】该菌株的较高草甘膦抗性和嗜药性的特点值得我们进行进一步的研究。更重要的是，这是首次关于木糖氧化产碱杆菌木糖氧化亚种草甘膦抗性的报道。

摘要:【目的】本研究对枯草杆菌ylyA基因进行荧光标记以便对其产物YlyA在菌体中的位置进行初步观察。【方法】以不同菌株基因组DNA为模板，对ylyA基因进行PCR扩增和序列分析；重新设计引物扩增全长的ylyA并将其克隆到载体pSG1729中，形成gfpmut1-ylyA融合而构建重组载体pNG426；将pNG426转化枯草杆菌168菌株，双交换使gfpmut1-ylyA插入染色体的amyE位点，用碘染色法和菌落PCR对阳性转化子BS363进行鉴定。NA固体培养基上生长的BS363经0.5%木糖诱导表达后，利用表面荧光显微镜技术进行观察。【结果】通过对多个PCR产物的序列分析确定了ylyA基因的正确序列以及正确的翻译起始位点；成功将重组载体pNG426转化枯草杆菌得到了BS363菌株；荧光检测结果表明GFP标记的YlyA分布于菌体的外周，在位置上靠近细胞膜并与之平行排列。【结论】生长缓慢的BS363菌体，在0.5%木糖诱导下产生的荧光标记YlyA蛋白分布在细胞外周，可能在膜生物学中发挥作用。

摘要:【目的】观察比较鼠脑复壮前后狂犬病毒的形态变化，并观察病毒感染BHK-21细胞后不同时间的形态发生情况。【方法】以保存时间较长的SRV9毒株为原始材料，经乳鼠脑传代复壮后接种BHK-21细胞，浓缩、纯化后观察。【结果】（1）未经复壮的病毒中DI粒子占较高比例，典型粒子只占少数，而复壮后典型粒子所占比例升高到病毒粒子总数的90%。（2）感染24h后在细胞浆内可以观察到典型病毒粒子，其数量随着培养时间的延长而增加。带毒传代之后的培养过程中细胞内病毒数量增加不明显。（3）病毒可以在细胞内的空泡膜表面以多种方式成堆出芽。【结论】（1）鼠脑复壮可恢复狂犬病毒中典型粒子所占比例。（2）带毒传代1~2次时为狂犬病毒收获的最佳时机。（3）本研究为狂犬病毒的装配机制补充了数据。

摘要:Sigma B（sB）是许多革兰氏阳性菌对环境胁迫产生应答反应的主要调控因子。不仅在芽孢形成中具有重要作用，而且sB也直接或间接地调控包括蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）在内的一些革兰氏阳性食源性致病菌毒力及毒力相关基因的表达。本文结合作者在国内外的相关工作，综述了sB活性的调节方式及其在上述革兰氏阳性食源性致病菌中相关作用的最新研究进展，为深入研究革兰氏阳性食源性致病菌的致病机理、预防和治疗细菌感染提供新的思路和理论依据。

摘要:Supported by the National Natural Science Foundation of China (30770114) and the Program for Changjiang Scholars and Innovative Research Team in University (IRT0532).