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摘要:摘要:木质素是木质的主要成分之一，在自然界中，高分子木质素被真菌的胞外酶分解成低分子芳香族化合物，然后土壤细菌将其完全降解为二氧化碳。由此可见，木质素的完全降解过程是真菌和细菌的共同作用。研究细菌的降解机制，一方面可以理解芳香族化合物在生态系中的碳素循环，另一方面可以为木质素的有效利用提供基因和酶工具，将可再生资源的木质素转化成高附加价值的工业产品。Sphingobium sp. SYK-6是1987年从造纸厂废水中以木质素中的联苯化合物(5，5’-脱氢联香草酸)作为唯一碳源分离出的木质素化合物降解菌。在长达25年以上的研究中我们阐明了一系列芳香族化合物的代谢途径，克隆了相关基因，2012年随着基因组测序的完成，整个降解功能的全貌展现出来。介绍内容:(1)基因组信息;(2)芳醚化合物代谢;(3)联苯化合物代谢;(4)阿魏酸代谢;(5)木质素化合物降解过程中四氢叶酸依赖型机制;(6)原儿茶酸4，5开环途径;(7)3-甲氧基没食子酸代谢的多样性;(8)应用研究。我们希望SYK-6 菌株成为一个让人们理解木质素化合物降解的模式菌株。最后结合课题组现在的研究课题展望了木质素化合物的降解研究的发展方向。

摘要:摘要:【目的】分离鉴定同株罹病柑橘黄龙病植株不同显症状况组织的内生细菌，寻找与黄龙病菌［‘Candidatus Liberibacter asiaticus’(Ca．Las)］相互作用的优势菌株。【方法】利用基于16S rDNA的PCＲDGGE(Denaturing gradient gel electrophoresis)分析同一柑橘黄龙病罹病植株的显症和未显症组织内生细菌多样性，并用定量PCR 方法，对果、枝、叶3种组织黄龙病菌、优势菌株及细菌总数进行检测。【结果】结果显示显症和无症组织所带黄龙病菌差异很大，显症部位病菌量明显高于无症部位。分析显症和无症组织内生细菌DGGE图谱显示，同一组织内生菌群结构基本相同;对图谱中17条明显条带回收克隆测序，发现其中8个条带均属于沙雷氏菌属(Serratia)，占总条带数的47.06%。序列分析显示这8条序列为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)不同的菌株(序列相似性为99.63%)。定量分析各差异显症部位单位组织内的粘质沙雷氏菌和细菌总数，发现相同部位的总细菌量差异不显著，但粘质沙雷氏菌与黄龙病菌的量呈负相关。【结论】柑橘黄龙病病株中，各部位所带病菌量不均匀，是否显症与组织内柑橘黄龙病菌的量呈正相关，内生菌群总量与显症无相关性，但粘质沙雷氏菌与黄龙病菌的量呈负相关。粘质沙雷氏菌与黄龙病菌在韧皮部细胞内增殖过程中的相互作用值得深入研究。

摘要:摘要:【目的】实现在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中高效表达黑曲霉(Aspergillus niger) h408阿魏酸酯酶A基因(AnfaeA)，并对重组酶特性进行表征。【方法】采用重叠延伸PCR扩增黑曲霉h408 的阿魏酸酯酶A基因。将AnfaeA基因和毕赤酵母表达载体pPIC9K连接，成功构建重组质粒pPIC9K-Anfae，经线性化后电转化P. pastoris GS115，透明圈法筛选活性高的转化子后进行诱导表达。利用紫外吸收法测定温度及pH对重组阿魏酸酯酶活性的影响。【结果】成功从A．niger h408中克隆得到阿魏酸酯酶A的cDNA基因(GenBank: KF911349)，并实现了其在P．pastoris GS115中的高效表达。该基因长度为783bp，含有1个开放阅读框架(ORF)，编码260个氨基酸，Blast分析显示该基因和GenBank中黑曲霉阿魏酸酯酶序列同源性为99%。翻译的氨基酸序列含有脂酶典型的活性盖子和催化三联体结构。从转化板上获得1株编号为pPIC9K-Anfae5的转化子阿魏酸酯酶活性最高，酶活达24.72 U/mL，比活力为40.84 U/mg，比黑曲霉出发菌株(22.1 mU/mL)提高了1100倍左右。重组阿魏酸酯酶的最适pH为5.0，且在pH 4.0－9.0稳定性较好;最适反应温度50℃，在40－60℃时较稳定。【结论】阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的高效分泌表达为其在饲料工业和造纸工业等工业化应用提供了前提，也为后续改进酶学特性的定向进化奠定实验基础。

摘要:摘要:【目的】采用RT-PCR的方法分析致病性副溶血性弧菌毒力基因表达，并应用代谢组学的方法研究毒力基因不同表达水平下致病性副溶血性弧菌代谢组的响应。【方法】本文以致病性副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)ATCC33846为材料，分别提取不同温度(4、25 和37℃)下菌体总RNA和代谢组。采用相对定量的方法检测副溶血性弧菌tdh基因在不同温度条件下的表达差异，同时应用超高压液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用仪(UPLC/Q-TOF-MS)系统为工作平台检测其代谢组。采用主成分分析法(principal component analysis，PCA)比较副溶血性弧菌代谢组轮廓差异，并通过皮尔森和斯皮尔曼相关性分析法分析代谢组与tdh基因表达之间相关性。【结果】结果表明，不同温度条件下tdh基因表达强弱的排列顺序25℃＞4℃＞37℃;在tdh基因不同表达水平下发生显著性(P＜0.05)变化的主要代谢物是有机酸、氨基酸、醇、酮、酯;共得到11种代谢物与tdh基因表达高度相关(相关性系数︱r︱= 1，P＜0.05)，其中3种为负相关，8种为正相关，且醇类代谢物与tdh基因表达的正相关性最显著。【结论】本研究发现副溶血性弧菌代谢组与毒力基因表达存在一定的相关性，有望为副溶血性弧菌致病机理的深入探究提供一定的理论支持。

摘要:摘要:【目的】克隆并表达来源于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) TCCC 11826的L-异亮氨酸羟化酶(L-isoleucine-4-hydroxylase，IDO)，测定重组IDO酶学特性并构建用于4-羟基异亮氨酸(4-Hydroxyisoleucine，4-HIL)微生物转化的重组菌株，以考察该酶在4-HIL 合成中的潜在应用价值。【方法】以B．thuringiensis TCCC 11826基因组为模板PCR扩增ido基因并构建该基因过表达菌株BL-IDO;采用Ni-NTA亲和层析法分离纯化重组IDO后检测其酶学特性;构建重组株菌W3110-IDO进行4-HIL的微生物转化。【结果】克隆B. thuringiensis TCCC 11826的ido基因，测序结果显示该基因含723个核苷酸，编码240个氨基酸，与已报道的B. thuringiensis 2-e-2的ido基因相似度分别为97.47%和97.91%。此IDO含有His1-X-Asp/Glu-Xn-His2基序，属于Fe2+和α-酮戊二酸依赖型羟化酶家族;酶学实验表明该酶能够特异性地催化L-异亮氨酸生成(2S，3R，4S)-4-HIL，其Km和Vmax分别为0.18 mmol/L和2.10μmol/min/mg，最适反应温度和pH分别为35℃和7.0，该酶于35℃条件下放置5 h后仍具有85.1%的活性;在Escherichia coli W3110中过表达重组IDO，在未经优化条件下4-HIL最高转化率达89.28%。【结论】获得IDO编码基因序列(Accession No．KC884243)并首次较为系统地研究了其酶学特性，该酶反应条件温和且具有较高的活性及稳定性，在酶法或微生物转化法合成4-HIL中有较广泛的应用价值。本研究可为4-HIL及其它氨基酸衍生物的生物制造技术奠定理论基础。

摘要:摘要:【目的】研究原玻璃蝇节杆菌(DSM 20168)中D-氨基酸氧化酶的酶学特性。【方法】通过PCR从原玻璃蝇节杆菌(DSM 15035，20168)中克隆获得D-氨基酸氧化酶基因apdaao-1和apdaao-2，构建原核表达载体，以表达质粒pET-ApDAAO-2为模板，采用QuickChange Site-Directed Mutagenesis技术构建定点突变体，经过原核表达及纯化获得重组型和突变体酶蛋白，分析其酶学特性。【结果】通过原核表达及纯化成功获得了2个重组蛋白和4个突变体酶蛋白，SDS-PAGE检测显示其分子量均约为36 kDa;酶学特性分析表明，ApDAAO-2和突变体蛋白的最适反应温度为30℃;ApDAAO-2和T286A的最适反应pH范围为7.0－11.0，其它突变体为8.0－11.0;ApDAAO-2和突变体都具有较广泛的底物特异性，除T256K的最适底物为D-Phe外，其余均为D-Met;动力学参数测定结果显示，以二级表观常数kcat/Km表示，对于底物D-Met或D-Phe，ApDAAO-2和4个突变体的kcat /Km值均比ApDAAO-1和pKDAAO高数倍以上。【结论】ApDAAO-2及突变体具有比ApDAAO-1和pKDAAO更广泛的底物特异性和较高的催化效率，有一定的商业应用价值。

摘要:摘要:【目的】提高N-酰基高丝氨酸内酯酶(N-acylhomoserine lactonase，AiiA)酶活及温度稳定性。【方法】本研究基于AiiA同源蛋白的三维结构对AiiA进行定点突变，分析野生型AiiA及其突变蛋白酶活和温度稳定性。【结果】野生型AiiA较不稳定，在45℃下温浴30 min，或4℃储存5 d后均失去降解N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactone，AHL)的活性。但是突变AiiA蛋白(N65K，T195R和A206E)的酶活力较野生型AiiA均提高了20%以上，且4℃储存时间延长到7 d。此外，突变株N65K比野生型AiiA对高温具有更强的耐受性，在45℃温浴后剩余酶活力达到45%以上，55℃温浴30 min后仍保留5.0%的酶活力。【结论】通过定点突变改造AiiA蛋白结构，提升了AiiA蛋白的酶活和温度稳定性。

摘要:摘要:【目的】利用白腐真菌Trametes sp．SQ01漆酶转化2-羟基-6氧-6-苯基-2，4-己二烯酸(HOPDAs)，可以帮助我们进一步了解漆酶新的催化特性及解决多氯联苯降解过程中HOPDAs的积累问题。【方法】利用紫外可见光谱分析法，研究了漆酶对8种不同取代基的HOPDAs的转化情况，并对漆酶的稳态动力学参数进行了测定。【结果】漆酶可以在没有任何中介物的条件下催化HOPDAs，并生成无色的物质，尤其是漆酶可以催化3，8，11-3Cl HOPDA，而这一物质几乎不能被BphD和Rhodococcus sp．R04 转化。稳态动力学分析表明，在5种HOPDAs中，10-Cl HOPDA是漆酶的最适底物，其Km与HOPDA和8-Cl HOPDA相近。尽管3，10-2F HOPDA并不是漆酶的最适底物(Km=17.02 μmol/L)，但是它的转化效率(kcat/Km)是最高的。【结论】漆酶可以有效转化多种HOPDAs，这为多氯联苯的降解提供一种新的思路。

摘要:摘要:【目的】研究出芽短梗霉聚苹果酸聚合途径中苹果酰辅酶A连接酶基因及其酶学特性。【方法】通过设计兼并引物，采用IPCR技术从出芽短梗霉CCTCC M2012223的基因组中扩增得到苹果酰辅酶A连接酶基因的cDNA全长序列，构建表达载体，通过大肠杆菌异源表达，Ni-NTA柱层析纯化酶蛋白，分析其酶学特性。【结果】获得苹果酰辅酶A连接酶基因序列全长为1498 bp，编码440 aa，含有4个外显子和3个内含子。该重组酶最适反应温度为25℃，最适反应pH值为8.0，高浓度底物ATP明显对酶活性具有抑制作用，单体选择性表明对底物草酸、草酰乙酸、丁酸、丙二酸也具有很好催化活性。【结论】成功从出芽短梗霉CCTCC M2012223中克隆获得聚苹果酸聚合途径的苹果酰辅酶A连接酶基因，为聚苹果酸聚合途径解析及新型可降解材料创制奠定基础。

摘要:摘要:【目的】对抗感野生大豆材料根内生细菌的多样性进行比较分析，为研究野生大豆内生细菌与大豆孢囊线虫之间的相互关系奠定基础。【方法】在野生大豆抗大豆孢囊线虫3 号生理小种筛选基础上，利用扩增核糖体DNA 限制性分析(Amplified ribosomal DNA restriction analysis，AＲDＲA)和16S rDNA克隆文库测序相结合的方法，对抗感野生大豆根系内生细菌多样性及群落结构进行分析。【结果】野生大豆根内生细菌分属于6大类群，其中变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)为优势类群，相对丰度分别为46.8%和13.6%，另外有少量的放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、异常球菌-栖热菌门(Deincoccus-Thermus)和古细菌(Archaea)，18.8% 克隆序列与环境中未培养细菌的16S rDNA序列有较高的相似性。野生大豆高抗材料内生细菌的多样性比高感材料更为丰富，且抗感材料内生细菌优势菌群存在明显差异，中慢生根瘤菌(Mesorhizobium tamadayense)、肠杆菌(Enterobacter ludwigii)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)为野生大豆高抗材料特有的可操作分类单元(Operational Taxonomic Units，OTUs)中的优势种群。【结论】研究结果表明抗感野生大豆根内生细菌的优势种群存在明显差异，而内生细菌的优势种群与大豆孢囊线虫的相互关系正在深入分析研究。

摘要:摘要:【目的】探索新疆阿魏植物内生真菌的分离方法，了解其状况，为进一步深入研究其作用机理及应用价值提供基础。【方法】采用微生物学研究方法与技术，对新疆阿魏不同年份、不同部位的内生真菌进行了分离鉴定。通过分离率、分离频率、Shannon-Wiener多样性指数和Margalef丰富度指数等分析新疆阿魏内生真菌的分布、多样性及偏好性。【结果】本研究共分离得到内生真菌140株，经形态和分子生物学鉴定分别归属于18个属，其中，短梗霉属、链格孢属和叶点霉属为优势菌群，分别占总菌株数量的25.7%、16.4%和15.7%。不同年份的新疆阿魏中1－2年生新疆阿魏的Shannon-Wiener多样性指数(H’)和均匀度指数最高，分别为1.12和0.51，开花年份新疆阿魏的丰富度指数最高，为1.40;不同组织的新疆阿魏中，根的三项多样性指标最高，分别为1.27、1.26和0.55。此外，不同年份新疆阿魏中1－2年和3－4年生新疆阿魏中内生真菌菌群相似性系数最大，达到0.63;不同组织新疆阿魏中则以叶与茎中的相似性系数稍高，达到0.50。【结论】新疆阿魏不同年份及不同部位中的内生真菌分布及组成存在较大差异，具有一定的年份及组织的专一性。

摘要:摘要:【目的】优化稳定期慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)患者支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluids，BALF)细菌宏基因组DNA 的提取方法，以便于高效提取微量的细菌DNA 进行后续的PCR反应和测序。【方法】取稳定期COPD患者的BALF 5mL，离心收集细胞。为了有效提取样品中革兰氏阳性菌的基因组，对QIAGEN的DNA提取试剂盒的操作步骤进行优化:加入裂解缓冲液ATL后首先运用研磨珠和多功能生物样品匀质器破碎菌壁，再加入蛋白酶K 孵育，然后加入裂解缓冲液AL振荡混匀。无水乙醇沉淀DNA后，将全部溶液过柱，用洗液AW1和AW2各洗柱一次，最后加50μL洗脱液洗脱DNA。提取的DNA定量后，运用PCR方法检测样本中的细菌16S rDNA量，并按照测序要求构建DNA文库进一步验证。【结果】试剂盒优化法提取的BALF的DNA总量为467.5(135.0－1697.5)ng，明显高于按照传统酚-氯仿法提取的DNA 总量95.0(0－612.5)ng，并且所提取的DNA可以很好的扩增细菌的16S rDNA以及构建DNA文库，改良后的扩增产物明显增多(P=0.002)。【结论】使用DNA提取试剂盒结合研磨珠和多功能生物样品匀质器破菌壁的方法能够更高效的提取BALF中微量的宏基因组DNA，为进一步的测序和菌群分析打下基础。

摘要:摘要:【目的】原核表达空肠弯曲菌细胞致死性肿胀毒素B蛋白(CdtB)，制备其单克隆抗体(mAb)，并研究mAb抗毒性作用。【方法】扩增空肠弯曲菌cdtB基因并将其构建到pET-30a(+)和pGEX-6p-1表达载体，以原核表达的GST-CdtB蛋白为免疫原，应用杂交瘤技术进行细胞融合;采用间接ELISA方法测定细胞上清和mAb腹水效价，Dot-ELISA、Western blot分析mAb特异性，并以CaCo-2和HD-11细胞为模型，鉴定mAb抗毒性能力。【结果】成功构建重组原核表达质粒pET-30a(+)-cdtB和pGEX-6p-1-cdtB，并融合表达rHis-CdtB和rGST-CdtB蛋白。获得5株稳定分泌CdtB抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1F3，1F5，2E4，2E11，2F2。抗体Ig类和亚类检测显示2E11 Ig亚类为IgG2b，其他4株均为IgG1。抗体效价高达1:(1×108)。Dot-ELISA试验表明5株mAb均能与空肠弯曲菌标准株发生特异性反应，与非空肠弯曲菌呈阴性反应;Western blot法分析表明5株mAb均能与纯化蛋白rGST-CdtB有良好的反应性。基于CaCo-2细胞的黏附和侵袭实验表明mAb能显著降低细菌的黏附和侵袭能力(P＜0.01)。【结论】成功制备了针对空肠弯曲菌CdtB蛋白的mAb。为进一步研究空肠弯曲菌致病机制，以及为研制治疗性类药物奠定了基础。

摘要:摘要:【目的】利用大肠杆菌BL21λDE3表达系统，表达出有活性的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)ToxR截短体蛋白，为进一步研究ToxR的转录调控机制奠定基础。【方法】以VP基因组DNA为模板，PCR扩增ToxR蛋白DNA结合结构域(ToxR-N)的DNA片段，并将其直接克隆入pET28a中，获得重组质粒;将重组质粒导入大肠杆菌BL21λDE3 中，所得菌株经IPTG诱导后能表达出His-ToxR-N蛋白。利用限制级凝血酶切除His-ToxR-N中的His-标签，进而以VP的calR和VP1687为靶基因，通过体外的凝胶阻滞实验 (EMSA)验证ToxR-N蛋白的DNA结合活性。分别构建克隆有calR和VP1687上游启动子区的LacZ重组质粒，并将重组质粒转入野生株(WT)和toxR突变株(ΔtoxR)中，通过测定β-半乳糖苷酶活性来比较两株重组菌中靶基因启动子活性，以验证ToxR对calR和VP1687的调控关系。【结果】成功表达出有活性的ToxR-N蛋白，该蛋白对calR启动子区具有结合活性。LacZ结果显示ToxR对calR的转录具有激活作用，而对VP1687的转录具有抑制作用。【结论】所表达的ToxR-N可用于后续的转录调控机制研究;ToxR通过直接激活calR的转录表达，而间接抑制T3SS1相关基因的表达。

摘要:摘要:土壤微生物催化是大气中痕量甲烷(约1.8ppmv)氧化的唯一生物途径。目前的研究表明好氧土壤中存在专性和选择性大气甲烷氧化菌2种类型:前者(USCα和USCγ)广泛分布于各种好氧旱地土壤，其甲烷氧化酶对低浓度甲烷亲和力极高，属真正的寡营养型，但至今尚未获得该种类的纯培养菌株。后者属于传统甲烷氧化菌Methylocystis /Methylosinus 属，广泛分布于各种周期性排放高浓度甲烷的土壤环境中。该属大部分菌株含有亲和力不同的2 套甲烷单加氧酶系统，其中的高亲和力甲烷单加氧酶使这些菌株可以在相当长的时间内(＞3个月)保持大气浓度甲烷氧化活性，但其生长和繁殖还需依赖于土壤内部阶段性产生的高浓度甲烷。本文详细阐述了2 类大气甲烷氧化菌的发现历程及其可能的生存策略，最后系统梳理了几种关键的环境因子(土壤温度及湿度、土壤pH、植被、土地利用及氮输入)对大气甲烷氧化菌群落结构和甲烷氧化活性的影响，提出并展望了土壤大气甲烷氧化菌研究的重要方向。