摘要:

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摘要:多杀性巴氏杆菌是一种能感染多种动物甚至是人的重要革兰氏阴性病原菌。目前临床上用于多杀性巴氏杆菌诊断的分型方法主要包括血清学分型方法和分子分型方法。其中血清学分型方法主要基于免疫学实验技术建立，操作过程繁琐，技术要求高，工作量大，不适用于临床上大规模快速开展多杀性巴氏杆菌流行病学调查的需要；而基于分子生物学手段建立的分子分型方法相对于传统的血清学分型方法而言具有快速、简单、灵敏、灵活等特点，特别是某些分子分型方法与传统的分型方法形成了较为精确的对应关系，因而在临床上得到了广泛的应用。目前适用于临床上开展多杀性巴氏杆菌分离鉴定的分子分型方法主要包括多重PCR方法及多位点序列分型法（MLST），其中多重PCR方法又包括基于荚膜编码区及脂多糖外核编码簇建立的PCR方法。本文将重点就这3种常用的多杀性巴氏杆菌分子分型方法进行综述，介绍其建立原理、实现手段以及各自的优缺点，为临床上开展多杀性巴氏杆菌的流行病学调查特别是分子流行病学调查提供参考。

摘要:副结核分枝杆菌常引起感染牛的产奶量下降、持续性消瘦、顽固性下痢甚至死亡，给畜牧业带来了巨大的经济损失。牛通常在幼年期经口感染该菌并具有一个较长的亚临床期，后期才表现出临床症状，感染前期以细胞免疫为主并伴随着间歇排菌，经过一个2到5年的亚临床期后体液免疫应答增强，同时排菌量明显增加。目前对牛副结核病常用的检测方法有病原学检测方法，基于细胞免疫反应和基于体液免疫反应的检测方法。由于不同方法的反应原理不同，加之副结核分枝杆菌感染动物的特定免疫应答规律，在某一时间内各方法之间敏感性差异较大。本文简要阐述了牛副结核分枝杆菌的传播途径以及牛感染后的免疫应答特点，对牛副结核病的常见诊断方法进行了综述。

摘要:抗菌肽是生物体内诱导产生的一类具有抗菌作用的生物活性肽，在机体抵抗病原入侵方面起着重要作用。近年来，肠道微生态研究炙手可热，抗菌肽与肠道健康的研究正广泛开展。相关研究结果表明，抗菌肽表达水平的高低可以用来评估机体肠道健康状态，从而监测抗菌肽表达水平来建立一种疾病预防和治疗过程中的辅助诊断手段。本文围绕抗菌肽对肠道菌群结构和免疫影响两方面的最新研究进展进行归纳与分析，旨在为临床诊断与治疗提供参考。

摘要:[目的]为了研究泛素化对组氨酸转运及调控的影响。[方法]应用泛素化位点预测及定点突变等技术手段，Hip1p的3个潜在的泛素化位点K30、K42和K52被突变。这些突变的Hip1p被克隆到泛素化检测质粒中，检测泛素化位点突变对Hip1p的泛素化水平的影响。同时这些突变对细胞生长及组氨酸利用的影响也进一步做了检测。[结果]Hip1p的3个赖氨酸位点K30、K42和K52突变能有效降低其泛素化水平。同时，双重突变对其泛素化水平有明显的协同作用，并进一步影响了细胞生长和组氨酸利用。[结论]泛素化水平调控能有效调节组氨酸代谢，引起细胞对组氨酸利用的改变，为进一步研究氨基酸转运蛋白的调控机制提供了重要的依据。

摘要:[目的]对嗜热脂肪芽孢杆菌CHB1的环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）基因进行定向进化，筛选得到胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变酶。[方法]采用易错PCR技术向环糊精葡萄糖基转移酶基因中随机引入突变，建立酶基因突变文库，筛选获得胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变体，并对突变酶进行诱导表达、纯化及部分酶学性质研究。[结果]通过筛选获得CGTase胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变菌株ds-6和ep-9，其胞外α-环化活力分别是原始酶的1.72倍和2.18倍，可溶性表达量提高了1倍。序列分析表明，突变体ep-9有3个碱基发生了变化：G2005A/A2037G/T2081G，其中有2个碱基突变导致了氨基酸的改变。SWISS-MODEL数据库模拟CGTase的结构表明，2个突变氨基酸分别位于无规卷曲和β-转角/折叠之间的转角中。酶学性质测定表明：突变CGTase的β-环化比活力是原始酶的2.44倍，总环化比活力提高了34%，K_m值由4.3 g/L降低到3.74 g/L；在pH稳定性方面较原始酶有所提高。单碱基定点突变证实突变体ep-9可溶性表达水平及胞外酶活性提高的关键突变是G2005A。[结论]本试验表明：基于易错PCR技术获得嗜热芽孢杆菌CHB1的CGTase的胞外酶活和可溶性表达定向进化，G2005A突变对于提高CGTase的可溶性表达及胞外酶活起关键作用，这对认识CGTase的构效关系以及进一步改造该酶分子、扩大酶的生产应用具有重要意义。

摘要:[目的]家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）lef-11基因作为杆状病毒高度保守的晚期表达因子之一，对病毒晚期基因的表达极其重要。因此对lef-11基因进行有效RNA干扰将提高宿主细胞对BmNPV的抗性。[方法]本文基于经典的sh-RNA-loop骨架及家蚕内源性的miRNA骨架，构建以BmNPV lef-11基因为靶标的干扰载体pIZ-shRNA1、pIZ-shRNA2和pIZ-DsRed-amiR279；分别构建基于A4、IE1、IE1-295、IE2、IE2-339、hr3A4和hsp70启动子驱动的干扰载体，用以评价不同启动子驱动的干扰载体的抗病毒效果，并对干扰载体进行优化。[结果]首先，本文通过比较miRNA-based和shRNA-based RNAi载体对同一靶基因同一位点的干扰效率，发现pIZ-DsRed-amiR279对BmNPV lef11基因的干扰效率超过90%，远优于shRNA-based RNAi载体的干扰效果；其次，通过对干扰载体进行优化，发现IE1启动子的效果最优，由其驱动的pIZ-DsRed-milef11干扰载体也是本研究中的最优干扰载体，对病毒的增殖抑制效果最为明显。[结论]对目的基因的干扰效果并非启动子的活性越高、miRNA积累得越多就越好，只有综合考虑干扰片段的选择、启动子的活性以及靶基因自身的功能等多方面的因素，才能提高干扰效率，达到干扰目的。

摘要:[目的]探究荚膜对肠道外致病性大肠杆菌致病作用的影响。[方法]选取负责荚膜多糖转运的基因kpsE和kpsD，利用λ Red重组系统构建APEC E058和UPEC U17荚膜缺失株E058ΔkpsED和U17ΔkpsED，并通过一系列的体内及体外试验对其生物学特性及致病性进行研究。[结果]双基因缺失株的生长速度较野生株没有明显差异，但缺失株抗血清补体杀菌能力和抗鸡巨噬细胞HD-11细胞吞噬能力显著下降。1日龄雏鸡LD₅₀致病性试验结果显示，缺失株E058ΔkpsED和U17ΔkpsED对鸡失去致病力，而回复株毒力恢复至野生株水平；35日龄SPF鸡体内动态分布和竞争试验显示ΔkpsED缺失株在鸡体内定殖能力和竞争性生长能力显著下降，表明kpsED双基因的缺失能显著降低APEC E058和UPEC U17的致病力。[结论]荚膜与肠道外致病性大肠杆菌的致病性相关，是其重要的毒力因子。

摘要:[目的]揭示同一盐渍环境中不同种盐生植物根部内生细菌群落多样性特征和分布规律，结合根际土壤理化因子探讨其对内生细菌群落结构的影响。[方法]通过罗氏454高通量测序获得内生细菌16S rRNA片段，然后进行生物信息分析。[结果]研究的16种盐生植物其内生细菌群落主要由Proteobacteria、Tenericutes、Actinobacteria和Firmicutes 4个门的细菌组成。从植物“种”的水平来看，不同种盐生植物内生细菌群落存在差异；从植物“属”的水平来看，同一属的盐生植物内生细菌相似；从植物“科”的水平来看，藜科盐生植物内生细菌以Actinobacteria和Proteobacteria门为主；蒺藜科盐生植物内生细菌以Proteobacteria门为主；柽柳科盐生植物内生细菌以Tenericutes门为主；白花丹科盐生植物内生细菌以Proteobacteria、Fimicutes和Actinobacteria门为主。根际土壤中Cl^-含量对盐生植物内生细菌群落变化具有显著影响；而Cl^-、Mg²⁺和总氮组成的集合与内生细菌群落结构相关性最高。[结论]盐生植物内生细菌多样性丰富。在同一盐渍生境中，盐生植物内生细菌群落分布呈现宿主的种属特异性，根际土壤中Cl^-是影响其内生细菌群落变化的主要驱动因素之一。

摘要:[目的]构建Bacillus subtilis来源的γ-谷氨酰转肽酶蛋白（GGT）的Corynebacterium glutamicum SYPA5-5表达系统，验证该蛋白信号肽片段在宿主表达体系中的作用，并将该体系应用于高效合成茶氨酸的研究。[方法]将该ggt基因和切除信号肽的片段基因（Δsp ggt）在C.glutamicum SYPA5-5中克隆表达。以C.glutamicum SYPA5-5高产L-精氨酸培养基为基础进行重组菌产酶优化。最优转化条件为：L-谷氨酰胺：乙胺为1：3，酶量为0.06 U/mL。采用底物流加策略高产L-茶氨酸，40 mL的转化体系包含：终浓度为0.9 U/mL的GGT，pH 10，37℃，从0 h开始每隔2 h补加20 mmol/L的L-谷氨酰胺，60 mmol/L的乙胺。[结果]C.glutamicumSYPA5-5/pXMJ19-ggt发酵上清液中GGT酶活达到（4.69±0.34）U/mL，C.glutamicum SYPA5-5/pXMJ19-Δsp ggt只检测到胞内酶活（0.99±0.17）U/mL，说明利用B.subtilis来源的信号肽可以实现GGT在C.glutamicum体系中分泌表达。最适产酶培养基条件为：葡萄糖浓度为10%；IPTG最适添加时间为0 h。批次流加在12 h时达到最大茶氨酸产量104.36 mmol/L，转化率为86.9%。[讨论]本文首次实现B.subtilis来源的γ-谷氨酰转肽酶基因（ggt）在C.glutamicum SYPA5-5中分泌表达，通过分批流加底物获得目前报道的利用重组C.glutamicum合成L-茶氨酸的最高产量。

摘要:[目的]探索过氧化物酶体增殖剂（Peroxisome proliferators，PPs）对稻瘟病菌生长发育及致病性的影响。[方法]在6种不同的PPs诱导下，观察比较稻瘟病菌过氧化物酶体数量及相关基因表达、生长速率、孢子萌发、附着胞形成与致病性的差异。[结果]在不同的PPs诱导下，稻瘟病菌过氧化物酶体数量均呈现明显的增加，同时过氧化物酶体形成相关基因PEX8、PEX11、PEX14的表达量升高；PPs影响病菌菌丝生长、分生孢子萌发及附着孢形成，并导致致病性的减弱。其中，2，4-D与阿司匹林的抑制效果最为显著。同时，2，4-D与ASA对稻瘟病菌过氧化物酶体形成突变体Δpex5和Δpex7的生长抑制效果与野生菌株相比明显增加。[结论]首次将PPs类化合物用于模式丝状病原真菌稻瘟病菌的研究。研究发现6种PPs均能够引起过氧化物酶体的增殖，并可抑制稻瘟病菌生长发育，降低致病性。

摘要:[目的]以从冬枣分离的内生枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis St-zn-34）为供试菌株，明确反复冻融对菌体形态及其发酵滤液抑制枣缩果病初侵染病菌（Alternaria alternata）活性的变化。[方法]对供试菌株分批发酵后进行反复冻融，采用梯度稀释计数法、滤纸片法分别测定活菌数量和芽孢含量、发酵滤液抑菌活性，对供试菌株的形态变化进行电镜观察。[结果]发酵培养中pH值、活菌量、芽孢量及抑菌活性随发酵时间的增加均呈先上升后下降的趋势，其中发酵60 h发酵滤液抑菌活性最大，对此时的发酵液反复冻融，冻融3次枯草芽孢杆菌活菌量和发酵滤液抑菌活性依次减少，以后再冻融差异不显著（P>0.05），电镜观察发现随冻融次数增加，菌体变小，表面凹陷、扭曲，胶状物流出。抑菌谱检测发现发酵滤液对12种植物病原菌具有抑菌能力。不同温度和蛋白酶处理发酵滤液表明，低于60℃以下，抑菌活性与对照相比差异不显著；80℃以上抑菌活性随温度上升而下降，与对照相比差异显著；蛋白酶K可降低抑菌活性。[结论]反复冻融影响细菌形态并降低发酵滤液的抑菌活性。

摘要:[目的]克隆温泉中嗜热嗜酸的脂环酸芽孢杆菌D-1（Alicyclobacillus tengchongensis CGMCC1504）的内切葡聚糖酶基因gluE1，并对该酶进行序列分析和重组酶的酶学特性分析。[方法]通过全基因组测序获得gluE1全长，并对其氨基酸序列（GluE1）进行分析。将gluE1重组到载体pEASY-E2中并转化到大肠杆菌BL21（DE3）中异源表达，利用组氨酸标签纯化GluE1并进行酶学性质分析。[结果]gluE1与NCBI数据库中GH5的内切葡聚糖酶具有较高的相似性，全长1020 bp，GC含量50.5%，编码339个氨基酸（40.45 kDa）。GluE1与数据库中序列的最高一致性为97%，与其余纤维素酶的一致性<60%。GluE1可水解CMC-Na、可溶性淀粉和大麦β-葡聚糖，表观最适pH为6.5，pH 5.0-10.0稳定并维持60%以上的酶活性。GluE1的表观最适温度为55℃，在37℃下稳定。在55℃ pH 6.5条件下，GluE1对大麦β-葡聚糖的K_m、V_max和k_cat分别为8.58 mg/mL、416.67 U/mg和280.90 s^-1。GluE1受Ag⁺、Hg²⁺及SDS抑制，β-巯基乙醇、Pb²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺和Na⁺对GluE1有微弱的促进作用，NaCl对GluE1的影响不大，加入30%的NaCl，仍有64%以上的酶活性；经30%的NaCl在37℃下处理60 min，仍能保持93%以上的活性。[结论]首次报道从Alicyclobacillus属的细菌中克隆得到内切葡聚糖酶基因并对其酶学性质进行研究，GluE1具有良好的pH稳定性和有较强的耐盐性，可能具有更大应用潜力。

摘要:[目的]分析浓香型白酒酒醅发酵过程中氨基甲酸乙酯前体物质瓜氨酸含量显著增加的原因，确定酒醅中能够利用精氨酸并积累瓜氨酸的微生物，为解析白酒中氨基甲酸乙酯的形成机制提供研究基础和理论依据。[方法]采用高通量筛选技术，从浓香型白酒酒醅中分离具有高精氨酸利用能力和高瓜氨酸积累特性的菌株，并通过基因型和表现型验证以及模拟窖内发酵验证它们对瓜氨酸积累的贡献。[结果]共筛选获得20株具有高精氨酸利用能力的菌株，其中Lactococcus garvieae LD3，Bacillus amyloliquefaciens BG5，Pediococcus acidilactici PH7和Staphylococcus pasteuri SH11具有较高的瓜氨酸生成能力，并可使酒醅中瓜氨酸含量显著增加。[结论]筛选获得的4类微生物均能够通过ADI途径代谢积累瓜氨酸，是导致酒醅瓜氨酸含量增加的原因。

摘要:[目的]通过优化获得最佳酶活配比，设计近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）CCTCC M203011的（S）-羰基还原酶Ⅱ与枯草芽孢杆菌（Bacillus sp.）YX-1葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌中的共表达体系，实现重组菌高效催化2-羟基苯乙酮，合成（S）-苯乙二醇。[方法]分别从重组大肠杆菌中纯化了（S）-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶，研究了2种酶共催化2-羟基苯乙酮的最佳酶活比例，最适催化温度和pH，由此构建（S）-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶的共表达体系。[结果]（S）-羰基还原酶Ⅱ的比酶活力为1.3 U/mg，葡萄糖脱氢酶的比酶活力为13.5 U/mg。在总酶活力为1 U时，（S）-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶共催化体系中，确定了2种酶的最佳比例在1：1到5：1（U/U）之间，最适反应温度为30℃，pH为7.0。在此基础上构建了（S）-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶基因比为1：1的共表达体系，共表达重组菌破碎上清液中（S）-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶酶活分别为0.76 U/mg和0.73 U/mg，两者的酶活比例为1：1。在上述确定的最适催化条件下，其催化10 g/L 2-羟基苯乙酮，产物（S）-苯乙二醇的光学纯度和得率均高达99%以上。与仅含有（S）-羰基还原酶Ⅱ的重组大肠杆菌相比，共表达体系转化产物（S）-苯乙二醇的得率明显提高，且转化时间由原来的24 h缩短为13 h。[结论]通过确定（S）-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶最佳酶活配比，为构建手性催化的靶酶和辅酶再生酶共表达体系，为实现手性化合物的高效制备提供了研究基础。

摘要:[目的]研究高浓度的2-KLG对其生产菌株氧化葡萄糖酸杆菌生产过程中关键的脱氢酶合成基因、辅因子合成基因及其转运蛋白编码基因的影响。[方法]测定高浓度梯度2-KLG下氧化葡萄糖酸杆菌的生长情况，确定合适的添加浓度对氧化葡萄糖酸杆菌进行胁迫。使用实时定量PCR技术检测2-KLG合成中关键山梨醇脱氢酶基因sldAB、关键辅因子PQQ合成基因pqqABCDE及5个潜在转运蛋白合成基因的变化。[结果]根据氧化葡萄糖酸杆菌在2-KLG高浓度梯度下生长测定实验结果，选定40、80和120 g/L 2-KLG作为添加浓度。实时定量PCR结果显示，在高浓度的2-KLG压力下，PQQ合成基因pqqABCDE未受到显著影响，山梨醇脱氢酶基因sldAB以及部分PQQ潜在转运蛋白编码基因的表达均显著下调。[结论]高浓度2-KLG会抑制氧化葡萄糖酸杆菌中山梨醇脱氢酶基因的表达，有可能会影响辅酶PQQ的转运，但不会显著影响辅酶PQQ的合成。

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