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摘要:摘要:本文详细介绍了2011 年度国家自然科学基金委员会生命科学部微生物学学科的项目申请、受理和资助的情况，着重介绍了项目申请中应当引起申请人普遍关注的问题，对获资助项目情况的特点进行了概括和分析，希望为科研人员今后申请基金项目提供有用的参考。

摘要:摘要:自然环境中，具备自然转化能力的细菌可以自发地从外界获取DNA，从而获得新的遗传性状。为能够自然地被转化，细菌需首先建立一个被称作感受态的生理状态并在此状态下表达DNA 摄取和加工相关的基因。DNA 摄取基因的表达产物可组装一个能将外源DNA 摄入细胞质的蛋白复合物。在细胞质中，进入的DNA 可同基因组DNA 发生同源重组或建立成一个独立的质粒。一般DNA 摄入细胞的过程可分为两个阶段，即从外部基质到细胞周质和跨细胞内膜的转运。近年来，包括作者在内的研究人员发现大肠杆菌中存在 新的自然质粒转化模式。本文将首先综述近年来细菌自然转化的分子机制，随后简要介绍大肠杆菌中独特的自然质粒转化模式。

摘要:摘要:基因转移因子(Gene Transfer Agent，GTA)是一种由细菌释放的、形态和有尾病毒类似的生物颗粒。GTA 颗粒携带的遗传物质是宿主基因组的随机小片段而不包含编码GTA 自身的基因或病毒基因组。根据4个模式菌株释放的GTA 的研究，GTA具有高效的，种间介导基因水平转移的功能。近年来大规模细菌基因组测序，发现编码GTA 的基因簇广泛存在于海洋细菌基因组上，GTA 是在海洋环境中发生水平基因转移的重要模式。本文在总结4 个模式菌株释放的GTA 的认识的基础上，着重描述海洋主要类群的细菌释放的GTA 的特征，讨论在海洋生态系统中，GTA 对水平基因转移的贡献，并对未来的研究进行了展望。

摘要:摘要:作为工业化的细胞工厂，乳酸菌广泛应用于食品、农业和医药等行业。然而在乳酸菌的工业生产中以及作为益生菌在人体胃肠道系统中都会面临多种环境胁迫，这些胁迫环境严重影响乳酸菌的生理功能，从而影响食品微生物制造的效率。近年来，随着代谢工程和系统生物学的发展，为乳酸菌生理功能的改造带来了前所未有的机遇。本文综述了系统生物学和代谢工程在乳酸菌生理功能的优化和调控中的具体应用。

摘要:摘要:【目的】很多链霉菌来源的天然产物的生物合成基因簇往往很大，用传统的cosmid 载体很难完整的克隆和异源表达。本研究通过载体改造，成功构建出一个新的细菌人工染色体(BAC)载体，用于链霉菌来源的天然产物生物合成基因簇的克隆及异源表达实验。【方法】从复合型载体pCUGIBAC1出发，通过λRED介导的PCR-targeting 方法，用链霉素抗性基因替换掉原有的氯霉素抗性基因标记，同时插入链霉菌中常用的安普拉霉素抗性标记、转移起始位点oriT、φC31 整合酶基因int、整合位点attP 等元件。【结果】成功构建出可装载链霉菌大片段DNA 的BAC 载体pMSBBACs。使用pMSBBACs 构建出链霉菌U27的基因组BAC文库，平均插入片段大小为100 kb。选取其中一个大小为140 kb的BAC 质粒进行功能验证，实验证明通过接合转移和原生质体转化的方法都能够将这个大型BAC 质粒导入链霉菌模式菌株，并通过位点特异性重组整合到染色体中进行异源表达。【结论】BAC 载体pMSBBACs 可成功用于放线菌大片段基因组DNA 的克隆和异源表达实验。

摘要:摘要:【目的】为了研究龟裂链霉菌Streptomyces rimosus M4018 中的rex 基因对自身rex operator(ROP)的调控机制。【方法】根据天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor A3(2)中rex 基因的同源序列设计引物进行PCR，从S． rimosus M4018 中获得其rex 基因(Sr-rex)。同时，通过染色体步移的方法，获得其上游的ROP 序列。采用体外凝胶迁移的方法，分析了Sr-Rex 对ROP 的调控作用。【结果】获取的Sr-rex 基因核苷酸序列长度为846 bp，预测的编码氨基酸序列与S．coelicolor A3 (2) 中Rex 的同源性为84%，获得GenBank 登录号:GQ849479。圆二色光谱显示Sr-Rex 的结构以α 螺旋和β 折叠为主，与软件预测相符。凝胶迁移实验表明，Sr-Rex 能与S． rimosus M4108 中扩增到的ROP 片段特异性结合。同时，以Rex:ROP 的最小结合序列为基础，设计了一条22 bp 的单链DNA片段，和Sr-Rex 的最大结合摩尔浓度比约为5:1。高浓度的NADH 抑制 两者的结合活性，而NAD + 对结合没有影响。【结论】在S． rimosus M4108 中，Rex 是通过响应胞内NAD(H)水平的方式来调控ROP 的表达的。

摘要:摘要:【目的】新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)是人类重要致病真菌，主要毒性因子之一漆酶的表达受葡糖糖阻遏，机制未知。本文拟寻找参与葡萄糖阻遏的关键基因。【方法】建立根癌农杆菌介导的转化方法(Agrobacterium tumefanciens-mediated transformation，ATMT)建立一个容量约200000 的随即插入突变文库，在高浓度葡萄糖条件下从中筛选葡萄糖去阻遏的突变株。通过Southern 确定突变株中T-DNA 的拷贝数，利用反向PCR 获得依赖葡萄糖的漆酶阻遏基因序列。【结果】筛选到了30 株葡萄糖去阻遏突变株，Southern blot发现83%的葡萄糖去抑制突变株含有单个T-DNA 拷贝。初步鉴定了可能参与漆酶阻遏的10 个不同生物学功能基因，如参与碳水化合物的代谢，固醇的合成，几丁质的合成，GPI 脂锚钩的合成等等。【结论】ATMT 突变策略可以找到一些参与漆酶葡萄糖阻遏的关键基因，为理解漆酶在致病过程中的作用机制和工业改进漆 酶活性提供参考。

摘要:摘要:【目的】分析丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白( CORE)稳定表达对磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(PCK1)转录水平的影响，并分析HCV CORE 调控PCK1 转录的分子机制，为进一步阐明HCV 感染致2 型糖尿病机理的探讨提供新的思路。【方法】利用反转录病毒表达系统构建稳定表达HCV CORE 的Huh7-lunet-core 细胞系。采用Real-time PCR 和萤光素酶报告基因技术检测Huh7-lunet-core 细胞系中PCK1、FOXO1 以及PGC-1α 转录水平变化，并结合Western blot 分析FOXO1 的活性变化。【结果】HCV CORE 的稳定表达显著增强 PCK1 的转录水平，HCV CORE 不影响FOXO1 的转录和表达水平，但降低FOXO1 的磷酸化水平，激活了FOXO1 的转录活性，并增强PGC-1α 的mRNA 表达水平。【结论】HCV CORE 在Huh7-lunet 细胞中的稳定表达激活FOXO1 的转录活性，并与PGC-1α 协同作用，上调PCK1 的转录，从而导致肝糖异生过度发生，对HCV CORE 调控PCK1 转录的分子机制的揭示可能为HCV 感染相关的糖尿病的治疗提供新的靶点。

摘要:摘要:美达霉素是链霉菌产生的具有强抗肿瘤活性的芳香聚酮类抗生素，其砒喃环并内酯结构对于其抗癌活性非常重要。位于美达霉素生物合成基因簇中的基因med-ORF12 编码立体专一性酮基还原酶，可能参与美达霉素的砒喃环并内酯结构中手性中心(C3S)的形成，但在美达霉素产生菌中的功能和表达还未曾研究。【目的和方法】为了研究med-ORF12 在野生菌中的表达情况以及与美达霉素生物合成的关系，本文采用了原核表达、抗体制备、免疫杂交等技术方法对这个基因展开了体内表达研究。【结果】首先利用pET 载体建立了med-ORF12 的原核表达系统，在优化诱导表达条件的基础上获得了可溶性目的蛋白，制备了相应的多抗血清;然后利用多抗血清对美达霉素产生菌中的基因med-ORF12 的表达情况进行了检测，表明在美达霉素产生菌中参与次生代谢的med-ORF12 在稳定期大量表达，同时伴随美达霉素的大量积累。【结论】这些结果表明在美达霉素产生菌中，基因med-ORF12 参与次生代谢，其表达与美达霉素生物合成有一定相关性。

摘要:摘要:【目的】了解絮凝基因FLO1 中重复DNA 序列B 和D 对絮凝蛋白Flo1p 功能的影响，为构建遗传稳定的最小絮凝功能基因奠定理论基础。【方法】通过PCR 和融合PCR 方法分别克隆到完整的絮凝基因FLO1、重复DNA 序列B 和D 分别缺失的衍生基因FLO1b 和FLO1d，分析这些基因在非絮凝酵母中表达对细胞絮凝特性的影响。【结果】与完整絮凝基因相比，重复DNA 序列B 和D 分别缺失后对酵母细胞絮凝强度没有明显影响，但不同基因在酵母菌中表达产生的絮凝特性受环境因素，如甘露糖浓度和pH 等的影响有明显差 异。FLO1 中重复DNA 序列B 和D 缺失后，细胞絮凝特性受甘露糖抑制的敏感性降低;同时对环境pH的改变具有更广泛的适应性。【结论】重复DNA 序列B 和D 对絮凝蛋白Flo1p 结构和功能具有调控作用，二者缺失后，特别是D 缺失后会使絮凝蛋白在极端酸碱环境下更稳定。

摘要:摘要:【目的】克隆藤黄微球菌Micrococcus luteus IAM 14879 (=NCIMB 13267)的复苏促进因子Rpf(resuscitation promoting factor) 的基因，在大肠杆菌中表达获取基因重组蛋白，考察对近缘高GC 革兰氏阳性菌红球菌Rhodococcus sp.DS471 活的非可培养VBNC (viable but non-culturable)菌体的复苏促进生长能力。【方法】抽提制备藤黄微球菌的DNA，确定rpf 基因引物进行PCR 扩增，利用pET15b 质粒载体并转化大肠杆菌DE3 表达，以SDS-PAGE 检验获取纯化重组蛋白;在培养基中添加Rpf，以MPN (most probable number) 法计数、评价对VBNC 状态菌体的复苏促进生长效果。【结果】基因测序证实获得藤黄微球菌的rpf 基因并在大肠杆菌中表达;SDS-PAGE 分析表明获得rpf 基因的重组蛋白;该蛋白对处于VBNC 状态的红球菌具有近100倍的复苏促进生长能力。【结论】成功克隆了藤黄微球菌的rpf 基因，在大肠杆菌中获得了表达，表明了Rpf 蛋白对处于VBNC 状态的红球菌具有复苏促进生长效果。

摘要:摘要:【目的】探讨红串红球菌中一种醇脱氢酶的性质及其对酮酯类及酮类底物的催化能力。【方法】从红串红球菌(Rhodococcus erythropolis ATCC 4277)中获取一段长度为1047 bp的醇脱氢酶(adh)基因，插入载体pET-22b(+)后，在大肠杆菌中进行重组表达。15℃的低温下用自诱导培养基诱导24 h，以苯乙酮为底物测定醇脱氢酶酶活。【结果】测得该诱导条件下重组菌体细胞破碎上清中醇脱氢酶酶活力为2.6U/mg。经温度、pH 耐受性等分析，发现该酶最适pH 在6.0－6.5 之间，耐受温度可以达到60℃，并且在该温度下保持5h后，酶活也能保留80%。对于β 酮酯类底物的催化反应，以对乙酰乙酸乙酯的催化能力最高。用4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)为底物进行全细胞水相催化反应，经手性液相色谱分析，发现在催化产物以R 型4-氯-3 羟基丁酸乙酯(CHBE)为主。【结论】该酶在酮酯类的底物转化方面有良好的开发潜力及应用前景。

摘要:摘要:【目的】旨在构建一个能以非色谱纯化目标蛋白的表达质粒，使用自行设计的类弹性蛋白多肽(ELPs)作为非色谱纯化标签，以纯化目标蛋白。该ELPs 长度短，对盐非常敏感。【方法】从头设计了木聚糖酶，将其通过一段无规则卷曲同ELPs 相连，合成了编码上述序列的基因，并构建重组表达载体pET-22b-SoxB-M2-S-ELP，转化至大肠杆菌BLR(DE3)中诱导表达，采用可逆相变循环经高速离心纯化木聚糖酶，并考察纯酶的酶学性质。【结果】成功构建了表达载体并表达，在pH =7.0 时0.5mol/L碳酸钠可使ELPs 的相变温度降至22℃。在上述条件下，对木聚糖酶进行了非色谱纯化，其纯化倍数为3.2，回收率为21.2%，纯度为64.3%。经测定，未连接ELPs 的酶、粗酶及纯化酶学性质基本一致，其最适温度为60℃，最适pH为6.0，最适反应时间为30min，粗酶70℃保温1 h相对酶活仍有50%，为嗜热木聚糖酶，与预期相符。【结论】ELPs 作为非色谱纯化标签纯化重组木聚糖酶具有操作简单、易于放大、成本较低的优势，故所构建的重组质粒可望通用于分离多种重组蛋白，具有较广泛的用途。

摘要:摘要:【目的】从巢湖底泥中分离筛选高效的藻毒素降解菌，并初步研究其胞内粗酶液降解藻毒素-LR(MCLR)的特性，为水体中藻毒素污染的微生物治理提供有效的菌源与理论依据。【方法】利用富集驯化培养技术，以MC-LR 为唯一碳源，分离筛选MC-LR 降解菌，通过形态观察、生理生化实验及16S rRNA 序列分析鉴定菌株，并考察其胞内粗酶液在不同条件下对MC-LR 的降解特性。【结果】分离得到1 株能高效降解MCLR的菌株M6。分子鉴定结果表明，该菌株为蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)。其降解MC-LR 的活性物质为胞内酶，而且至少有3 种酶参与了MC-LR 的降解，它们是菌体本身的组织酶而非诱导酶。当反应体系pH值为8.0，胞内粗酶液浓度为404.9mg/L，MC-LR 的初始浓度为10mg/L 时降解率最高，16h可达98.7%。【结论】分离出的MC-LR 降解菌为蜡状芽胞杆菌，该菌株对MC-LR有较高的降解能力，并且酶促反应受到反应体系的pH 值、胞内粗酶液浓度以及藻毒素初始浓度等因素的影响。

摘要:摘要:【目的】以内蒙古辉腾锡勒草原九十九泉湿地为对象，研究湖泊干涸过程中氨氧化微生物的群落结构及其变化。【方法】通过MPN-PCR 定量测定氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)的数量;构建amoA 基因克隆文库，进行系统发育分析;结合土壤环境因子，探讨湿地退化过程中影响氨氧化微生物的潜在因素。【结果】依湖泊湿地退水梯度的不同样点中，有75%的样点AOB 的数量高于AOA，AOB 与AOA 的数量比率为0.3－18.1。从湖心到湖岸草原带，AOA 和AOB 的数量有明显增加，但生物多样性呈降低趋势，二者没有 呈现正相关。研究发现，AOB 的数量与土壤中NH+4-N 的变化存在良好响应。系统发育分析显示，退化湖泊湿地AOA 克隆序列均来自于泉古菌门(Crenarchaeota);AOB 的amoA 基因的克隆序列大部分与亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)有一定同源性，较少部分与亚硝化螺菌属(Nitrosospira)有一定同源性。【结论】湖泊退水过程增加了湿地土壤氨氧化微生物的数量，而氨氧化微生物的种群丰度有所降低。AOA 和AOB 群落对湖泊湿地的退化过程做出了响应，其中AOB 的响应较为明显，氧化条件和土壤铵浓度的改变可能是促成这种响应的重要原因。

摘要:摘要:【目的】近年来，O 型口蹄疫的不断暴发严重危害了我国畜牧业的发展，其病原———O型口蹄疫病毒已演化出3 种谱系:中国型猪毒系、泛亚系和缅甸98系。其中中国型猪毒系病毒高度嗜猪，对养猪业危害最大。目前应用的疫苗已不能有效保护中国型猪毒系变异株的流行，这给我国猪口蹄疫的防控带来了极大的困难。为了进一步发展免疫原性好、抗原谱广的猪O 型口蹄疫疫苗候选株，本研究以O/HN/93现用疫苗毒株的感染性克隆为骨架，用流行的新猪毒系病毒的部分VP3 和VP1 基因(主要是替换VP1 蛋白上的B-C 环和G-H环)替换疫苗毒株的相应部分，构建了嵌合的FMDV 全长cDNA 克隆。【方法】线化的嵌合全长质粒和表达T7 RNA 聚合酶的真核质粒pcDNAT7P 共转染BHK-21细胞，体内转录拯救嵌合病毒。【结果】嵌合全长质粒转染BHK-21 细胞36h后，出现明显的FMDV 致细胞病变效应。对收获的病毒分别用RT-PCR、间接免疫荧光、电子显微镜观察结果证实成功拯救到嵌合的FMDV。拯救的病毒乳鼠致病性试验结果表明该拯救病毒对乳鼠的致病力减弱。该嵌合病毒的成功拯救为研制口蹄疫新型疫苗等奠定了基础。

摘要:摘要:【目的】2 株炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis) 17003-14 和17003-32 的多位点序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)研究。【方法】选取B.anthracis 基因组7 个常见管家基因位点glpF、gmk、ilvD、pta、pur、pycA 和tpi 进行PCR 扩增、测序，与MLST 数据库中的等位基因序列进行比对，确定菌株的序列型(sequence type，ST)。【结果】B.anthracis 17003-14 和17003-32 的等位基因编号分别为113、31、1、43、1、53、7 和113、31、1、43、1、53、37，比对结果显示这2 株细菌的等位基因编号组合未见报道。【结论】17003-14 和17003-32 为新ST菌株，已被MLST 数据库确认，注册号(pubMLST id)分别为id-1053 和id-1054。

摘要:摘要:【目的】探讨植物乳杆菌LpT1 和LpT2 大鼠体内降胆固醇特性。【方法】将高脂血症的大鼠随机分成4组，分别进行灌胃。A、B、C 和D 组分别灌胃菌株LpT1、菌株LpT2、洛伐他汀和蒸馏水。灌胃28d 后，断尾采血，分离血清，分别测定总胆固醇、总甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的含量并进行肝脏组织切片的制作与电镜观察。【结果】饲喂高脂饲料7d 后，成功构建出高脂血症大鼠模型。植物乳杆菌菌株LpT1 和阳性对照洛伐他汀降胆固醇效果极其显著(p＜0.01)，菌株LpT2 次之(p＜0.05)，而阴性对照水几乎无降胆固醇效果。从电镜扫描结果看，植物乳杆菌LpT1和LpT2在大鼠肠道中定植后，能很好的调节肝脏代谢脂类物质朝着正常化趋势发展。【结论】研究结果为进一步明确植物乳杆菌体内降胆固醇机制奠定了良好基础。

摘要:摘要:【目的】金属蛋白酶S2P 在细菌中通过在膜切割转录调控因子、释放δ因子参与胁迫响应是跨膜信号转导的保守机制，但蓝细菌中S2P的功能还未被鉴定，故我们考察集胞藻PCC6803中的S2P同源蛋白Slr0643及Sll0862的金属蛋白酶活性。【方法】以pET-30b(+)为载体，分别构建重组质粒pF0643和pF0862，在大肠杆菌BL21(CE3)中诱导表达并纯化Slr0643及Sll0862蛋白，以β-酪蛋白为底物检测重组蛋白的酶活性。【结果】体外酶活实验显示重组表达的Slr0643及Sll0862蛋白有内切蛋白酶活性，且其活性受金属螯合剂o-phenanthroline的抑制。体外酶活的鉴定结果为进一步研究Slr0643 和Sll0862 的体内酶活和生物学功能奠定了基础。【结论】集胞藻PCC6803 中的S2P 同源蛋白Slr0643 及Sll0862 具有金属蛋白酶活性。

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