摘要:

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摘要:抗生素等抗菌药物的滥用在全球范围内造成了多重耐药菌的传播。多重耐药菌（Multidrug resistantorganisms，MDRO）以及耐药基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）可在人类、动物和环境之间进行传播，尤其是ARGs可以通过水平转移的方式在同种属或者不同种属的菌群之间进行传播，使得细菌耐药问题日益严重，耐药机制趋于复杂，疾病治疗更加困难，对人类公众健康造成严重的威胁。因此抗生素等抗菌药物的使用应加以规范。

摘要:类胡萝卜素是一类超过700种的萜烯基团类不饱和化合物的总称，根据结构可分为胡萝卜素族和叶黄素族，具有较高的营养价值。八氢番茄红素脱氢酶是类胡萝卜素生物合成途径中的首要限速酶，它参与催化无色的八氢番茄红素转变成有色类胡萝卜素，发挥着中心调控作用。不同生物源的八氢番茄红素脱氢酶在功能上呈现多样性，在大多数蓝细菌，藻类和高等植物的类胡萝卜素生物合成途径中，由CrtP，CrtQ和异构酶CrtH或PDS，ZDS和异构酶Z-ISO、CrtISO共同参与番茄红素的形成，而在大多数微生物中只有CrtI-type一种酶来完成八氢番茄红素的脱氢反应，且根据脱氢步骤的不同分别可生成链孢红素、番茄红素或脱氢番茄红素。本文阐述了不同生物源八氢番茄红素脱氢酶的基因分离与鉴定，功能多样性及表达调控机制等最新研究进展，并进行了进化分析，为八氢番茄红素脱氢酶的深入研究及利用基因工程策略生产类胡萝卜素的应用提供重要信息。

摘要:单细胞及单细胞基因组学研究是近年生命科学研究的热点之一，微生物单细胞基因组学研究是继微生物元基因组学（又称宏基因组学，Metagenomics）之后新发展起来的，可有效获取环境中大量无法培养的微生物遗传信息的技术。微生物单细胞基因组技术包括单细胞获取、全基因组扩增、全基因组测序以及数据分析等步骤，目前该技术在环境微生物研究中的应用主要集中于探索未被元基因组技术或其它常规技术探测到的新型功能基因，或是对环境中物种丰度极小的未培养微生物的发现，以及对微生物细胞生命进化过程的研究等。本文对微生物单细胞基因组技术中单细胞获取和全基因组扩增所涉及到的不同方法以及应用此技术对环境微生物取得的主要研究进展进行综述。

摘要:[目的] 获得锰氧化细菌，对锰矿周边土壤中生物所参与的锰氧化过程进行初探。[方法] 依据细菌是否能氧化Mn（Ⅱ），形成棕褐色锰氧化物进行筛选。利用染料LBB对生成的锰氧化物进行检测。通过考察分离菌株的形态、生理特征和16S rRNA基因、gyrB基因、gyrA基因序列的同源性对分离菌株进行鉴定。分析筛选菌与所在属已知锰氧化菌的亲缘关系。利用LBB显色法检测氧化锰的动态生成，通过扫描电镜-能谱分析和X射线衍射技术分析生物氧化锰的表征。[结果] 获得1株锰氧化细菌菌株，命名为CP133，综合形态、生理及分子分析结果，鉴定为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），分离菌株与多株分离自海洋及土壤的芽孢类锰氧化菌在进化上具有一定的差异。与其他菌株比较菌株CP133具有较强的锰氧化能力，进入稳定期后可生成紧密结合在菌体周围的无定形态生物氧化锰。[结论] 从锰矿周边土壤分离出1株具有较强锰氧化功能的蜡样芽孢杆菌，丰富了土壤芽孢类锰氧化菌的资源，同时也为锰矿周围土壤与锰氧化菌间的生物地球化学循环提供了线索及材料。

摘要:[目的] 通过不同双基因共表达策略对亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶基因在大肠杆菌中表达影响的研究，获得具有高辅酶再生效率的双酶共表达重组生物催化剂，实现L-叔亮氨酸“一锅法”高效不对称合成。[方法] 以来自于蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）的亮氨酸脱氢酶（LDH）和来自芽孢菌属（Bacillussp.）的葡萄糖脱氢酶（GDH）为模板，考察单质粒共表达，双质粒共表达和融合表达等3种共表达策略对重组细胞中亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶活的影响，比较不同酶活比例和不同催化剂形式对三甲基丙酮酸不对称还原制备L-叔亮氨酸效率的影响。[结果] 研究发现不同共表达策略对亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的影响存在明显差异。亮氨酸脱氢酶在不同策略下均能够正常表达，而葡萄糖脱氢酶在融合表达时没有活力，当C端含有组氨酸标签时，表达蛋白活性低。通过表达优化，获得3株亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶高效表达且具有不同酶活比例的重组菌。比较粗酶液和全细胞形式下的催化效率，发现酶活比例及催化剂形式对不对称还原反应效率具有重要影响。确定单质粒串联表达C端不含His标签重组菌E.coli BL21/pET28a-L-SD-AS-G为最佳催化剂，以粗酶液进行转化时，完全转化0.5 mol/L底物所需菌体量为15 g/L，辅酶量为0.1 mmol/L。[结论] 采用单质粒共表达策略，成功构建出1株具有较高亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶活性的重组菌，实现高效催化TMP合成L-Tle。

摘要:[目的] 通过缺失井冈霉素高产菌株TL01中4个典型的色素合成基因簇来考察其对井冈霉素产量、菌体生长和发酵液颜色的影响。[方法] 通过同源重组双交换对4个色素合成基因簇进行逐个同框缺失，HPLC检测突变株井冈霉素产量的变化，qRT-PCR检测突变株中井冈霉素合成基因转录变化，通过称量菌丝体干重来绘制其生长曲线。[结果] 和出发菌株TL01相比，多巴类黑色素基因簇缺失株PY06中井冈霉素的发酵产量由原来的20.6 g/L上升至23.1 g/L，提高了12%；Ⅲ型聚酮合酶编码的黑色素基因簇缺失株PY07产量无明显变化；Ⅱ型聚酮合酶编码的孢子色素基因簇缺失和褐黄素基因簇缺失分别导致井冈霉素产量下降11.7%和17.2%。所有缺失突变株中井冈霉素基因簇转录水平和发酵液颜色均没有明显变化。[结论] 不同色素基因的缺失对井冈霉素产量和菌株生物量积累具有不同的影响。多巴类黑色素与井冈霉素的生物合成过程竞争共同前体，将其中断后使前体流向井冈霉素生物合成，达到了进一步提高产量的目的。

摘要:[目的] 阐明霍乱弧菌DsbA蛋白（VcDsbA）在生物被膜形成过程中的作用。[方法] 采用Overlapping PCR的方法构建VcDsbA基因敲除质粒pMH524；采用同源重组和基因克隆的方法对霍乱弧菌dsbA（vc0034）基因进行敲除和回补；通过结晶紫染色实验，比较野生株（WT）、dsbA突变株（ΔdsbA）和回补菌株（CΔdsbA）的生物被膜形成差异；用荧光素酶基因作为报告基因分析与生物被膜形成相关的甘露糖敏感血凝素纤毛合成蛋白（Mannose-sensitive hemagglutinin，pili biogenesis protein，MSHA）在霍乱弧菌WT、ΔdsbA和CΔdsbA中表达水平的区别。[结果] 成功构建霍乱弧菌dsbA基因缺失突变株和回补株；与WT相比，ΔdsbA生物被膜形成能力显著下降，且msh操纵子的表达水平显著降低。[结论] VcDsbA可能通过影响其它调控因子直接或间接增强霍乱弧菌MSHA的生物合成，从而促进霍乱弧菌生物被膜的形成。本文为进一步研究DsbA在霍乱弧菌生物被膜形成中的调控机制奠定了基础。

摘要:[目的] 研究抗菌肽P7抑制大肠杆菌的非膜作用机制。[方法] P7与溴化乙锭竞争结合大肠杆菌基因组DNA的荧光光谱，分析P7与DNA的结合方式；流式细胞术分析P7与大肠杆菌基因组DNA结合对细菌细胞周期的影响；采用磁珠富集和PCR扩增相结合的方法分析P7特异结合的DNA序列；通过实时荧光定量PCR分析P7对大肠杆菌DNA复制和SOS损伤修复基因表达的影响；核酸染料的荧光分析研究P7对大肠杆菌DNA和RNA合成的影响。[结果] P7以嵌插的方式作用于大肠杆菌基因组DNA碱基对并形成肽-DNA复合物，使溴化乙锭-DNA复合体系的荧光强度减弱。P7可以显著增加大肠杆菌细胞周期中S期细胞数目，抑制大肠杆菌DNA复制。P7特异性结合rnhA使该基因表达水平显著下调2.24倍。同时，在肽的影响下参与大肠杆菌DNA复制相关的ssb、dnaG、ligB和rnhA基因的表达水平显著下调（P<0.05），DNA损伤修复的recA和recN基因显著上调（P<0.05）。P7可降低大肠杆菌DNA和RNA的合成。[结论] P7特异性地结合rnhA序列引起大肠杆菌DNA的损伤并抑制大肠杆菌的DNA复制。在P7的影响下，参与大肠杆菌DNA复制相关的基因的表达水平下调，DNA损伤修复基因显著上调，同时抑制大肠杆菌DNA和RNA的合成。

摘要:[目的] 通过负链RNA病毒反向遗传学操作，构建并拯救以T7启动子表达系统为基础的牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3）微型基因组。[方法] 分别构建表达该病毒NP、P和L蛋白的辅助质粒px8δT-PT1-bPIV3-NP、px8δT-PT1-bPIV3-P和px8δT-PT1-bPIV3-L以及含增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）开放读码框（Open reading frame，ORF）、BPIV3前导序列（Leader region）、转录起始信号（Gene start signal，GS）、转录终止信号（Gene end signal，GE）和尾随序列（Trailer region）等顺式作用元件（Cis-acting elements）的微型基因组质粒pSC11-bPIV3-EGFP，鉴定正确后，采用2种不同方法拯救BPIV3微型基因组，并通过观察荧光表达情况判断是否拯救成功。[结果] 成功构建了基于T7启动子表达系统的BPIV3微型基因组，并实现了拯救。[结论] 该系统的成功构建，有助于今后对BPIV3开展基因修饰研究。

摘要:[目的] 马链球菌兽疫亚种是工业上生产透明质酸的主要菌种，该菌能产生引起宿主细胞溶血的链球菌溶血素S（streptolysin S，SLS）毒素，因而其产品的安全性一直是人们所担心的问题。本实验的目的就是通过基因敲除的方法构建不产SLS的透明质酸生产工程菌，同时探讨溶血素sagA基因缺失对菌株透明质酸合成和其他毒力因子的影响。[方法] 利用温度敏感/自杀性质粒pJR700载体系统，构建马链球菌兽疫亚种sagA基因缺失突变株；通过PCR扩增，溶血平板和SLS含量测定等方法确定sagA基因缺失；采用分光光度、SDS-PAGE和细胞毒性试验等分析方法，对野生菌株和sagA基因缺失突变菌株透明质酸含量、透明质酸分子量、溶血素Hylc、透明质酸分解酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和菌体表面蛋白等相关毒力因子进行对比研究。[结果] 获得了透明质酸产量提高30%而溶血活性极低的马链球菌兽疫亚种sagA基因缺失突变株。该突变株与野生菌株相比较，透明质酸分解酶活性增加而透明质酸相对分子量降低，此外，与毒力相关的表面蛋白含量、溶血素Hylc和甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性也显著降低。细胞毒性实验结果表明，野生菌株与sagA基因缺失突变菌株的培养物上清液，对细胞活性的影响存在显著差异。[结论] 在马链球菌兽疫亚种中sagA不仅是表达溶血素SLS的基因，同时sagA基因对菌株透明质酸合成、透明质酸分解酶、菌体表面蛋白、溶血素Hylc和甘油醛-3-磷酸脱氢酶等都具有调节作用。

摘要:[目的] 斑马鱼的生活环境中微生物众多，会激活其先天免疫系统，从而影响相关试验结果，因此需建立适合于感染与免疫研究的斑马鱼无菌培养体系。[方法] 建立了基于受精卵短时消毒和温控正压无菌隔离器的培养流程；根据无菌动物标准对斑马鱼胚胎及其生活环境进行微生物检测；并通过定量PCR检测无菌斑马鱼先天免疫相关基因（TLRs）表达水平；利用无菌斑马鱼胚胎模型进行了单增李斯特菌感染试验。[结果] 本研究成功建立了斑马鱼培育的无菌操作系统，无菌检验结果显示其生活环境及体内不含病原微生物，先天免疫分子TLRs表达量较低或不表达，而常规培养斑马鱼以及浸泡感染单增李斯特菌的无菌斑马鱼中这些基因转录水平较高。无菌斑马鱼对单增李斯特菌强毒株EGDe静脉注射感染很敏感，100 CFU感染量能导致鱼在1周内全部死亡，而其mpl或plcB基因缺失株感染后致死率显著下降（分别为70%和40%）。巨噬细胞在亲本株EGDe浸泡感染的鱼肠道周围聚集，而mpl或plcB基因缺失株感染的鱼中几乎观察不到这一聚集现象。[结论] 通过简易培养体系获得的无菌斑马鱼胚胎可用于先天免疫和病原感染机制等研究。

摘要:[目的] 探索基于pH值敏感的荧光染料分析腺病毒裂解T淋巴细胞胞内体膜的实验方法。[方法] 本文以Jurkat细胞（T淋巴瘤细胞）为靶细胞，将pH值敏感的荧光染料pHrodo dextran与5型腺病毒（Ad5）共同孵育Jurkat细胞，对pHrodo dextran孵育的浓度与时间进行了优化，利用激光共聚焦显微镜分析胞内相对平均荧光强度百分比随时间的变化情况，反映Ad5诱导胞内体膜裂解情况。[结果] 研究结果表明，在pHrodo dextran终浓度为80 μg/mL，孵育时间为10 min条件下，在病毒感染后的30 min，相对平均荧光强度百分比出现显著下降；利用巴佛洛酶素A1抑制胞内体膜质子泵活性后，相对平均荧光强度百分比出现轻微下降。[结论] 建立了基于pHrodo dextran分析腺病毒诱导T细胞胞内体膜裂解的新方法。

摘要:[目的] 采用体外发酵技术探究芳香族氨基酸在猪后肠的发酵特性。[方法] 以杜×长×大育肥猪回肠、盲肠和结肠食糜为接种物，接种于10 mmol/L单一氨基酸的培养基中，37 oC培养24 h，测定4、8、12、16和24 h的产气量（GP），采集0 h和24 h样品，测定样品中的氨氮（NH₃-N）和微生物蛋白（MCP）浓度，利用变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）和Real-time PCR定量技术分析体外培养中参与代谢特定氨基酸的细菌组成及数量。[结果] 不同芳香族氨基酸的发酵液中NH₃-N和MCP浓度存在极显著差异（P<0.01），肠段对GP、NH₃-N和MCP影响极显著（P<0.01），且芳香族氨基酸与肠段对GP、NH₃-N和MCP浓度均存在交互作用（P<0.01）。定量PCR表明，芳香族氨基酸和肠段均显著影响发酵液中总菌数量（P<0.05）。DGGE分析显示，同一肠段不同芳香族氨基酸组的细菌群落结构具有高度的相似性，其中回肠Phe组和Tyr组、结肠Tyr组和Trp组的相似性分别高达87.9%和80.5%，盲肠和结肠微生物香农指数变化显著（P<0.05）。[结论] 不同芳香族氨基酸的肠道代谢菌具有差异性，与Trp和Phe相比，Tyr的盲肠和结肠代谢菌多样性较低，与Trp和Tyr相比，Phe更多地合成菌体；特定芳香族氨基酸的不同肠道发酵去向不同，与回肠和盲肠比，结肠中芳香族氨基酸更多地合成菌体。

摘要:[目的] 为探究UASB颗粒污泥启动的单室微生物电解池（Single-chamber microbial electrolysis cell，SMEC）对Ni（Ⅱ）的去除途径和SMEC中微生物群落的动态特征。[方法] 以乙酸钠为底物，采用单因子控制方法分析SMEC对Ni（Ⅱ）的去除途径和应用Illumina高通量测序技术解析SMEC启动过程中微生物群落的组成和结构动态学特征。[结果] 结果表明，SMEC对重金属的去除主要通过吸附和微生物作用。经培养驯化功能菌群发生变化。成熟单室微生物燃料电池（Single-chamber microbial fuel cell，SMFC）阳极生物膜菌群主要是Proteobacteria（变形菌门，91.42%）中的Geobacter sp.（地杆菌属，76.25%）；阴极生物膜菌群主要是Bacteroidetes（拟杆菌门，47.99%）中的Niabella sp.（布鲁氏菌属，33.01%）和Proteobacteria（45.74%）中的Ochrobactrum sp.（苍白杆菌属，10.80%）。成熟SMFC改装成的SMEC在12.5 mg-Ni（Ⅱ）/L下，阳极生物膜菌群由单一优势菌Geobacter sp.转变为Geobacter sp.（41.56%）和Proteobacteria中的Azospirillum sp.（固氮螺菌属，5.97%）；阴极生物膜菌群由Niabella sp.和Ochrobactrum sp.转变为Firmicutes（厚壁菌门，25.21%）中的Acetoanaerobium sp.（19.28%）、Proteobacteria（51.42%）中的Dokdonella sp.（16.48%）和Azospirillum sp.（9.49%）。[结论] 本研究表明，污泥微生物经SMFC和SMEC驯化过程及Ni（Ⅱ）的淘汰和选择，在电极上形成了稳定、高效产电与除镍菌群，优势菌群为Proteobacteria。

摘要:[目的] 利用NIa基因，阐明甘蔗线条花叶病毒（Sugarcane streak mosaic virus，SCSMV）的种系发生关系，为预测SCSMV流行变异趋势及科学防控提供理论依据。[方法] 从云南蔗区和国家甘蔗种质资源圃采集感病样品，RT-PCR扩增获得SCSMV NIa基因序列后，使用Splits Tree、RDP、PhyML、DnaSP等软件分析SCSMV中国分离物的系统发生、选择压力及基因流动等特征。[结果] 共获得23条SCSMV NIa基因序列。这些序列间未发生重组，云南蔗区的部分序列形成1个新簇，且云南蔗区与国家甘蔗种质资源圃之间的基因交流不显著。此外，选择压力分析表明，NIa基因受很强的负选择压力作用。[结论] 与P1、HC-Pro和CP等基因类似，SCSMV在NIa基因上也包含5个簇；SCSMV云南分离物具有较高的遗传多样性和清晰的地理相关性。

摘要:[目的] 菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）作为典型的同型发酵产D-乳酸的优势菌株，能够高效生产高纯度的D-乳酸。该菌株发酵受到多方面环境因素影响。糖代谢的关键酶例如葡萄糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶以及乳酸脱氢酶均为由葡萄糖代谢成为乳酸的关键酶，该菌中相关代谢酶的研究是发酵调控至关重要的基础。分析S.inulinus的基因组表明有3个推测为D-乳酸脱氢酶的基因，其中已有报道研究了1个双功能蛋白[bifunctional protein（BP）]。本研究分别克隆并解析了另2个D-乳酸脱氢酶同工酶的性质。[方法] 本研究以S.inulinus Y2-8基因组DNA为模板，克隆得到2个D-ldh基因（dldh、dhdh），经测序分别为D-乳酸脱氢酶[D-lactic acid dehydrogenase（DLDH）]和D-羟基酸脱氢酶[D-isomerspecific 2-hydroxyacid dehydrogenase（DHDH）]的基因。构建的重组菌表达蛋白DLDH，DHDH均具有催化丙酮酸生成D-乳酸的功能。[结果] 重组菌表达的蛋白经镍柱亲和层析达到电泳纯。SDS-PAGE分析表明DLDH的表观分子量为37 kDa，DHDH的表观分子量为39 kDa。此外，DLDH以丙酮酸为底物时K_m值为（0.58±0.04）mmol/L，对底物有较高的亲和力，最适反应温度为35℃，最适pH为6.5；而DHDH以丙酮酸为底物时K_m值为（1.70±0.08）mmol/L最适反应温度为30℃，最适pH为7.5。另有报道的BP以丙酮酸为底物时K_m值为（3.40±0.02）mmol/L，最适反应温度为30℃，最适pH为5.5。[结论] 根据对底物丙酮酸的亲和力，最适温度及最适pH，推测DLDH是乳酸发酵中产D-乳酸的主导催化剂。结合相关酶学性质的分析可为今后的发酵调控提供理论依据。