摘要:

摘要:

摘要:摘要:本文介绍了2013年度国家自然科学基金委员会生命科学部微生物学学科项目申请、受理和资助概况，分析了各分支学科和各类别项目申请的特点和存在的问题，以期为科研人员今后的项目申请提供参考。

摘要:摘要:莽草酸是芳香族氨基酸合成中的重要中间产物，具有广泛的药用价值，是抗流感药物“达菲”的重要合成前体。微生物发酵生产莽草酸具有许多优点，其中大肠杆菌常用于微生物大规模发酵生产应用。通过对大肠杆菌进行代谢工程改造，是构建工业化莽草酸高产菌的主要技术手段。磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(phosphoenolpyruvate:carbohydrate phosphotransferase system，PTS)是大肠杆菌细胞内参与葡萄糖从膜间质转运和磷酸化到胞内的主要活性转运系统，影响莽草酸合成前体磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的利用率。通过对PTS 系统的定向修饰和改造，调节细胞内代谢流向，提高碳源利用率，增加莽草酸前体合成量，结合对代谢途径中的特定修饰，能够构建出较为理想的莽草酸高产菌。研究显示在10 L放大体系中最佳产率可达0.36mol/mol，莽草酸浓度可达84g/L。本文针对代谢改造中莽草酸途径和葡萄糖转运系统的改造方面进行简单概述，并综述了近年来有关此方面的最新研究进展。

摘要:摘要:【目的】了解空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)在华南四省食品中的污染状况及其遗传多样性，为食源性病原菌的风险监测和控制提供基础数据。【方法】采用传统国标和MPN组合的方法对华南四省市售生鲜禽畜肉及其制品、生食蔬菜、熟食、水产品、速冻食品、奶制品、食用菌7 大类食品进行C.jejuni污染调查，对分离到的C. jejuni 菌株进行12种毒力相关基因检测分析和ERIC-PCR分型。【结果】2011－2012年共检测样品558份，检出阳性样品14份，检出率2.51%，其中肉与肉制品的检出率达13.2%，污染量达8.77 MPN/g，获得C. jejuni14株。毒力相关基因分析显示9种毒力相关基因的携带率超过50%，而pldA 和wlaN的携带率均为14.3%，virB11的携带率为0。ERIC-PCR分析结果显示15株C. jejuni可分为3簇共10种基因型，其中簇A中有4株的指纹图谱基本相同。【结论】华南四省中的生鲜禽肉类样品，存在不同程度的空肠弯曲菌污染，尤其是福州的鸭肉样品，其MPN值大于110 MPN/g，应加强生禽肉类的食品安全防控。

摘要:摘要:【目的】通过增加北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)PD-67 芳香族氨基酸合成的前体物质磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的供应，解除终产物对芳香族氨基酸合成途径中第一个酶同时也是关键酶3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合酶(DS)的反馈抑制并提高抗反馈抑制的DS的活力，使碳流更多地流向芳香族氨基酸合成途径，从而积累更多L-色氨酸。【方法】运用PCR 技术扩增北京棒杆菌PD-67磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因pps，与表达载体连接构建重组质粒pXPS;运用重叠PCR 技术定点突变大肠杆菌(Escherichia coli)受苯丙氨酸调控的DS基因aroG，使相应的编码氨基酸序列发生突变:Leu175Asp，新的基因命名为aroGfbr，与表达载体连接构建重组质粒pXA;构建pps和aroGfbr的共表达重组质粒pXAPS。将3个重组质粒分别转入菌株PD-67，构建工程菌株PD-67/pXPS、PD-67/pXA和PD-67/pXAPS。通过摇瓶发酵研究工程菌株的发酵特性。【结果】酶活分析结果表明，pps基因和aroGfbr基因在北京棒杆菌PD-67中均实现了表达。工程菌株PD-67/pXA粗酶液DS抗反馈抑制分析表明，AroGfbr已解除酪氨酸和苯丙氨酸的反馈抑制。过表达pps基因和aroGfbr基因分别使工程菌L-色氨酸产量提高12.1%和26.8%，双基因共表达可使工程菌的产酸量提高35.9%。【结论】北京棒杆菌PD-67pps基因的过表达以及大肠杆菌来源的解除反馈抑制的aroGfbr的过表达均有助于增加PD-67 L-色氨酸的合成，而双基因的共表达可以进一步提高L-色氨酸的积累量。

摘要:摘要:【目的】识别球孢白僵菌萌发和杀虫毒力相关的标记物。【方法】本研究对7个球孢白僵菌菌株的孢子进行萌发率和对茶毛虫毒力进行测定，采用基于LC-MS的代谢组学方法，识别菌丝和孢子提取物中与萌发和毒力有关的标记物。【结果】高毒力菌株的菌丝中具有高含量的carnitine、hercynine、acetylcarnitine、α，α-trehalose;Octa-Me、arg-arg-gln、phosphatidylethanolamine［PE (18∶2/0∶0)］、phosphotidylcholine［PC(18∶3/0∶0)］和PC(18∶2/0∶0)。高萌发率菌株的孢子中具有高含量的2，3-dimethylmaleate、acetylcarnitine、propionyl-carnitine 和PC(18∶2/0∶0)。高毒力菌株的孢子中具有高含量的histamine、2，5-pyrrolidinedicarboxylic acid; Diamide、carnitine、acetylcarnitine、propionyl-carnitine、butyrylcarnitine、PE (18∶2/0∶0)、PC(16∶1/0∶0)和PC(18∶3/0∶0)。此外，对菌丝中杀虫相关的环肽beauverolides，beauvericins和bassianolide进行相对含量比较分析，发现单独一种肽的含量高低与菌株对茶毛虫的毒力没有直接关系，但高毒力的Bb1898菌株中的9种肽同时具有较高的含量暗示它们可能发挥协同作用。【结论】毒力和萌发的共同标记物是脂酰肉碱和磷脂，它们可能具有维持附着胞膨压和为穿透寄主提供能量的功能。其它标记物，如在高毒力菌丝中发现的hercynine和α，α-trehalose; 高萌发率孢子中的2，3-dimethylmaleate，高毒力孢子中的histamine和2，5-pyrrolidinedicarboxylic acid Diamide，它们的作用原理有待进一步研究。

摘要:摘要:【目的】拓宽高产聚-β-羟基丁酸酯(poly-β-hydroxybutyrate，PHB)罗氏真养菌(Ralstonia eutropha)W50的碳源使用范围，使其获得D-木糖代谢能力。【方法】运用PCR 技术扩增大肠杆菌(Escherichia coli) K-12 W3110来源的D-木糖转运蛋白基因xylE，利用同源重组技术将xylE基因整合到R. eutropha W50的染色体上构建菌株W50-E。运用PCR 技术扩增E.coli K-12 W3110来源的D-木糖代谢基因xylAB和R. eutropha H16来源的PHA合酶基因phaC1的启动子片段Ppha C1，同表达载体连接后构建重组质粒p1-AB。将重组质粒分别转入菌株R. eutropha W50和W50-E中构建工程菌株W50-AB和W50-EAB。通过摇瓶发酵研究W50-AB和W50-EAB的D-木糖代谢特性。【结果】酶活分析结果表明，xylA 和xylB基因在菌株R. eutropha W50中得到表达。摇瓶发酵结果表明，W50-AB在含0.1 mol/L D-木糖的基础发酵培养基中的最大比生长速率为0.025 h－1，在含0.01 mol/L D-木糖的基础发酵培养基中没有生长;W50-EAB 在含0.01 mol/L D-木糖的基础发酵培养基中表现出一定生长，在含0.1 mol/L D-木糖的基础发酵培养基中最大比生长速率为 0.035 h－1。PHB含量分析结果表明，摇瓶发酵终点时，W50-AB和W50-EAB菌株内的PHB含量分别为细胞干重的15.07±1.01%和15.07±1.64%，其相应的D-木糖-PHB转化率分别为0.0920 g·g－1和0.0838 g·g－1，低于两重组菌株利用葡萄糖发酵的糖-PHB 转化率(＞0.22 g·g－1)。另外，重组菌株W50-AB和W50-EAB在含葡萄糖(0.01 mol/L)和D-木糖(0.09 mol/L)的混合糖培养基中的发酵结果表明，两重组菌株均表现出更高的生长速率和D-木糖消耗速率以及胞内PHB 积累量。【结论】来源于E.coli K-12 W3110菌株的xylAB 基因的表达使R. eutropha W50获得了一定的D-木糖代谢能力，通过D-木糖转运蛋白基因xylE的表达能提高菌株的D-木糖代谢能力，同时重组菌株利用D-木糖能积累一定量PHB。

摘要:摘要:【目的】了解瘤胃细菌第48家族糖苷水解酶基因(GH48)多样性，为木质纤维素高效降解提供新的基因资源。【方法】通过基因序列比对，设计gh48的简并引物;同时提取两个瘤胃样品的总DNA和总RNA，并将总RNA逆转录成cDNA。以总DNA和cDNA为模板，通过PCR扩增分别建立克隆文库并对克隆文库进行测序;对所得序列进行out种类划分和聚类分析。【结果】本研究共得到了455条编码GH48家族蛋白的基因序列，核苷酸序列之间的相似性为58.65%－100%。对序列的进一步分析表明，89%可以作为区分其种类的界定标准。以此为依据确定所得到的基因序列分别编码66种不同的GH48家族蛋白，分别聚为5个相对独立的类群，其中新类群C中OTU65所代表的序列是cDNA克隆文库中的优势序列，分别占两个cDNA克隆文库的36.4%和19.5%。我们的结果揭示瘤胃细菌gh48基因具有丰富的多样性，同时，其中也存在优势表达的GH48家族蛋白。

摘要:摘要:【目的】本工作对棘孢曲霉固体发酵抽提酶液转化甜菊糖进行了研究，并对转化产物进行鉴定及纯化分析。【方法】用高效液相色谱、液质联用及红外光谱等方法对转化新产物进行鉴定，对上清液中莱鲍迪苷A(RA)成分进行纯化。【结果】棘孢曲霉酶液在10 h内对甜菊糖中的甜菊苷(SS)、莱鲍迪苷C(RC)进行高效特异性转化，以沉淀的形式析出的转化产物经鉴定为甜菊醇，转化率高达98.0%，分离提纯后纯度为95.2%，回收率达84.0%．由于甜菊醇的沉淀分离，留在溶液中的RA更易被纯化。RA通过树脂吸附分离 的回收率为80.5%．【结论】棘孢曲霉酶液对甜菊糖的一次转化可以同时得到甜菊醇和莱鲍迪苷A两种产品，是一种经济高效的工艺。

摘要:摘要:【目的】了解我国沿海主要经济贝类中肠道病毒的污染分布对保障贝类食用安全具有重要作用。【方法】通过建立5 种典型人类肠道病毒的特异、灵敏、高通量的基因芯片检测技术，开展全国范围内沿海主要海水增养殖区经济贝类体内肠道病毒的污染调查。【结果】采集的162份经济贝类中肠道病毒的阳性检出率分别为:甲肝病毒4.3%;诺如病毒14.8%;轮状病毒6.2%;星状病毒5.6%;腺病毒9.9%，其中诺如病毒污染居于首位，该检测结果与PCR结果高度一致。我国沿海省市主要养殖区内贝类均受到了肠道病毒不同程度的污染，且不同省市之间差异不显著。在选取的6类经济贝类中，牡蛎中肠道病毒阳性检出率最高，其次是毛蚶和泥蚶。【结论】本研究表明，在我国，沿海主要经济贝类受到肠道病毒污染是一种较普遍的现象，给人类健康带来了潜在的危害，本研究为贝类食品的安全监控提供了基础数据资料。

摘要:摘要:【目的】通过多重PCR 检测和小鼠动物实验，对溶藻弧菌环境分离株的毒力因子进行评估，以期获得较强致病菌株和弱致病菌株之间的差别，并初步探讨该菌毒力因子对小鼠的致病机理。【方法】采用多重PCR体系检测毒力相关基因，我妻氏血平板溶血实验和平板酶活实验检测溶藻弧菌株的溶血素和胞外酶;以昆明小白鼠为实验动物，攻毒方式为灌胃和腹腔注射，根据小鼠的致病症状和死亡情况来分析和对比溶藻弧菌的胞外分泌物以及菌体本身的毒性。【结果】10株溶藻弧菌产淀粉酶、卵磷脂酶的比例为100%，脂肪酶、明胶酶次之(为70%)，脲酶均未被检出;神奈川现象阳性菌株率为60%。毒力基因检测的结果显示10株溶藻弧菌中toxR、Collagenase、tlh、FlaA、ompW、AspA、fur 这些与毒力有关的基因均有分布，而toxS、trh、tdh、UreR 并未检出。10株溶藻弧菌中的VA009 对小鼠显示了较强的致病性，能造成腹腔积液，经腹腔注射感染此菌后7 d内死亡率高达80%。【结论】不同的溶藻弧菌对小鼠的致病性存在较大差异，溶藻弧菌菌体本身比胞外分泌物对其毒性的贡献要大，而副溶血弧菌的毒性则由其胞外分泌物起主要作用;比较我们筛选出的强致病菌株与弱致病菌株，其上述毒力基因的分布并没有差别，说明溶藻弧菌可能存在一套与副溶血弧菌不同的独立的毒力基因系统。

摘要:摘要:【目的】构建可以在嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp．N16-5中表达外源基因的表达载体。【方法】以枯草芽孢杆菌表达质粒pHCMC04为基本骨架，删除木糖诱导的启动子和木糖阻遏蛋白基因，分别插入枯草芽孢杆菌组成型强启动子P43和嗜碱芽孢杆菌N16-5的组成型启动子PEF，构建表达载体pABN165P43和pABN165PEF;将绿色荧光蛋白基因gfp作为报告基因连接至表达载体得到pABN165P43-gfp和pABN165PEFgfp，利用原生质体转化法将其转化至Bacillus sp．N16-5，通过荧光显微镜和多功能荧光读板仪检测报告基因的表达情况。【结果】所构建的表达载体pABN165P43-gfp和pABN165PEF-gfp可以在Bacillus sp．N16-5中表达报告基因gfp，荧光定量数据显示，在7.5 h左右开始检测到绿色荧光蛋白的表达，从7.5 h到12 h荧光强度随时间增长迅速并在12 h左右达到最大，最大荧光值在7000左右。【结论】成功构建了2个嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp．N16-5表达载体，实现了外源基因在嗜碱芽孢杆菌中的表达。

摘要:摘要:易错PCR是基因体外诱变的主要方法之一，是通过在PCR 体系中添加Mn2+、提高Mg2+浓度和dCTP/dTTP浓度等措施达到基因诱变的目的。【目的和方法】本研究在不添加Mn2+、不调整其它任何PCR成分的情况下，通过降低dATP浓度的底物不平衡作用，对洋葱抗菌蛋白基因Ace-AMP1和苏云金芽胞杆菌毒蛋白(Bt)基因cry1A(c)进行了PCR诱变。【结果】结果表明:随着dATP浓度的降低，序列变异率和碱基突变率均呈升高趋势。当dTTP/dCTP/dGTP:dATP在20:1－40:1时，碱基突变率介于1.4%－1.8%之间，序列变异 率介于77.8%－100%之间。【讨论和结论】该方法简化了常规易错PCR诱变中的条件优化过程，简单实用。降低dATP浓度的诱变方法主要引起AT→GC的变异，适用于提高靶基因GC含量的体外诱变。本研究降低单一底物浓度的诱变方法可以提高诱变基因的AT或GC含量，是对易错PCR诱变方法的拓展。

摘要:摘要:【目的】探究甲酸对木糖乙醇发酵模式菌株休哈塔假丝酵母基因转录的影响规律，发掘抑制的目标基因及抑制特征。【方法】基于该酵母葡萄糖、木糖代谢转录组的研究成果，结合细胞代谢途径和人工基因比对筛选出乙醇发酵相关基因，再通过RQ-PCR对梯度甲酸抑制条件下的上述基因进行定量分析，进而发掘出甲酸抑制的目标基因。【结果】共筛选出42 个相关基因，经RQ-PCR 定量分析最终确定受甲酸显著抑制的基因10个，上调基因5个。【结论】在基因转录水平上，休哈塔假丝酵母中甲酸显著抑制的基因按照抑制强度降序排列为XYL2、ACS、RKI、TAL、GND1、TKL、ZWF1、XYL1、PDH 和PDC，按照上调强度降序排列为ALD、GLK、MDH、PFK、ADH。