摘要:

摘要:摘要：反刍动物瘤胃是公认的木质纤维素高效降解的天然反应器，对瘤胃微生物的研究成为开发生物能源的热点领域之一。其研究手段已经从传统的依赖分离培养从瘤胃中获得木质纤维素降解菌，并对降解菌中的木质纤维素降解酶逐一分析，发展到通过基因组/元基因组技术，直接从瘤胃中发现获得大量新的木质纤维素降解酶基因/基因簇，进而探讨其降解的分子机理。已有的研究结果表明，瘤胃微生物降解木质纤维素的过程非常复杂，其中涉及到大量不同种类的微生物、酶及基因/基因簇，随着新分析技术的建立和完善，对这些微生物、酶和基因的研究已取得了诸多进展。本论文综述报道了近期有关该方向的研究进展。

摘要:摘要：γ-内酰胺酶属于酰胺酶，其中的（+）γ-内酰胺酶能够高效率的动力学拆分外消旋体γ-内酰胺，获得光学纯的（-）γ-内酰胺。光学纯的（-）γ-内酰胺是制备抗病毒药物碳环核苷化合物的重要手性中间体。目前报道共有7个来源于微生物的γ-内酰胺酶，其中来源于Aureoacterium sp.的（-）γ-内酰胺酶的晶体结构获得了解析。根据晶体结构推测的（-）γ-内酰胺酶的催化机理与α/β水解酶超家族的催化机理是类似的。但是，目前还没有（+）γ-内酰胺酶的晶体结构模型的数据及机理的描述。γ-内酰胺酶的研究方向主要包括γ-内酰胺酶的蛋白质工程改造，对不同对映体选择性的γ-内酰胺酶的催化机理的阐述，以及γ-内酰胺酶在生物体内的功能研究。

摘要:摘要：【目的】为了从放线菌发现新的药物先导化合物，研究了川滇4个地区的放线菌多样性及其生物活性。【方法】采集250份土样，用4种培养基分离放线菌；从中选择98株代表菌进行了初步分类鉴定；采用琼脂扩散法，检测了169株放线菌对4种细菌和7种农作物致病真菌的抑菌活性；利用特异性引物扩增法，测定了它们产生的聚酮合酶(PKSI、PKSⅡ)基因、非核糖体多肽合成酶(NRPS)基因和多烯类化合物合成酶(CYP)基因。【结果】黄荆老林的放线菌有13个属，峨眉山、青城山仅5个属，九寨沟9个属，西双版纳达20个属；不同地区的放线菌具有抗菌活性的菌株平均约占10%；有27%－36%的菌株产生PKSI、II、NRPS、CPY化合物合成基因。【结论】在采集样品的地区中，人类干扰越少，放线菌的多样性越高。分离放线菌时，使用“极端”条件，虽然分离到的放线菌数量可能不多，但获得未知菌的比例较大。添加抑制剂可减少革兰氏阴性细菌和真菌，有利于分离放线菌。

摘要:摘要：【目的】中药骆驼蓬含多种生物碱，对动物有毒性。生活于荒漠半荒漠的骆驼可采食部分有毒植物而不中毒。为了解骆驼瘤胃微生物对骆驼蓬植物毒素的耐受与降解能力进行本研究。【方法】以含100 mg/L纯品去氢骆驼蓬碱的M98-5培养基接种骆驼瘤胃内容物，经五代胁迫培养后分离可耐受/降解去氢骆驼蓬碱的细菌，以薄层析法检验其降解活力，以16S rRNA序列分析其进化地位。【结果】29个分离株中15株具有降解去氢骆驼蓬碱活性；16S rRNA序列分析显示，属于乳杆菌属（Lactobacillus）16株，占55%；志贺氏菌属（Shigella）7株，占24%；芽孢杆菌属（Bacillus）4株，占13.8%；肠球菌属（Enterococcus）和巨型肠球菌属（Megasphaera）各1株。【结论】可耐受/降解去氢骆驼蓬碱的骆驼瘤胃细菌仅限于少数几类，且检测到的具有降解活力的只有乳杆菌类。

摘要:摘要：本室从西藏采集的土壤样品中分离到了一批链霉菌，利用脉冲电泳确定了其中5株链霉菌含有较小的线型质粒。【目的】克隆、测序和分析5个线型质粒的端粒。【方法】采用改良的“在凝胶中进行DNA碱处理和限制性内切酶酶切”的方法来克隆线型质粒的端粒DNA。【结果】克隆和测序了5个线型质粒的端粒DNA。通过与链霉菌典型端粒进行比较，发现这5个新的线型质粒的端粒序列同样含有多个回文序列。但是有的端粒保守的回文序列I不一定能够“折返”与内部序列配对形成“超级发卡”结构，回文序列的“突出环”不一定都为3 nt。【结论】采用改良的方法克隆和鉴定了5个线型质粒新的端粒序列，这些新端粒的特征暗示：回文序列I的“折返”和3 nt的回文序列的“突出环”不是端粒复制必需的。

摘要:摘要:【目的】建立新型大环内酯类抗生素台勾霉素的生产菌指孢囊菌Dactylosporangium aurantiacum NRRL 18085的遗传操作体系，实现台勾霉素相关生物合成基因的敲除突变。【方法】以整合型质粒pSET152为载体，建立了外源DNA通过接合转移进入指孢囊菌NRRL 18085的操作方法和培养条件，利用PCR-targeting系统在体外构建了一个台勾霉素卤化酶基因敲除的cosmid质粒，通过接合转移转入到指孢囊菌NRRL 18085野生菌中。【结果】获得了台勾霉素卤化酶基因敲除的指孢囊菌NRRL 18085的双交换突变株，该突变株失去了产生台勾霉素的能力。【结论】成功建立和优化了指孢囊菌NRRL 18085菌株的遗传操作体系，使得在体内分析和鉴定台勾霉素生物合成基因的功能成为可能，同时也为建立其他类似放线菌的遗传操作体系提供了参考。

摘要:摘要：【目的】研究环境胁迫对珊瑚共附生真菌Aspergillus ochraceus的次生代谢的影响，寻找活性代谢产物。【方法】采用仿生培养和高盐胁迫两种不同的发酵条件对菌株进行液体大发酵，运用HPLC指纹图谱考察发酵产物的化学多样性，采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱和HPLC等方法对发酵产物进行分离、纯化，运用波谱和Mosher方法鉴定化合物的结构。【结果】发现菌株在两种环境胁迫条件下产生了不同的次生代谢产物，从中分别鉴定了4个（1–4）和1个主要化合物5：R(–)- mellein (1)、(5,6-trans, 8,9-threo-)-9-chloro-8-hydroxy-8,9-deoxyaspyrone (2)、(5,6-erythro-, 8,9-threo-)-9-chloro-8-hydroxy-8,9- deoxyasperlactone (3)、(5S,6R,9S)-dihydroaspyrone (4)和R(+)-semi-vioxanthin (5)。【结论】环境胁迫可以诱导海洋微生物产生不同的次生代谢产物，仿生培养是从海洋微生物中获得氯代产物的有效途径。

摘要:摘要：【目的】通过构建酿酒酵母类丙酮酸脱羧酶基因（YDL080C）缺失的工程菌株，研究该基因对酿酒酵母浓醪发酵产高级醇特别是异戊醇的影响。【方法】以酿酒酵母工业菌株AY-15的单倍体a-8或α-22的基因组DNA为模板，PCR分别扩增YDL080C上下游非编码区片段YA和YB；以pUG6质粒为模板，PCR扩增KanMX抗性基因片段。分别将YA、YB和KanMX片段连入pUC19载体，构建重组质粒pUC-YABK；并以其为模板，PCR扩增YA-KanMX-YB重组盒，分别电转化单倍体a-8和α-22。将转化子和亲本分别进行酒精浓醪发酵，发酵结束后测定其发酵性能和高级醇的生成量。【结果】筛选获得了YDL080C基因缺失突变株。酒精发酵后发酵性能和高级醇测定结果显示，转化子的异戊醇及总高级醇生成量与对应的单倍体亲本相比没有明显变化，但酒精度分别比亲本提高了0.6 (%, v/v) 和0.4 (%, v/v)。【结论】YDL080C基因缺失对降低酿酒酵母发酵产高级醇特别是异戊醇没有明显作用，但会使酒精度有所提高。

摘要:摘要：【目的】药用植物内生真菌是一类重要的微生物资源，能代谢产生多种生物活性物质。本研究从浙江庆元百山祖自然保护区多花黄精（Polygonatum cyrtonema）分离获得1株具有抗菌活性的菌株zjqy610。【方法】通过形态和ITS rDNA序列分析，鉴定为变灰青霉（Penicillium canescens）。采用正相硅胶柱层析和凝胶（Sephadex LH-20）柱层析，以紫外光或碘蒸汽显迹，配合活性追踪等，从zjqy610发酵液中分离获得3个具抗真菌活性的化合物。【结果】通过质谱和核磁共振波谱技术分别将其结构鉴定为：乙基氧苯氨基亚胺乙酸（o-acetylbenzeneamidinocarboxylic acid）、灰黄霉素（griseofulvin）和 [1,2-b]呋喃2-甲基3-羧甲基4-羟基-5-甲氧基萘（naphtho[1,2-b]furan-3-carboxylic acid, 4-hydroxy-5-methoxy-2-methyl-）。抑菌活性测试表明，3个化合物对多种植物病原真菌具有抑制活性，其中化合物zjqy610D-4对番茄灰葡萄孢、圆形炭疽菌、泻根亚隔孢壳和核盘菌4种病原真菌的活性最强，半抑制浓度EC50分别为0.68、0.38、0.91和0.61 mg/L。【结论】该化合物具有开发成农用抗生素的价值。

摘要:摘要：【目的】本文对微小卡罗藻共附生微生物进行分离并对其抗菌和细胞毒活性进行初步研究，以期望获得既具有抗菌又具有细胞毒的高活性菌株，为从共附生微生物的角度去研究微小卡罗藻毒素的合成途径以及真正来源提供研究材料。【方法】利用琼脂扩散法和MTT法对细菌培养液的乙酸乙酯提取物进行抗菌和细胞毒活性筛选，并对具有细胞毒活性的细菌菌株进行了16S rRNA系统发生学分析。【结果】在分离到的38株海洋细菌中，25株细菌具有抗菌活性，5株细菌（W-14-2、W-2-2、W-12、E-8-2和W-4）具有细胞毒活性。对这5株具有细胞毒活性的细菌菌株进行16S rRNA系统发生学分析显示它们分别与Alteromonas alvinellae、 Stappia aggregata、 Pelagibaca bermudensis、 Marinobacter kribbensis和 Maribacter dokdonensis的16S rRNA基因序列具有较高的相似性。【结论】在分离到的微小卡罗藻共附生微生物中含有较为丰富的活性菌株，且获得5株具有抗菌活性又具有细胞毒的高活性菌株。

摘要:摘要：【目的】研究海洋烷烃降解菌新种模式菌株Alcanivorax hongdengensis A-11-3降解长链烷烃的分子机制。【方法】PCR克隆编码黄素结合单加氧酶的基因序列，利用生物信息学软件对序列进行分析，运用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术分析基因在不同烷烃诱导下的表达水平。【结果】从菌株A-11-3中克隆获得了两个黄素结合单加氧酶基因片段（almA1 和almA2）。它们编码的氨基酸序列与菌株Acinetobacter sp. DSM 17874的AlmA同源性分别为58.6% 和53.2%。实时荧光定量PCR分析表明，almA1基因只在长链烷烃（C28－C32）的诱导下上调表达，而almA2基因中能在更宽范围的长链烷烃（C24－C34）和支链烷烃诱导下上调表达。两者均在C9－C22的烷烃诱导下没有上调表达。【结论】黄素结合单加氧酶可能是A-11-3降解长链烷烃和支链烷烃的关键酶。

摘要:摘要：【目的】从桔青霉的发酵液中分离纯化了胞外阿魏酸酯酶(PcFAE)并进行了酶学性质的研究，初步探讨了PcFAE对麦糟的酶解作用。【方法】利用(NH4)2SO4沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水层析纯化得到电泳纯的阿魏酸酯酶。【结果】从该菌株的发酵液中获得一阿魏酸酯酶，该酶亚基分子量约为31 kDa，全酶分子量约为58 kDa。其最适pH为6.0，最适温度为45℃－65℃，在pH 5.0-6.0及25℃－55℃之间，酶保持了较好的稳定性。Mg2+、Fe2+、Mn2+、 Ca2+和Na+对酶活有一定的促进作用，Zn2+对PcFAE酶活有一定的抑制作用，而 Cu2+、亮抑肽素、抑肽酶有显著的抑制作用， Hg2+、苯甲基磺酰氟几乎完全抑制了酶活。EDTA 对PcFAE活性无明显影响。PcFAE的kcat/Km对香豆酸甲酯、芥子酸甲酯、阿魏酸甲酯、咖啡酸甲酯的值分别为823、416、103、0，PcFAE对MpCA的催化效率最高。PcFAE作用于麦糟，当5 U PcFAE/g麦糟时，其阿魏酸的释放量为7.2%。【结论】获得了一阿魏酸酯酶，其理化性质与至今报道的阿魏酸酯酶有所不同，为阿魏酸酯酶的开发提供了重要的实验依据。

摘要:摘要：【目的】探讨环境因素对东平湖沉积物细菌群落结构的影响。【方法】应用T-RFLP（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism）技术分析和比较了6个不同位置的东平湖沉积物在丰水期和枯水期的细菌多样性，并结合不同样品环境因子的差异，采用主成分分析（PCA）和典型对应分析（CCA），探讨了环境因子对细菌多样性的影响。【结果】不同沉积物样品的T-RFLP图谱具有较高的相似性。除2号样品外，所有枯水期样品的细菌群落具有较高的丰富度、多样性、均匀度和较低的优势度。CCA结果表明，558 bp T-RF的丰度与总磷、总氮、总有机碳、铵态氮和硝态氮含量呈负相关而与碳氮比和水深呈正相关；64.5、164、509和543 bp T-RFs的丰度与总氮、总有机碳、铵态氮、硝态氮、碳氮比和水深呈正相关；而其它14种主要的T-RFs在不同样品间分布较为稳定受环境因子影响不大。90、136.5、138和488 bp等T-RFs可能代表了东平湖沉积物中占优势地位的土著菌群。通过Phylogenetic Assignment Tool在线分析结果推测，东平湖沉积物中的优势菌群可能属于Firmicutes和Proteobacteria门。【结论】 环境因素对东平湖沉积物的细菌多样性产生显著影响，但对其土著菌群的影响不大。

摘要:摘要：【目的】本研究旨在通过非培养手段构建和筛选宏基因组文库，以求找到新型的杀线虫蛋白酶基因。【方法】采用密度梯度离心法提取和纯化温室土壤微生物总DNA，经平末端、连接、包装、转染后，构建宏基因组Fosmid文库，同时，以脱脂奶为底物，以根结线虫为靶标，对文库进行功能初筛。【结果】该文库库容31,008 个克隆，平均插入片段36.5 kb，包含1.13 Gbp的微生物基因组信息，适合大规模的微生物功能基因筛选，通过功能初筛，筛选到1个含杀线虫蛋白酶基因的Fosmid克隆（pro12）。进一步构建和筛选出亚克隆（espro124a5），通过对基因结构进行了初步分析发现：espro124a5是一种分泌型胞外蛋白酶，与来自于Maricaulis maris MCS10 (accession no. YP_756822 at NCBI)的丝氨酸蛋白酶S15仅有45%的同源性，是一种新型的丝氨酸蛋白酶，有其保守的催化三元组：Asp469,His541和Ser348。【结论】密度梯度离心法提取到的DNA纯度高、片段长，完全能满足构建宏基因组Fosmid文库的要求；同时，构建的宏基因组Fosmid文库库容大，有利于我们从中筛选其他的微生物基因资源。

摘要:摘要：【目的】针对人α-麦芽糖苷酶这个糖代谢途径中重要的靶蛋白，建立α-糖苷酶抑制剂高通量筛选模型。【方法】采用毕赤酵母表达系统克隆和表达人α-麦芽糖苷酶.利用酶的催化特性建立α-糖苷酶抑制剂筛选模型.应用该模型对放线菌代谢产物库进行高通量筛选.通过构建16S rRNA系统发育树分析阳性菌株的分类地位。【结果】首次成功克隆、表达了具催化活性的人α-麦芽糖苷酶N端结构域.针对人α-麦芽糖苷酶N端催化结构域，建立α-糖苷酶抑制剂的筛选模型.对包含近2000株放线菌代谢产物的天然产物库进行高通量筛选，最终得到20株α-麦芽糖苷酶抑制剂生产菌株.其中19株放线菌为链霉菌属，且在分类学上具有丰富的多样性。【结论】本研究建立的α-糖苷酶抑制剂高通量筛选模型具有很强的实用价值，可用于新型糖苷酶抑制剂类降糖药物的开发。

摘要:摘要：【目的】本研究旨在比较6种检测猪瘟病毒方法的优缺点。【方法】应用病毒分离、胶体金免疫层析试纸条、抗原捕捉ELISA、反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）、TaqMan荧光定量RT-PCR（RT-qPCR）和反转录-环介导等温扩增方法（RT-LAMP）等6种方法，分别对50份疑似猪瘟病料中的猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）进行检测。【结果】结果表明：RT-qPCR和RT-LAMP方法检出阳性样品数为13份，RT-PCR为11份，病毒分离为10份，抗原捕捉ELISA为9份，胶体金试纸条为8份；6种方法均检测为阳性8份，均为阴性37份。【结论】结果提示，在对猪瘟病毒进行检测时，RT-qPCR、RT-LAMP和RT-PCR由于其灵敏性高，可作为首选检测方法，但操作时需要避免假阳性的出现；病毒分离方法虽然操作繁琐，但结果准确，是确诊猪瘟必不可少的检测方法；抗原捕捉ELISA和胶体金试纸条检测时间较短，由于其敏感性较低所限，主要用于对畜群进行检测，不适合个体检测。

摘要:摘要：【目的】探索超声波处理土壤悬液，增加稀有放线菌的类群。【方法】将西双版纳热带雨林的混合土样，制成土壤悬液，用超声波分别处理0-120 s，用平板稀释法分离放线菌，得到纯菌落后测定其16S rRNA基因序列，进行系统发育分析，将分离菌株鉴定到属；用超声波处理已经鉴定到种且常见的10种链霉菌0-5 min，后进行培养，测定其存活率。【结果】土壤悬液经超声波处理不同时间，放线菌的数量和种类逐渐增加。超声波处理已知链霉菌1-5 min，对链霉菌的数量没有明显影响。【结论】用超声波处理土壤悬液40 s，可以大大增加放线菌的出菌总数，明显增加稀有放线菌的种类，是一种经济且简便易行的方法。

摘要:摘要：从红球菌NS1中检测到两个线型质粒pNSL1和pNSL2。【目的】克隆、测序和分析pNSL1，并鉴定质粒的复制区。【方法】利用脉冲电泳方法从凝胶中回收大量的质粒DNA，进行鸟枪法克隆、测序和拼接，通过生物信息学分析和实验证明质粒的自主复制区。【结果】克隆、测序和拼接获得pNSL1全长为117252 bp的序列，包括在红球菌中保守的1282 bp端粒的序列。序列预测含有103个蛋白编码区，包括质粒的复制、分配、转移等功能基因。将pNSL1中一个与分枝杆菌质粒的复制基因同源的pNSL1.038及其上游的767 bp非编码序列克隆到大肠杆菌质粒，电击转化珊瑚诺卡氏菌4.1037，获得了抗性转化子。【结论】克隆、测序了全长的线型质粒pNSL1，鉴定了质粒的复制区。

摘要:摘要：【目的】利用山梨糖脱氢酶醌酶活性从氧化葡糖杆菌H24中分离PQQ生物合成基因簇。【方法】利用ptsG位点整合sdh基因的大肠杆菌JM109作为宿主菌构建了氧化葡糖杆菌H24的基因组DNA文库。通过山梨糖脱氢酶活性检测，从文库中筛选具有PQQ合成能力的单菌落并进行亚克隆。【结果】从氧化葡糖杆菌H24的基因组文库中筛选得到一株具有山梨糖脱氢酶活性的单菌落，亚克隆后序列分析显示插入片段全长5400bp，对应5个编码框（pqqABCDE），与其他细菌PQQ生物合成基因簇有很高的序列同源性。【结论】利用山梨糖脱氢酶醌酶活性成功从氧化葡糖杆菌H24中分离克隆得到了PQQ生物合成基因簇pqqABCDE。

摘要:摘要：【目的】原核表达空肠弯曲菌鞭毛蛋白FlaA，并制备其单克隆抗体。【方法】克隆目的基因并将其构建到pET30a(+)和pGEX-6p-1表达载体，分别以变复性纯化后的rHis-flaA、rGST-flaA蛋白为免疫原和检测原进行杂交瘤细胞的筛选。采用间接ELISA法测定细胞上清和单抗腹水效价，Dot-ELISA、Western blot分析单抗特异性。【结果】成功构建pET30a(+)-flaA和pGEX-6p-1-flaA重组原核表达质粒，并融合表达rHis-flaA和rGST-flaA蛋白，Western-Blot 试验显示天然蛋白多抗血清能与体外表达的蛋白呈现特异性反应，表明表达蛋白具有免疫原性。筛选获得3株稳定分泌抗FlaA的单克隆杂交瘤细胞株，分别命名为2D12、5E12、6A9，其Ig亚类分别为IgG2a、IgG1、IgG1，腹水效价分别为1:102400, 1:102400 和1:51200；Western blot试验显示，3株单抗均能与表达rHis-flaA重组蛋白的细菌发生特异性反应；Dot-ELISA试验表明，3株单抗均能与不同来源的空肠弯曲菌分离株发生特异性反应。【结论】本研究制备的单克隆抗体有较高特异性，具有良好的应用价值。为进一步研究空肠弯曲菌鞭毛蛋白的生物学特性、致病机理，以及建立快速检测技术奠定基础。