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摘要:摘要:为了探究细菌内源质粒的功能，包括细菌耐药性、细菌共生、细菌荚膜形成、细菌的重金属抗性等方面，需要对细菌的内源质粒进行消除。本文综述了基于物理学、化学及分子生物学的细菌内源质粒消除方法，阐明了质粒消除的原理。结合笔者自身的研究对质粒消除技术进行了展望。

摘要:摘要:随着分子生物学技术发展与病毒基因组测序的推进，对地球上数量最大且广泛存在的病毒及其基因多样性的研究备受科学家们关注。迄今为止，仍未发现类似于细菌16S rDNA和真菌18S rDNA的病毒通用分子标记，但利用病毒某些家族的保守氨基酸序列设计简并性引物可研究环境中病毒多样性，并取得了一系列突破性成果。本文以编码噬藻体壳组装蛋白基因g20为目标，综述了噬藻体在海洋、湖泊和稻田中噬藻体基因多样性的研究进展，讨论了噬藻体g20基因分布与生存环境的相关性，发现不同的自然环境中都存在着独特的类群。同时指出了针对环境中噬藻体g20基因研究存在的问题及未来研究发展的趋势。

摘要:摘要:【目的】揭示个旧锡矿区尾矿库和矿坑土壤中可培养细菌的多样性;发掘一批锡矿区土壤细菌菌株并对其Pb2+、Cd2+耐受性进行评价。【方法】采用纯培养法和基于16S rRNA基因序列的系统发育分析对样品中可培养细菌多样性进行研究，平板法评价代表菌株对Pb2+、Cd2+的耐受性。【结果】使用2种培养基从尾矿库和矿坑土壤中分离到214 株细菌，对其中107株代表菌株的16S rRNA基因序列系统发育分析结果显示，菌株分属细菌域的5个门、12个目、25个科、42个属;其中变形菌门(Proteobacteria)是优势类群，占总菌株数的69.2%;假单胞菌属(Pseudomonas)菌株是优势物种，占24.8%;2株菌代表了2个潜在新类群。对105株代表性菌株的重金属耐受性研究表明，耐受浓度1000 mg/LPb2+或Cd2+的菌株分别占73.3%和8.6%，菌株对Pb2+的耐受性明显好于Cd2+;分离自锡尾矿库的菌株耐受不同浓度Pb2 +和Cd2 +菌株比例明显高于矿坑来源的菌株;分离自锡尾矿区的2 株菌(DT47-2A 和DT50-1)对1000 mg/L浓度Pb2+和Cd2+均具耐受性。【结论】个旧锡矿区土壤可培养细菌具有丰富的多样性，而且蕴含着不少潜在新类群;该环境中含有大量Pb2+、Cd2+耐受菌株，并对Pb2+、Cd2+具有较强的抗性或适应性。

摘要:摘要:【目的】阐明水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv．oryzae，Xoo) c-di-GMP信号受体和转录调控因子Clpxoo对葡聚糖酶基因(engAxoo)的转录调控作用机制。【方法】通过基因表达载体的构建和转化、蛋白诱导表达及其Ni-NTA Resin亲和层析，进行了clpxoo基因的原核表达和产物纯化。通过荧光素(FAM)探针标记和凝胶阻滞试验( EMSA)对Clpxoo 纯化蛋白与葡聚糖酶基因启动子(engAxoo-p)的结合活性及其c-di-GMP信号分子的抑制作用进行了测定分析。【结果】在优化的诱导表达和纯化条件下，成功地获得了Clpxoo纯化蛋白。Clpxoo 可与engAxoo-p序列发生阻滞现象，表明它具有与启动子特异性结合的活性。在反应体系中加入c-di-GMP可导致结合作用的消除。【结论】Clpxoo接受c-di-GMP信号后，可能通过构象的改变，从而与engAxoo-p的结合活性受到抑制;优化的Clpxoo蛋白纯化和EMSA方法可以用于后续的调控元大规模鉴定的研究。

摘要:摘要:【目的】明确从南京钾矿区土壤中分离到的一株矿物分解细菌的分类地位，阐明其对钾长石矿物的风化效应及机制，为深入研究微生物-矿物相互作用提供参考依据。【方法】通过16S rRNA 基因序列分析及其系统发育分析对菌株L11进行鉴定。采用摇瓶试验评估菌株L11对钾长石的风化能力，利用SEM/EDS观察钾长石矿物的形貌变化，使用X-射线衍射技术对小于2μm矿物进行了鉴定。【结果】菌株L11的16S rRNA 基因序列与Bacillusaltitudinis的相似性最高，为99.9%，初步鉴定其为Bacillus sp. L11。摇瓶试验表明，菌株L11能够通过产生有机酸风化钾长石矿物，释放出Si、Al和Fe等元素。通过SEM发现第30 d的钾长石表明形貌发生了较大变化，表面有许多细菌存在，并形成了一些球形物质，EDS分析表明其Fe的含量较高。XRD结果表明，钾长石经菌株L11作用后可能形成了新矿物———菱铁矿。【结论】菌株Bacillus sp. L11能够加速钾长石的风化，改变其形貌，并能诱导新矿物的形成。

摘要:摘要:【目的】鉴定sgvS 是绿灰霉素生物合成起始结构单元3-羟基吡啶甲酸的必需基因;测定绿灰霉素起始结构单元3-羟基吡啶甲酸的活化特异性。【方法】构建sgvS 的基因失活突变株和反式回补菌株，对其发酵产物进行HPLC 分析。并在突变菌株sgvS 的发酵液中分别添加3-羟基吡啶甲酸，吡啶-2-甲酸，3-氯-吡啶-2-甲酸，4-氯-吡啶-2-甲酸，3，5-二氯-吡啶-2-甲酸，烟酸，2-氟-烟酸，2-氯-烟酸，5-氟-烟酸，6-氟-烟酸和环哌啶-2-甲酸，用HPLC 分析其代谢产物的变化。【结果】突变菌株sgvS 丧失了绿灰霉素的生产能力，sgvS 基因反式回补突变株恢复了绿灰霉素的生产能力。向突变菌株sgvS 中添加3-羟基吡啶甲酸也能恢复绿灰霉素的生产，但添加其它上述衍生物均无法恢复绿灰霉素的生产或介导产生新的结构类似物。【结论】sgvS 是绿灰霉素及其骨架起始单元3-羟基吡啶甲酸生物合成的必需基因，SgvD1 对3-羟基吡啶甲酸结构单元的激活存在着严格的底物选择特异性。

摘要:摘要:【目的】解析氮源浓度对米根霉木糖代谢途径及产物的影响，提高木糖利用率。【方法】以木糖为碳源，考察不同氮源浓度下米根霉的生物量、有机酸积累量、木糖代谢关键酶(木糖还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)活力以及胞内还原力(NADH/NAD+、NADPH/NADP+)的差异。【结果】富氮条件下(2.4 g/L尿素)，木糖代谢速率达2.03 g/(L·h)，木糖还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活力以及胞内还原力较高，生物量达18.01 g/L，几乎不积累有机酸;限氮条件下(0.15 g/L 尿素)，木糖还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活力以及胞内还原力水平降低，生物量仅4.02 g/L，富马酸积累量为6.55 g/L，残余木糖量较高;氮源浓度为0.6 g/L 时，木糖还原酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活力以及NADPH/NADP+处于前二者之间，此时生物量9.11 g/L，有机酸积累量较大，其中富马酸为12.28 g/L。【结论】充足的氮源可使米根霉通过木糖代谢关键酶与胞内还原 力的协同效应强化木糖代谢活力，通过优化氮源浓度后，米根霉可积累更多有机酸。

摘要:摘要:【目的】利用酿酒酵母内部核糖体进入位点(IRES)介导构建外源蛋白高效表达系统，构建酿酒酵母蛋白表达工程菌，为酿酒酵母在代谢工程中的应用奠定基础。【方法】首先分别构建含启动子Pilv5，Padh2，Ptdh3 的Promoter-mCherry-TIF4631 IRES-URA3共表达框，利用同源重组的方法将共表达框整合到酿酒酵母W303-1B-A 基因组中，经URA3功能回复筛选转化子。然后比较转化子中mCherry荧光强度的差异，以表征三种启动子在共表达框中的应用效果。利用荧光定量PCR测定并分析转化子中整合DNA片段在基因组中的拷贝数，并在无选择压力的条件下连续传代培养转化子，分析其遗传稳定性。最后以木糖还原酶基因XYL1，β-半乳糖苷酶基因LACZ替换共表达框中的mCherry基因，检测木糖还原酶(xylose reductase)和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的酶活力、蛋白表达量等，以验证该表达框的应用效果。【结果】整合DNA片段的拷贝数和mCherry的表达量受启动子影响。其中含Padh2的转化子最低，含Ptdh3的转化子居中，含Pilv5的转化子最高。含有Pilv5启动子且mCherry表达量最高的转化子，整合DNA片段在基因组中的拷贝数为47，构建的工程菌株具有较好的遗传稳定性。在含Pilv5启动子和TIF4631 IRES的表达框中，木糖还原酶成功表达，其中活力最高的转化子WIX-10的酶活力为0.209 U/mg粗蛋白;β-半乳糖苷酶也成功表达，其中酶活力最高的转化子WIL-1的酶活力为12.58 U/mg 粗蛋白。【结论】在酿酒酵母中，由Pilv5启动子和TIF4631 IRES介导的外源蛋白表达系统能够高效表达外源蛋白，为外源蛋白在酿酒酵母中表达提供了新的策略，也为该系统在酿酒酵母代谢工程中的应用提供了充分的实验依据。

摘要:摘要:【目的】研究阳宗海酵母菌种群结构，分析生物因子及非生物因子对酵母菌种群分布的影响;测试阳宗海酵母菌产胞外酶活性。【方法】水样用醋酸纤维素滤膜过滤，原位培养分离酵母菌;梯度稀释法分离土样和底泥样品;对分离得到的菌株进行DNA 提取和测序，分析26S rDNA的D1/D2区域，并结合形态及生理生化指标进行鉴定;用产酶筛选培养基对分离得到的酵母菌进行产胞外酶活性测试。【结果】共分离得到201株酵母菌，鉴定分属于15个属48个种，其中包括10个潜在的新种;普鲁兰类酵母(Aureobasidium pullulans)，库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)，胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)，Cryptococcus podzolicus 是优势种;15.9%的酵母菌具有产胞外酶活性，主要是脂肪酶和淀粉酶。【结论】阳宗海酵母菌有较为丰富的多样性，人为活动对阳宗海酵母菌分布影响较大，其次浊度、电导率也是影响酵母菌种群分布的重要因素;阳宗海产胞外酶酵母菌可能参与湖泊生态系统的自然循环。

摘要:摘要:【目的】构建牛布鲁氏菌A19-ΔVirB12突变株并免疫BALB/c鼠，初步评估了其免疫保护效果。【方法】应用PCR方法扩增A19疫苗株VirB12基因的上下游同源臂序列，构建重组质粒pBK-CMV-SacBVirB12，将该质粒电击转化至布鲁氏菌A19感受态细胞中，筛选得到布鲁氏菌疫苗株A19的VirB12基因缺失株。以A19疫苗株为参照，应用A19-ΔVirB12疫苗接种BALB/c小鼠，免疫45d后布鲁氏菌2308强毒株攻毒，攻毒15d后取BALB/c鼠的脾脏进行克脾指数测定和病理组织学检测。Western-blotting鉴定VirB12 蛋白的免疫反应性。【结果】构建了牛布鲁氏菌A19-ΔVirB12突变株，小鼠免疫攻毒后15d，A19-ΔVirB12免疫组和A19免疫组的克脾指数与对照组之间有显著性差异(P＜0.05)。A19免疫组与A19-ΔVirB12免疫组之间克脾指数差异不显著(P＞0.05)。Western blotting实验表明VirB12蛋白具有免疫反应性。【结论】牛布鲁氏菌A19-ΔVirB12 突变株与亲本株A19免疫保护性无明显差异，通过血清学方法可区分疫苗免疫与野生型牛种布鲁氏菌(Brucella abortus)感染动物，具备作为标记疫苗的潜力。

摘要:摘要:【目的】确定蜱传脑炎病毒(Tick-born encephalitis virus，TBEV)对人单核细胞的感染性及对其复制增殖的影响。【方法】用蜱传脑炎病毒感染单核细胞THP-1，观察细胞病变情况。取不同时间点的细胞培养上清，测定病毒滴度，并用Real Time RT-PCR方法检测病毒核酸;用流式细胞法检测细胞感染率，以确定TBEV在THP-1细胞中的复制增殖情况;同时进行细胞活力检测，以确定TBEV感染后THP-1细胞的变化。【结果】TBEV病毒感染THP-1细胞后，可进行复制增殖，流式细胞法可检测到细胞内的病毒，感染病毒后的单核细胞活力显著降低。【结论】TBEV可在单核细胞THP-1中复制增殖，并可造成细胞活力的显著降低，提示单核细胞可能在TBEV感染机体并扩散至各组织器官过程中发挥了重要作用。

摘要:摘要:【目的】建立霉酚酸产生菌短密青霉菌的遗传转化体系。【方法】以腐草霉素抗性为选择标记，利用聚乙二醇介导原生质体融合，进行外源基因转化。【结果】聚乙二醇介导的短密青霉菌原生质体转化效率为每微克DNA 2－3个转化子;转化子的PCR检测结果显示外源基因已经整合到短密青霉菌基因组中，转化子抗性稳定。【结论】霉酚酸产生菌短密青霉菌转基因体系的建立为该菌进行分子生物学研究以及基因工程育种奠定了基础。

摘要:摘要:【目的】建立分离自西藏林芝的能够产生一系列具有抗肿瘤活性的二酮哌嗪类化合物(epipolythiodioxopiperazine，ETP)的一株冬虫夏草定殖真菌———粘帚菌( Gliocladium sp.) 6.102 的遗传转化体系。【方法】利用农杆菌介导的方式建立了粘帚菌的遗传转化体系;用正交试验研究了影响转化效率的因素，包括共培养所用农杆菌与真菌孢子的比例、共培养的时间、pH 值和乙酰丁香酮的浓度。【结果】成功建立了农杆菌介导的粘帚菌的遗传转化体系，得到了转化的最佳条件，其转化效率为50－100个转化子/106真菌孢子。通过农杆菌介导的方式分别将潮霉素B 磷酸转移酶基因(hph)和绿色荧光蛋白基因(egfp)转入粘帚菌中，实现了表达并且可以稳定存在。【结论】首次建立了农杆菌介导的粘帚菌遗传转化体系，为研究ETP化合物的生物合成及其调控机制奠定了基础。

摘要:摘要:【目的】从环境中分离筛选产蛋白酶、降解蛋白质的菌株，寻找使用价值较高的碱性蛋白酶。【方法】通过酪蛋白平板法分离筛选产蛋白酶菌株，经生理生化方法及16S rDNA 基因序列鉴定菌株;利用简并引物及基因组步移克隆蛋白酶完整开放阅读框;蛋白酶前体蛋白及成熟肽序列在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中进行重组表达;纯化活性蛋白酶后，利用化学合成多肽底物(succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide)检测酶活性质及其催化活力。【结果】分离到的菌株L010被鉴定命名为芽胞杆菌( Bacillus sp.)L010;蛋白酶开放阅读框包含了1149个碱基，编码382个氨基酸，氨基酸序列按其功能分为N端的30个氨基酸残基组成的信号肽，77个氨基酸残基构成的前导肽，C端275个氨基酸残基组成的成熟肽;此蛋白属于丝氨酸蛋白酶家族中枯草杆菌蛋白酶类(Subtilisins)成员，并命名为SprD;SprD的前体蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中重组表达时，在前导肽辅助下自加工为活性蛋白酶;SprD呈现出较高的催化活力，其反应最适条件为温度70℃，pH9－10。【结论】SprD在碱性(pH 7.0－ 10.0)、中高温(25℃－60℃)条件下的稳定性及较高的催化能力使其具有一定的研究和潜在利用价值。

摘要:摘要:红树林是热带亚热带潮间带的木本植物群落。为从海洋环境寻找新的天然产物，红树林已经成为放线菌资源收集、天然产物分离鉴定及其生物合成机制研究的热点。从巴哈马红树林分离的盐孢菌所产生的盐孢菌素(Salinosporamide A)已经进入临床研究。从红树林分离的放线菌类群已经达到8个亚目11科24属，并发现新属3个，新种31个。从红树林放线菌分离的新天然产物包括生物碱、喹啉等芳香类、阿扎霉素等大环类脂及吲哚衍生物等，大多数天然产物来源于红树林链霉菌。新型吲哚咔唑、吲哚倍半萜及厦霉素等以新颖的结构备受关注，相关生物合成途径已被揭示。

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