摘要:

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摘要:几乎所有细菌的生长都离不开铁元素。在有氧的环境中,三价铁离子几乎无法被细菌直接利用。但是在宿主胃肠道中,铁元素主要以可溶性的亚铁离子形式存在,它们可通过革兰氏阴性菌外膜直接进入胞周质,在周质通过亚铁离子转运系统,将铁离子转运至胞浆供细菌利用。绝大多数阴性菌主要是通过Feo转运系统利用亚铁离子,大肠杆菌的Feo转运系统由feoA、feoB和feoC 3个基因组成。除Feo转运系统外,还发现Yfe转运系统、Efe转运系统、Sit转运系统等。本文重点介绍革兰氏阴性菌Feo转运系统的组成及作用机制,以期为进一步研究细菌亚铁离子的转运机制提供参考。

摘要:近年来研究发现,副黏病毒基质蛋白(Matrix protein, M)是一种多功能病毒蛋白,在细胞内不仅能抑制宿主细胞基因的转录和翻译、调节病毒基因组的复制和转录以及招募细胞蛋白协助病毒粒子组装和出芽,还可以通过自身的泛素化和磷酸化修饰促进病毒的复制。然而,作为副黏病毒成员之一的新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV),其M蛋白目前仅证实参与了NDV的组装和出芽释放过程,其它副黏病毒M蛋白的功能在NDV中尚不清楚。本文结合近年来国内外副黏病毒M蛋白功能的相关研究进展,将NDV与其它副黏病毒M蛋白功能进行比较,着重阐述了M蛋白在NDV毒力、复制和致病性等方面的功能和作用机制,并对NDV M蛋白功能研究中存在的问题和今后的研究方向进行了展望。

摘要:[目的] 本研究通过对不同PVY分离物基因的测序及分析,从而了解PVY株系的多样性,进而对PVY病毒的分子检测及防治提供重要的资料和参考。[方法] 本研究针对黑龙江15个马铃薯Y病毒样品的P1基因进行克隆测序和进化树分析。[结果] 经比对分析,样品被分成两组,有10个样品的基因类型高度同源,且相对保守,是本地区的优势群组,无论是与国内其它地区样品比较还是与国外样品比较,其亲缘关系都有一定距离;而另一组中的5个样品的P1基因与本地优势组群有较大差异,且这5个样品间也有一定的差异,并与国内其它地区和国外一些样品的P1基因序列比较接近。通过比对GenBank中已上传的序列提供的PVY株系的信息,得知本次试验的P1基因与PVY^NTN-NW株系是相似的,且这15个样品与国内其他样品一样都是由PVY^N株系演变而来。[结论] 由P1基因分析表明,PVY受环境影响较大,黑龙江10个样品的PVY在长期的进化中产生了具有地方特点的变化,而后来的5个样品说明中国大部分PVY有可能是跟随国外品种资源的引进进入,同时PVY也随国内不同区域间资源交流和种薯调运而传播。

摘要:[目的] 从饲喂富含几丁质饲料的大黄鱼肠道分离具有几丁质分解功能的菌株并分离鉴定新的几丁质酶。[方法] 利用胶体几丁质平板分离饲喂杂鱼的大黄鱼肠道中的几丁质分解菌。对几丁质酶基因chi-X进行了克隆并在大肠杆菌中表达。对CHI-X的酶学性质进行了分析。[结果] 从饲喂杂鱼的大黄鱼肠道内容物中分离出1株具有几丁质分解功能的费氏柠檬酸杆菌,其中的几丁质酶基因编码1个含493个氨基酸残基的蛋白,其中包含一个糖苷水解酶18家族催化域。CHI-X对胶体几丁质具有分解功能。最适pH和温度分别是4.0和60 ℃。 CHI-X具有很强的pH稳定性,在pH 3.0-11.0的范围培育1 h仍保留90% 左右的活性。Mn²⁺, Li⁺和K⁺可促进CHI-X酶活,Ag⁺对CHI-X有抑制作用。CHI-X对蛋白酶和石斑鱼肠道内容物有较强的抗逆性。CHI-X可分解胶体几丁质为N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰葡萄糖胺二聚体,表明它是一个几丁质外切酶。最后,CHI-X和另一个几丁质酶Chi565表现出酶活性的加和效应。[结论] 分离自肠道菌的CHI-X能很好适应海水鱼类的肠道环境,可以作为温水海水养殖鱼类的饲料添加剂使用。

摘要:[目的] 建立了单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,单增李斯特菌)的肽核酸(Peptide nucleic acid, PNA)分子信标(Molecular beacon)的荧光扫描检测方法,以简化普通PNA原位荧光杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)检测方法中显微镜观察步骤。[方法] 在具有单增李斯特菌特异性的肽核酸探针的5′和3′分别标记报告荧光基团和淬灭基团形成分子信标PNA探针,利用FISH技术和荧光扫描技术对单增李斯特菌进行检测。[结果] 用普通PNA探针进行荧光扫描检测时,以N1处理为空白对照,假阳性率11.4%,假阴性率为0;以N2处理为空白时,假阳性率降低至4.3%,但假阴性率上升为18.6%。用分子信标PNA探针进行检测时,用N1为空白对照时,假阳性率8.6%,假阴性率为1.4%;以N2处理作为空白时,假阳性率5.7%,假阴性率为1.4%。与普通探针比较,分子信标PNA探针能有效减少假阳性和假阴性的发生。2种普通PNA探针的杂交成功率分别为83.3%和95.2%;2种“分子信标化”的肽核酸探针的成功率分别为91.7%和90.5%,表明探针两端标记并不会降低与目标菌的杂交成功率。[结论] 将液相PNA-FISH和荧光扫描技术结合,通过大通量快速的荧光扫描检测可大幅提高检测效率。同时将肽核酸探针分子信标化,有效的降低了荧光扫描结果的假阳性,并通过了N1和N2两种空白对照处理把假阴性控制在较低的范围。

摘要:[目的] 研究光滑球拟酵母(Candida glabrata)中AMP代谢影响其碳流代谢和耐酸胁迫的生理机制。[方法] 同源重组法敲除基因cgade12 (ORF CAGL0K05027g)和cgade13(ORF CAGL0B02794g)构建双缺菌株cgade12Δade13Δ,与出发菌株(ATCC55)比较ATP水平、碳流代谢酶活性和中间代谢物含量变化分析和AMP代谢对其碳流代谢的影响,对比菌株有机酸胁迫下生长情况及胞内环境变化,研究AMP代谢变化对光滑球拟酵母酸胁迫耐受性的影响。[结果] 与出发菌株ATCC55相比,cgade12Δade13Δ的ATP水平下降了12.50%。与ATCC55相比,cgade12Δade13Δ中柠檬酸合成酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶的活性分别上升了31.26%、19.45%、28.96%、18.36%,柠檬酸、α-酮戊二酸、苹果酸、琥珀酸含量分别提高了44.11%、73.60%、50.00%、65.68%。胞内丙酮酸浓度下降20.00%,丙酮酸产量下降73.11%。与ATCC55相比,cgade12Δade13Δ在0.4%丙酮酸、0.6%苹果酸和0.2%乙酸胁迫下的菌体浓度分别提高了8.71%、11.21%和12.71%。在0.2%乙酸胁迫下,菌株cgade12Δade13Δ的H⁺-ATPase活性、细胞膜完整度、细胞膜电势分别比出发菌株ATCC55上升了7.04%、8.71%、25.14%,ROS水平下降了19.51%。[结论] 基因cgade12、cgade13的缺失导致菌株的ATP水平下降,TCA循环活性和有机酸耐受性上升。

摘要:[目的] 微生物诱导成矿是近年来地质微生物学领域研究中的热点之一。采用一株分离自喀斯特地区的岩生放线菌DHS C013^T菌株,研究该菌株及其代谢产物在由NaHCO₃、Ca(NO₃)₂·4H₂O组成的成矿体系中对CaCO₃生成及形貌的影响。[方法] 将在葡萄糖麦芽酵母提取物(MGYP)培养液中培养的放线菌上清液、菌丝球、发酵液以及无菌的MGYP培养液和超纯水分别加入成矿体系,SEM观察不同处理成矿体系中的底部沉淀物。[结果] 在超纯水成矿体系中只形成标准菱面体方解石,而在添加放线菌及其代谢产物甚至含有机质的培养液则可形成形态各异的CaCO₃晶体,如球形、哑铃以及表面具有鳞片状的柱形。这些特殊形态的CaCO₃晶体的形成,可能是在放线菌的菌丝球和菌丝片段以及胞外分泌物上成核和逐渐生长的结果。[结论] 放线菌菌丝体及代谢产物对调控和影响CaCO₃的晶体形貌有重要作用。研究结果对进一步认识放线菌及其代谢产物诱导生物成矿提供了新的证据。

摘要:[目的] 初步探讨酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中Snf1/AMPK蛋白激酶影响细胞壁完整性的机制。[方法] 通过同源重组交换的方法,构建酿酒酵母Snf1/AMPK蛋白激酶催化亚基的敲除菌株snf1Δ,并通过基因回补对敲除菌株表型进行验证。在含有刚果红(Congo red)和荧光增白剂(Calcofluorwhite)的平板上检测snf1Δ菌株细胞壁的完整性,通过qRT-PCR的方法检测snf1Δ菌株中已知的细胞壁合成相关基因的表达情况。[结果] SNF1基因敲除影响细胞壁的完整性,并影响酿酒酵母对热激应答的反应。进一步研究发现,SNF1突变菌株中β-1, 3-葡聚糖合成相关基因与β-1, 6-葡聚糖合成相关基因的表达量均明显降低。[结论] 结果显示酿酒酵母Snf1蛋白激酶影响细胞壁的完整性,此影响发生在转录水平上,即通过调节细胞壁合成相关基因的转录来实现,揭示了Snf1蛋白的一个新角色。

摘要:[目的] 本研究旨在建立一种简单快捷的炭疽水肿因子(EF)重组表达及纯化方法。[方法] 构建GST-EF融合表达载体,基于EF基因的密码子使用偏好,选择菌株Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL为表达宿主,对EF进行诱导表达;细胞透性技术分离粗蛋白,进而利用亲和层析一步法纯化EF;Native-PAGE、竞争性抑制实验及cAMP浓度分析用于鉴定EF的生物活性。[结果] 实现了EF可溶性高效表达,透性化处理可有效抽提可溶性重组蛋白;利用亲和层析一步法纯化得到了纯度达96%的EF;EF可与保护性抗原(PA)结合形成水肿毒素,该毒素能够急剧提高CHO-K1细胞中cAMP的浓度。[结论] 本研究建立了一种高效快速制备具有生物活性的炭疽水肿因子的方法,为炭疽相关研究工作提供了新的选择。

摘要:[目的] 初步探讨利用四环素类药物体外诱导嗜水气单胞菌耐药后,嗜水气单胞菌对四环素类药物敏感性的变化及其耐药机制。[方法] 筛选临床分离嗜水气单胞菌的四环素类敏感株,从含有1/4×MIC的强力霉素的TSA固体培养基开始,等比2倍提高诱导药物质量浓度对受试菌进行连续传代培养,以获得高耐诱导株;测定诱导菌对强力霉素和16种非诱导药物的最小抑菌浓度(MIC)及添加外排泵抑制剂N-甲基吡咯烷酮(NMP)后的MIC,分析其敏感性变化与外排作用的关系;提取诱导菌的DNA,PCR扩增其5个tet基因并测序。[结果] 诱导后菌株对强力霉素的MIC显著升高,对非诱导四环素类药物也有不同程度提高,对氟喹诺酮类药物的MIC比诱导前增加几十至上千倍;对氨基糖苷类药物和利福平的MIC则有不同程度的降低;添加NMP后,所有诱导菌株对强力霉素的MIC值均有不同程度的下降;四环素类耐药基因的检测结果表明,在诱导后7号菌株中同时检测到tetA和tetE;在诱导前后的2号菌株中检测到tetC;在诱导前后的1、3、4、5、6、7号菌株中均检测到tetE。[结论] 本研究表明tetE基因可能是介导气单胞菌分离株对四环素类药物耐药的优势基因,为阐明嗜水气单胞菌对四环素类药物耐药机制及耐药性与耐药基因之间的关系提供理论依据。

摘要:[目的] 生物农药安全无害,环境友好。为了评价寡雄腐霉发酵液(Pythium oligandrum broth,POB)的动物安全性和防病促生效应,研制高效、无害的生物农药。[方法] 试验利用自主分离的寡雄腐霉生防菌株(P. oligandrum CQ2010)制备POB,通过动物试验、拮抗试验、盆栽和生产试验,研究了POB的动物毒性,对黄瓜蔓枯病的防治作用,以及对黄瓜生长、产量和品质的影响。[结果] 用大剂量的POB灌胃给药对小鼠体重增长无显著影响,其外观和行为均无异常,组织器官也未见病理改变。POB对甜瓜球腔菌的抑制率为51.95%,药效介于1∶800的百菌清溶液和1∶200的甲基托布津溶液之间。在黄瓜幼苗接种甜瓜球腔菌前后喷施POB,叶片丙二醛含量下降,过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性增强,发病率和病情指数均显著降低,相对防治效果达到54.8%-64.1%,故POB能减轻病原菌对细胞膜的伤害,激发防御性生理反应,增强黄瓜植株的抗病能力。此外,POB处理提高叶绿素含量,增强根系活力,增加植株氮、磷、钾吸收量,促进黄瓜植株生长,生物量和果实产量分别提高81.10%和11.58%。POB还使黄瓜果实Vc和可溶性糖提高,硝酸盐含量降低。[结论] 寡雄腐霉发酵液对动物安全无毒,能有效防治黄瓜蔓枯病,促进黄瓜生长,提高产量品质。

摘要:[目的] 以标志链带藻(Desmodesmus insignis)为实验材料, 研究不同氮源及其浓度对该藻生长、总脂和淀粉(碳水化合物)含量的影响,为该藻在生物能源方面的应用提供一定的理论依据。[方法] 以硝酸钠、碳酸氢铵或尿素为氮源,5个氮浓度(3、6、9、12和18 mmol/L)的BG-11培养基培养标志链带藻,采用干重法测定生物质浓度、重量法测定总脂、苯酚-硫酸法测定、总碳水化合物和淀粉的含量。[结果] 标志链带藻在3种氮源下均能很好的生长。最高油脂含量出现在3 mmol/L硝酸钠实验组,达到32.61%(d·w)。当18 mmol/L碳酸氢铵作为氮源时,总碳水化合物与淀粉的含量以及产率都达到最高,分别为56.54% (d·w) 和55.33% (d·w)、0.24和0.23 g/(L·d)。以尿素为氮源时,其生物质浓度和各组分含量与其它氮源实验组差别不大,均有利于该藻的生长及各生化组分含量的积累。[结论] 以该藻种生产生物能源的成本等综合考虑,以18 mmol/L碳酸氢铵和尿素为氮源培养标志链带藻最优。

摘要:[目的] 利用Avi-tag和Pull down技术建立体外靶基因筛选的新方法,在苏云金芽胞杆菌YBT-1520基因组范围内进行体外高通量筛选转录调控因子CodY的靶基因,为深入研究CodY在苏云金芽胞杆菌中的功能及调控网络打下基础。[方法] 用Avi-tag技术对CodY蛋白进行体外生物素标记,酶切苏云金芽胞杆菌YBT-1520总DNA并在两端加上便于测序的adapter序列,用链霉亲和素树脂筛选与CodY蛋白相互作用的靶基因。[结果] 在苏云金芽胞杆菌中得到了46条CodY可以直接作用的靶序列,分析发现CodY在苏云金芽胞杆菌中主要调控氨基酸代谢、糖代谢、脂肪酸代谢、转运、调控、DNA修复、双组份调控等的转录。[结论] 本研究采用的Avi-tag技术具有特异性强、操作简单、成本低等优势,为转录因子体外靶序列的高通量筛选提供新的方法;苏云金芽胞杆菌中CodY靶基因的筛选为其他微生物中CodY的功能研究打下基础。

摘要:[目的] 研究杀粉蝶菌素A1产生菌中甲基转移酶基因pieB2的功能。[方法] 利用接合转移和同源重组双交换的方法,构建pieB2基因缺失突变株,以及利用接合转移的方法,构建回补菌株。通过高保真PCR克隆pieB2基因到表达载体pET28a上,构建质粒pJTU5997,转化入大肠杆菌E. coli BL21(DE3)/pLysE中诱导表达。利用高效液相色谱检测PieB2的体外酶活。[结果] 获得了pieB2基因缺失的双交换突变株。发酵结果显示,该突变株不再产生杀粉蝶菌素A1,而是积累了一种脱甲基产物。N-末端融合组氨酸标签的PieB2在大肠杆菌中获得可溶性表达,通过体外催化证明了PieB2甲基转移酶的功能。[结论] 体内遗传实验和体外生化实验证明了PieB2作为甲基转移酶在杀粉蝶菌素A1合成中的作用。

摘要:[目的] 探究荧光蛋白标签对马疱疹病毒I型(Equine herpes virus type 1, EHV-1) gD囊膜蛋白亚细胞定位的影响。[方法] 以EHV-1基因组为模板利用PCR扩增gD全基因,分别克隆至pAcGFP1-C1和pDsRed2-N1质粒,构建pAc-GFP-gD (GFP-gD)和pDs-gD-Red (gD-Red)重组质粒;将GFP基因插入gD基因信号肽序列之后并克隆至PVAX-1质粒,构建PVAX-S-GFP-gD' (S-GFP-gD')重组质粒;将Flag标签序列与gD囊膜蛋白N端序列融合后并克隆至pVAX-1表达载体,构建pVAX-Flag-gD (Flag-gD)重组质粒。将4种不同重组真核表达质粒分别转染BHK-21细胞,通过激光共聚焦显微镜对不同融合蛋白gD进行亚细胞定位。[结果] 成功构建4种不同的融合蛋白gD真核表达载体;在BHK-21细胞单独表达时,不同融合蛋白gD绝大部分都定位于高尔基体,极少量定位于细胞核内。[结论] 不同插入位点的荧光蛋白标签对gD囊膜蛋白亚细胞定位无明显影响,这对今后研究其它蛋白亚细胞定位提供参考。

摘要:[目的] 探讨植物发酵液提取物(plant fermentation extract,PFE)对铜绿假单胞菌生物膜的抑制作用,为临床上铜绿假单胞菌感染相关疾病的治疗提供参考。[方法] 通过划线法分离临床标本中的铜绿假单胞菌并进行鉴定,通过报告菌株测定铜绿假单胞菌的毒力因子,采用试管法和激光共聚焦扫描显微镜测定生物膜的形成。[结果] 在分离出的16 株铜绿假单胞菌中,PFE对PA007菌株的作用效果最好,1%PFE显著降低PA007菌株生物膜、绿脓菌素和N-(3-oxododecanoyl)-HSL(3-oxo-C12-HSL)的产量(P<0.05)。同时,也显著降低LasA蛋白酶的活性以及持留菌存活率(P<0.05)。荧光定量PCR实验结果表明PFE能显著抑制lasI和pqsA基因的表达(P<0.05)。[结论] PFE具有抗铜绿假单胞菌感染能力,在临床上铜绿假单胞菌感染疾病的治疗中具有巨大的潜在价值。