摘要:

摘要:

摘要:摘要:多重维生素营养缺陷型光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)，是工业发酵生产丙酮酸最具竞争力的菌株。由于其独特的基因组特征和优越的生产表型，通过营养、环境条件和辅因子水平能有效地调控T.glabrata 的生理功能，进而将代谢流最大化、快速化的导向目标产物。本文总结了T.glabrata 在基因组测序、生理功能解析与调控等方面所取得的研究进展，并评估了利用T.glabrata 生产精细化学品的潜力。

摘要:摘要:【目的】分析西南印度洋深海热液羽流细菌的多样性特点，为认识该特殊环境微生物对大洋生态系统的影响，以及获得特殊的微生物资源奠定基础。【方法】将西南印度洋深海热液羽流海水进行原位浓缩，对获得的1000 倍浓缩海水样品进行富集培养和微生物纯培养;通过构建原始海水浓缩样品和富集培养物的16S rRNA基因克隆文库，结合纯培养获得的微生物菌株的16S rRNA基因，分析该样品的细菌多样性结构和特点。【结果】共获得104个16S rRNA基因，其中50个来自原始热液羽流浓缩海水样品，40个来自富集培养物，14个来自分离获得的纯培养，它们分属于γ-变形菌群(γ-Proteobacteria) (74个)，α-变形菌群(α-Proteobacteria) (14个)，β-变形菌群(β-Proteobacteria) (5个)，拟杆菌群(Bacteroidetes) (4 个)，厚壁菌群(Firmicutes) (2个)，浮霉状菌(Planctomycetes) (2个)，疣微菌(Verrucomicrobia) (2个)以及放线菌(Actinobacteria) (1 个)，共29个不同的操作分类单元(Operational Taxonomic Units，OTUs)。26 个序列与已知微生物16S rRNA 基因相似性低于97%，最低的只有86%。【结论】西南印度洋热液羽流存在较丰富的微生物多样性，以γ-Proteobacteria 为优势类群，其次为α-Proteobacteria;该环境中存在较多尚未获得分离培养 的微生物新属种。

摘要:摘要:【目的】为了研究铜绿假单胞菌全局调控因子RsmA对两个吩嗪(Phenazine)合成基因簇phz1和phz2的调控方式与机制。【方法】采用基因缺失和抗性基因(gentamycin resistance cassette，aacC1)插入相结合的策略构建了rsmA 基因缺失突变株PA-RG;通过构建互补表达载体和过表达载体，进一步确认RsmA 对绿脓菌素的调控作用;采用电转化方法将构建的翻译融合表达载体pMEZ1 (phz1'-'lacZ)和pMEZ2 (phz2'-'lacZ)分别导入铜绿假单胞菌突变株PA-RG 和野生株PAO1，采用Miller 法测定融合β-半乳糖苷酶活性。【结果】在GA 培养基中，互补分析和过表达分析表明，RsmA抑制绿脓菌素的合成。此外，pMEZ1在突变株PA-RG中的表达增强，为野生株的2－3倍;而pMEZ2在突变株PA-RG中的表达降低，野生株是突变株的2倍。【结论】由此初步判定，铜绿假单胞菌全局调控因子RsmA对两个不同吩嗪合成基因簇的调控作用具有特异性，在一定程度上RsmA 负调控phz1，正调控phz2。

摘要:摘要:【目的】初步明确高毒菌株VDG1特异片段SCF73与大丽轮枝菌致病力的关系。【方法】通过比较基因组学分析和PCR鉴定，明确大丽轮枝菌高毒菌株VDG1相对于低毒菌株VDG2 的特异片段SCF73;构建SCF73片段敲除质粒，导入农杆菌AGL-1，应用农杆菌介导法转化大丽轮枝菌VDG1，抗性筛选和PCR扩增鉴定SCF73敲除转化子;利用果胶、纤维素和淀粉培养基模拟分析ΔSCF73降解细胞壁组分的能力，采用定量蘸根接种法鉴定其对感病棉种军棉1号的致病力。【结果】确定了大丽轮枝菌VDG1的特异片段SCF73，长度为27.1 kb，预测编码5个基因，推测2个基因具有水解酶功能;筛选获得了3个ΔSCF73突变株;突变株利用细胞壁组分的能力与野生型菌株VDG1 相比无显著差异;突变株对感病棉种军棉1号的致病力显著减弱。【结论】高毒力菌株VDG1 特异片段SCF73 在大丽轮枝菌致病过程中具有重要作用。

摘要:摘要:【目的】为了减少北京棒杆菌PD-67(Corynebacterium pekinense PD-67)从细胞外吸收色氨酸，降低细胞内色氨酸库的浓度，从而使色氨酸的反馈控制作用减弱，增加胞外L-色氨酸的积累量，构建北京棒杆菌PD-67的芳香族氨基酸转运蛋白基因aroP 敲除的菌株，研究aroP 基因敲除对菌株L-色氨酸积累的影响。并进一步研究在aroP 敲除菌株中表达邻氨基苯甲酸合成酶(AS)基因对L-色氨酸积累的影响。【方法】运用PCR技术扩增aroP 基因，与整合质粒连接后，用限制性内切酶法构建带有内部片段缺失的aroP 基因的敲除载体。利用同源重组技术，敲除北京棒杆菌PD-67的aroP 基因，构建菌株PD-67ΔaroP，并用带有aroP基因的表达载体对PD-67ΔaroP 进行互补验证。采用PCR 技术扩增AS基因，与表达载体连接构建重组质粒。将重组质粒转入菌株PD-67ΔaroP，构建工程菌株PD-67ΔaroP/pXAS。通过摇瓶发酵研究PD-67ΔaroP和PD-67ΔaroP/pXAS 的发酵特性。【结果】经PCR 验证获得了aroP基因缺陷的菌株。摇瓶发酵结果表明，与出发菌株相比，PD-67ΔaroP的L-色氨酸的积累量提高了65%。酶活分析结果表明，AS 基因在菌株PD-67ΔaroP中得到表达。AS 基因表达使工程菌单位菌体产酸率提高了25. 6%。【结论】北京棒杆菌PD-67中芳香族氨基酸转运蛋白基因aroP 的敲除能够提高胞外L-色氨酸的积累量。在aroP 基因敲除菌中表达AS 基因，可以进一步提高工程菌的产酸率。

摘要:摘要:【目的】σ因子是细菌RNA 聚合酶全酶的重要组分，包括必须σ 因子和选择性σ因子。SigF作为重要的选择性σ因子影响结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的致病性和毒力等重要的功能。与之对应的在非致病性、快速生长的分枝杆菌耻垢分枝杆菌(M．smegmatis)中，sigF的调控可能与其适应一定的生理环 境相关。【方法】通过基因敲除、遗传互补和抗药性分析，系统的研究了耻垢分枝杆菌SigF 的应答调控。【结果】sigF 敲除菌株与野生菌相比，对过氧化氢特别敏感，并且这种敏感性能够通过反式互补野生型的基因得到回复;由于细菌体内的抗氧化能力与耐药性有较高的相关性，进一步分析sigF 敲除菌株的抗药性和抗氧化相关基因的表达情况，显示SigF 影响细菌清除过氧化氢的能力，但是并不影响包括异烟肼等药物的敏感性及与异烟肼敏感性相关基因的表达。【结论】SigF 调控的活性氧胁迫应答途径与异烟肼活化的氧化胁迫应答途径不同。另外，实验显示SigF 参与了耻垢分枝杆菌的色素的合成，提示SigF 参与的是光氧化胁迫应答途径，与药物引起的氧化胁迫应答途径是不同的通路。

摘要:摘要:【目的】了解絮凝基因FLO1中重复DNA 序列A 对酵母菌絮凝能力及其遗传稳定性的影响，为构建遗传性能稳定、工业应用前景优良的最小絮凝功能基因奠定理论基础。【方法】通过融合PCR 方法构建了FLO1 中全部重复DNA 序列A 发生缺失的衍生基因FLO1a，以含有FLO1基因的大肠杆菌为筛选模型，通过连续传代培养及质粒快速分析获得FLO1 内重复DNA 序列A 不同程度、不同位点缺失的系列衍生基因FLO1a1-FLO1a5。完整FLO1 基因和上述衍生基因转化非絮凝型酵母YS58，得到重组菌株YSF1、YSF1a 及 YSF1a1-YSF1a5，分析了上述不同酵母菌株絮凝特性及其遗传稳定性。【结果】絮凝基因FLO1 中重复DNA序列A 完全缺失使酵母细胞完全失去絮凝能力，部分重复DNA 序列A 发生缺失导致絮凝能力降低，絮凝基因中重复DNA 序列A 的个数与细胞絮凝能力成正相关，但不是简单的比例关系。其中衍生基因FLO1a3含有的重复DNA 序列A 是FLO1 基因的33. 3%，但菌株YSF1a3 的絮凝能力可达YSF1 絮凝能力的71.4%。而且菌株YSF1a3 的絮凝特性比菌株YSF1 的絮凝特性具有更好的环境适应性和遗传稳定性。【结论】重复 DNA序列A是絮凝基因中非常活跃的序列，是导致絮凝特性遗传不稳定的关键因素，该序列的部分缺失不但可以使酵母细胞呈现适度的絮凝能力，而且使絮凝特性具有更好的环境适应性和遗传稳定性。该研究为通过对絮凝基因内衔接重复序列的合理调控，促进酵母絮凝特性在发酵工业及其他生物化工过程和环境修复中的广泛应用提供了重要的理论依据和解决策略。

摘要:摘要:【目的】在转录水平上研究低温和外源不饱和脂肪酸对于高山被孢霉脂肪酸脱氢酶基因的表达调控机制。【方法】通过实时定量PCR 技术和启动子报告基因融合载体的方法，研究低温和外源不饱和脂肪酸对于高山被孢霉3 种脂肪酸脱氢酶基因表达随时间进程的影响。【结果】实时定量PCR 的结果表明:低温对于3种脂肪酸脱氢酶基因的转录具有激活作用，外源不饱和脂肪酸对基因转录起抑制作用，而且这两种作用都是快速响应的，随时间延长逐渐减弱并消失。脂肪酸组成测定结果证明了基因转录水平变化与对应产物变化之间没有相关性。低温能够在短时间内诱导pFAD6启动子活性增加，并随时间延长而持续增强;外源不饱和脂肪酸对pFAD6 启动子活性起抑制作用，其不饱和度和浓度越高，抑制作用越强，而且抑制作用是快速且持续的。【结论】低温和外源不饱和脂肪酸除了在转录水平上调控高山被孢霉脂肪酸脱氢酶基因表达发生变化之外，可能主要在转录后水平上介导了胞内脂肪酸组成的变化。而且，脂肪酸脱氢酶基因的表达可能受到胞内脂肪酸组成变化的反馈调节作用。本文首次在转录水平上对高山被孢霉脂肪酸脱氢酶基因的表达调控机制进行了探索，为深入了解脂肪酸脱氢酶基因表达及多不饱和脂肪酸合成对外界信号的应答机制提供了有用信息，也对应用微生物发酵和转基因技术生产不饱和脂肪酸具有指导意义。

摘要:摘要:【目的】建立耦合CO2减排的微藻培养技术，在减排CO2的同时，有效降低微藻产业化生产的成本。【方法】以两种微藻所具有的pH 快速漂移与高碱适应特性为原理，通过CO2防逸罩简易装备的设计和构建，建立二氧化碳减排技术。【结果】将该技术应用于微藻培养，在嗜碱绿球藻MC-1 的CO2减排小试培养中，CO2防逸罩的安装使得通入培养物后全部逸出的CO2被碱性藻液完全吸收，在海水钝顶螺旋藻新藻株(HS331)的工厂化中试培养中，其平均产率达9.54g/(m2·d1)，碳源成本降低了57%，并有效避免了碳酸根离子导致的海水钙镁离子沉淀的产生;将该技术进一步应用到螺旋藻产业化培养，在保证获得高质量产品的同时，其年产量提高了20%，每年NaHCO3用量减少了66%，碳源成本减少了58%，年减排CO2量约45吨。【结论】本研究实现了CO2减排技术在螺旋藻产业化培养中的应用，有效降低了螺旋藻生产成本，为建立产业化的CO2减排新技术奠定了重要的理论与技术基础。

摘要:摘要:【目的】构建含犬干扰素-γ(cIFN-γ)基因的重组腺病毒，并在培养的犬肾细胞MDCK 中分析其抗犬细小病毒的活性。【方法】首先将cIFN-γ cNDA 基因克隆到腺病毒穿梭质粒中，构建成含cIFN-γ 基因的腺病毒穿梭质粒pShuttle3-cIFN-γ。利用特异的酶切位点，通过直接连接法将cIFN-γ表达盒插入到腺病毒基因组质粒pAdeno-X 中，构建成含cIFN-γ 基因的腺病毒基因组质粒pAd-cIFN-γ。pAd-cIFN-γ质粒经酶切线性化后转染人胚胎肾细胞HEK293T，在细胞中拯救出含有cIFN-γ 基因的复制缺陷型重组腺病毒。然后用该重组腺病毒处理(感染)培养的犬肾细胞MDCK，再用犬细小病毒感染重组腺病毒处理的细胞，分析重组腺病毒在体外抗犬细小病毒的活性。【结果】通过连接法构建了含cIFN-γ基因的重组腺病毒，构建的重组腺病毒能够介导cIFN-γ在MDCK 细胞中进行分泌表达。用含cIFN-γ 基因的重组腺病毒处理MDCK 细胞，可明显地 抑制犬细小病毒在细胞中的增殖，表明构建的重组腺病毒具有明显的抗犬细小病毒的活性。【结论】构建了含cIFN-γ 基因的重组腺病毒，并证明该重组病毒在体外具有明显的抗犬细小病毒的活性。

摘要:摘要:【目的】细胞自噬(Autophagy)是真核细胞用于清除胞内聚集物、损伤细胞器而维持其稳态平衡的一种溶酶体降解途径。细胞自噬不仅在细胞生长发育、成熟、分化等过程中起重要作用，且与病毒感染、细胞免疫密切相关。通过研究细胞自噬对乙肝病毒感染的I 型干扰素的影响，为进一步阐明乙肝病毒感染对机体天然免疫反应研究奠定基础。【方法】通过siRNA 干扰Beclin1 和Atg7 表达，检测自噬小体形成，Real-TimePCR检测干扰素因子表达，分析了细胞自噬对乙肝病毒感染细胞中干扰素形成的影响。【结果】干扰Beclin1和Atg7均可抑制细胞自噬发生，抑制细胞自噬可降低干扰素因子的表达，而对细胞活力和细胞凋亡无明显影响。【结论】抑制细胞自噬，可降低HBV 感染细胞中IFNβ 和IFI27 的表达，这在一定程度上意味着，HBV诱导的自噬具有增强感染细胞天然免疫反应的作用。

摘要:摘要:【目的】探讨犬白细胞介素-2(cIL-2)与犬IL-7(cIL-7)基因对犬细小病毒(CPV)VP2 蛋白DNA疫苗免疫增强的协同作用。【方法】利用含内部核蛋白体进入位点( IRES)的真核表达载体构建cIL-2和cIL-7双基因表达载体。然后利用本实验室构建的CPV VP2、cIL-2和cIL-7表达载体及本文构建的双基因表达载体，以不同组合对小鼠进行免疫，即VP2 单免疫，VP2+cIL-2、VP2+cIL-7和VP2+cIL-2/cIL-7共免疫。通过ELISA方法检测免疫后不同时间小鼠血清VP2 的抗体水平，并分析中和抗体的效价，通过细胞增殖实验检测免疫后小鼠脾脏淋巴细胞的增殖反应，并用ELISA 方法测定小鼠淋巴细胞γ干扰素的表达水平。【结果】本实验构建的双基因表达载体结构正确，并能够介导cIL-2与cIL-7基因在真核细胞中进行同步分泌表达。小鼠免疫结果表明，VP2+cIL-2/cIL-7共免疫组小鼠血清的抗体滴度和中和抗体效价均显著高于VP2+cIL2和VP2+cIL-7共免疫组(P＜0.05)。VP2+cIL-2/cIL-7共免疫组小鼠的淋巴细胞刺激指数比其它免疫组略有升高但尚未达到显著水平，然而γ 干扰素的表达水平显著高于其它免疫组(P＜0.05)。【结论】cIL-2和cIL-7基因对CPV VP2 DNA疫苗免疫原性的增强作用具有明显的协同效应。

摘要:摘要:【目的】从松材线虫伴生菌中筛选出高效降解纤维素的细菌菌株，初步鉴定后，对其相应的纤维素酶基因尝试克隆。【方法】首先从河南南阳松材线虫病疫区采集到的木材样本中，分离获得松材线虫。采用刚果红平板初筛法，从松材线虫伴生菌中获得具有分泌较高活性纤维素酶的细菌菌株。基于该菌株的形态学、生理学及16 s rDNA 序列特征等对高活性菌株进行分类鉴定。设计兼并引物，从高活性菌株中克隆该菌株的纤维素酶基因，并进行序列分析。【结果】获得7 株具有分泌较高活性纤维素酶的细菌菌株，其中编号为C8的菌株酶活最高。经鉴定该菌株归为肠杆菌属，命名为Enterobacter sp． C8。进一步从C8 菌株中成功克隆出该菌株的一个全长1104 bp的纤维素酶基因(GenBank JQ845065)，在NCBI 比对后发现该基因分别与产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)KCTC 2190的纤维素合成酶亚单位BcsC 的核苷酸序列有97%的同源性，氨基 酸序列有92% 的同源性;与克雷白氏肺炎菌( Klebsiella pneumoniae)的endo-1，4-D-glucanase 基因有82%的同源性，与不可培养的细菌内切纤维素酶基因有82%的同源性。【结论】本文首次从松材线虫伴生菌中筛选到了一株简单的产纤维素酶的细菌菌株并从中克隆出了一个新型纤维素酶基因，为下一步进行新能源的利用奠定了理论基础。

摘要:摘要:【目的】核黄素(vitamin B12，riboflavin)是辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)和黄素单核苷酸(flavin mononucleotide，FMN)的前体物，对生物体的生物合成至关重要。如果细菌不能够从外界摄取足够的黄素(flavin)就需要自身合成核黄素以维持菌体的生存与增殖。3，4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸合成酶(3，4-Dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase，DHBPs)为核黄素生物合成途径中关键酶之一。在镁离子存在的情况下，DHBPs 将5-磷酸核酮糖(ribulose-5-phosphate，Ru5P)转换成3，4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸(3，4-dihydroxy-2-Bu-tanone-4-Pho-sphate，DHBP) 和甲酸盐(formate)，生成的DHBP 为核黄素合成的必需原料之一。人类没有合成核黄素的相关途径，因此细菌参与合成核黄素的DHBPs 等相关酶就有望成为抗菌药物作用的靶位点。本课题通过对肺炎链球菌的DHBPs 进行克隆表达纯化与酶学性质鉴定，为开展其三维结构的解析和抗菌药物设计提供重要的工作基础。【方法】利用PCR 技术扩增DHBPs 基因，构建重组表达载体pW28-DHBPs。将其转入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)中表达，用Ni 离子亲和层析及离子交换(DEAE)纯化获得有活性的DHBPs 后，进行酶学性质鉴定。【结果】酶切和测序证实成功构建了质 粒pW28-DHBPs，在E． coli BL21 中表达了可溶性DHBPs，纯化后获得了纯度为95% 的靶蛋白质，经分子筛分析DHBPs 在溶液中以二聚体形式存在。对DHBPs 进行酶学性质分析表明，在25℃、pH 为7. 5 和Mg2 + 存在的情况下，DHBPs 具有将5-磷酸核酮糖转换成DHBP 和甲酸盐的活性。【结论】第一次成功克隆并在E．coli BL21 中表达了一种肺炎链球菌合成核黄素的相关酶—DHBPs，纯化后的重组DHBPs 具有较好的5-磷酸核酮糖分解活性，这为解析其三维结构和基于结构进行的新一代抗菌药物设计提供重要的工作基础。

摘要:摘要:【目的】了解高海拔低温缺氧条件下土壤环境中微生物生理生化特性及代谢产物【方法】采用Hungate厌氧操作技术从西藏纳木措高山草甸土壤中分离到一株肠球菌CJ-1。通过生理生化特征分析和16S rRNA基因序列的系统发育学分析确定该菌株的系统发育学地位。【结果】菌株CJ-1为兼性厌氧的革兰氏阳性菌，菌体呈不规则球形，大小为直径约1μm－1.5 μm，无鞭毛，不运动，成串珠型或成对排列。生长温度范围为10℃－50℃(最适温度为25℃);pH范围为5.0－8.5(最适pH 为7.0);NaCl浓度为0%－7%(最适NaCl浓度为5%)。能够利用葡萄糖、核糖、松三糖以及纤维二糖等多种碳水化合物，发酵纤维二糖的产物是乳酸、乙酸、丙酸、CO2、H2以及少量的丁酸。菌株CJ-1 的(G+C) Mol%为39.2%。与Enterococcus aquimarinus(CCM7283)的相似性达95.9%。菌株可利用纤维二糖，其在沼气发酵过程中充当中间代谢物。【结论】菌株CJ-1为耐低温肠球菌，可以降解纤维二糖等，且适应性较强，在发酵过程中具有重要意义，将其暂定命名为Enterococcus namtsoensis，模式菌株DSM23475T(=ACCC 00521T)。

摘要:

摘要: