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摘要:自然界相当多的微生物是未培养的，对这些“微生物界暗物质”进行研究，对于研究微生物的进化过程，充分利用微生物资源具有重要意义。对未培养微生物的分离与培养已成为当前国际研究热点，本文对显微操作、荧光活化分选、微流控分选、光镊技术、激光诱导向前转移等可用于微生物分离与培养的技术原理、发展历程进行简单介绍，对比分析了每种分选技术的优点与不足，重点阐述了激光诱导向前转移技术应用于微生物分离的技术优势，并进一步对未来应用于未培养微生物的研究进行了初步展望。

摘要:自然环境中99%微生物在实验室条件下仍是不能被培养的，称之为“未培养”微生物或微生物“暗物质”。对其进行研究不仅有助于认识环境中微生物代谢多样性，丰富生命之树，同时未培养微生物还蕴含着巨大的新基因和新天然产物资源。但传统培养技术的局限性阻碍了“未培养”微生物资源的开发和利用。虽然随着分子生物学技术的发展，可以直接从环境中获得未培养微生物的遗传信息，分析微生物的广泛代谢多样性，但微生物的生理特征和代谢产物等分析仍然需要建立在研究纯菌株的基础上。目前，已经有很多新颖的培养技术被研发，如原位培养技术、共培养技术和连续流生物反应器培养技术等用于挖掘未培养微生物资源。本文主要介绍了连续流生物反应器培养新技术的发展与改进，探讨了“未培养”微生物培养技术及设备的发展方向，以进一步促进“未培养”微生物资源的开发与利用。

摘要:冰川作为地球主要的冰冻圈环境之一，蕴藏着丰富的低温微生物资源。1976年，Inoue&Komagata从南极分离出一株嗜冷细菌，直到1997年，以这株嗜冷菌为模式物种，建立了冷杆菌属（Cryobacterium），同时该菌株被命名为嗜冷冷杆菌（Cryobacterium psychrophilum）。冷杆菌属物种主要分布于南北极、青藏高原冻土、冰川等低温环境，但与冰川等环境中其他常见类群相比丰度较低，属于稀有类群。目前，该属已有15个有效描述种，其中包含严格的嗜冷菌，但不同种对温度的耐受性有差异，因此是研究低温环境细菌进化和物种形成的良好材料。该属菌株可产生β-类胡萝卜素、低温酶等生物活性物质。本文综述了冷杆菌属的分布、生物学特征；通过对GenBank中冷杆菌属纯培养菌株的全基因组序列进行平均核酸序列一致性（average nucleotide identity，ANI）计算和聚类分析，明确其精确的分类地位，评估了该类群物种多样性；并讨论了冷杆菌在食品加工、医药卫生所需的生物活性物质的应用潜力。

摘要:[目的] 建立适用于海洋微生物的流式细胞分选与高通量单细胞培养的方法，通过该方法从印度洋深海样品中分离微生物纯培养菌株。[方法] 利用流式细胞仪单细胞分选功能，以前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光信号代替荧光信号作为分选逻辑，对深海水体和沉积物样品中微生物进行单细胞高通量分选和培养。[结果] 确定了流式细胞分选的区域和条件，发现所建立方法适于分离海洋水体微生物，而不是沉积物微生物。从印度洋深海水体样品中获得61个潜在新菌株，分属于6个新属种，占分离菌株总数的26.29%，其16S rRNA基因序列与已培养的模式菌株相似性为89.79%-95.37%。[结论] 本研究所建立的方法有助于提高发现海洋微生物新物种的效率，获得更多新的海洋微生物资源。

摘要:[目的] 马里亚纳海沟是地球上最深的海沟，具有超高静水压力、低温、无光等生境特征，蕴含独特的微生物资源。二甲基巯基丙酸内盐（dimethylsulphoniopropionate，DMSP）是海洋环境中最丰富的有机硫分子之一，海洋异养微生物可裂解DMSP产生“冷室气体”二甲基硫（dimethyl sulfide，DMS），在全球硫循环和气候变化中发挥着重要作用。本研究对马里亚纳海沟沉积物异养细菌进行分离鉴定，并研究其DMSP降解能力，为阐明深渊微生物的生命过程提供独特的微生物资源。[方法] 本文以马里亚纳海沟5个站位的沉积物为研究对象，利用3种常规异养菌培养基（2216E、R2A和TCBS）及2种异养菌富集培养基（TCBS肉汤和碱性蛋白胨水）在4℃、16℃和28℃下进行细菌分离培养，通过16S rRNA基因测序鉴定其分类地位，并对代表菌株进行DMSP降解能力检测。[结果] 共分离鉴定异养细菌1057株，分属于4个门、7个纲和76个属。γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）为优势菌群，占据可培养异养细菌总数的61.4%，假单胞菌属（Pseudomonas）和盐单胞菌属（Halomonas）为主要的优势属；变形菌门（Proteobacteria）相对丰度在沉积物各层样品中均占绝对优势。厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度深层高于表层。碱性蛋白胨水和TCBS肉汤培养基分别对放线菌纲（Actinobacteria）和芽孢杆菌纲（Bacilli）具有更好的选择性；101株细菌与其最相似物种的16S rRNA基因相似度小于98.65%，为潜在新分类单元。本文进一步选取134株异养细菌进行DMSP降解能力测定，发现52株（38.8%）具DMSP裂解活性。[结论] 马里亚纳海沟沉积物中可培养细菌及DMSP降解菌株均具有较高的多样性，我们的研究为进一步开展深渊微生物生命过程研究提供了宝贵的微生物资源。

摘要:[目的] 西太平洋复杂的海洋生态环境孕育了其独特的生物群落，蕴含着种类丰富的海洋微生物资源。本研究基于分离培养技术探究了西太平洋海域不同水深细菌的多样性，并尝试通过改良培养基提高海洋细菌可培养性。[方法] 采用改良的2216E固体培养基（IMA）、R2A固体培养基（R2A）、MBM固体培养基（MBM）、TCBS固体培养基（TCBS）和改良的2216E液体富集培养基（IMB）5种不同培养基进行微生物培养，通过菌株分离纯化、16S rRNA基因序列鉴定，分析西太平洋表层至6000 m水深可培养细菌的多样性以及不同培养基在分离培养异养细菌方面的优势。[结果] 本研究共获得1293株异养细菌，分属于4门7纲14目26科52属119种，其中变形菌门（Proteobacteria）为主导类群。纲水平上，γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）和放线菌纲（Actinobacteria_c）为优势菌群。5种培养基所获得的最优势门都为变形菌门，最优势纲都为γ-变形菌纲，除TCBS培养基优势目是弧菌目（Vibrionales），最优势目都为交替单胞菌目（Alteromonadales）。此外，5种培养基在各分类水平上均体现出不同的选择性。5种培养基在种水平上可培养细菌多样性由高到低依次为R2A、IMA、MBM、TCBS以及IMB。分离自R2A的特有属数目最多，可达10个。随水深增加，可培养异养微生物属的数量呈减少趋势。分得菌株中共有68株为潜在新菌，新菌率在IMA、R2A和MBM中相对较高。[结论] 本研究用5种不同培养基从西太平洋海水中获得大量可培养细菌，具有较高的多样性，同时揭示了不同培养基对可培养海洋细菌的选择性。本研究为进一步的生态学研究和分子生物学研究等提供了宝贵的种质资源，也为未来利用改良培养基分离难培养海洋微生物带来启发。

摘要:[目的] 研究深圳大鹏半岛海域石磺海牛中可培养的共附生细菌的数量和种类，并对分离获得菌株的代谢产物进行活性筛选。[方法] 通过R2A平板培养、分离纯化和16S rRNA测序，分析鉴定石磺海牛中5个部位可培养细菌；使用分离菌株的菌液及发酵液上清，测定对群体感应信号分子降解的活性和抗生物膜活性。[结果] 从石磺海牛中共分离到215株细菌，归属于87个种，54个属，有16株菌疑似为新菌。分离获得的菌株分布于变形菌门（Proteobacteria，126株），拟杆菌门（Bacteroidetes，44株），厚壁菌门（Firmicutes，34株），放线菌门（Actinobacteria，10株）和浮霉菌门（Planctomycetes，1株）。石磺海牛卵中的细菌数量和种类最为多样。从分离的菌株中筛选出28株菌能够降解群体感应信号分子，8株菌具有抗生物膜活性。[结论] 首次报道了海洋无脊椎动物石磺海牛中具有丰富多样的可培养细菌，包含潜在的新微生物和天然产物资源，为今后研究石磺海牛共附生微生物提供了研究基础和参考。

摘要:肠道微生物组在组成和功能上都具有极高的复杂性，大量基于免培养的微生物组学研究表明肠道菌群失调与多种疾病都存在密切关联，肠道菌群的稳态与宿主健康密切相关已是共识。同时，越来越多的研究者认识到，可培养微生物菌株资源是肠道微生物组研究从关联分析向功能验证、机理解析和应用开发方向深入发展的基础和保障。本文主要对近年来完成的一些具有代表性的人肠道微生物大规模分离培养和菌株资源库构建工作，进行整理，总结回顾肠道微生物分离培养技术和方法的进展；并通过几个有代表性的基于可培养微生物菌株资源开展的肠道微生物数据挖掘、宿主-微生物互作机理研究和应用开发的成果，展示肠道微生物菌株资源库的应用价值和开发潜力。

摘要:口腔微生物是人体微生物组的重要组成部分，其群落组成丰富且独特。现有研究显示，口腔微生物与龋病、牙周炎等口腔健康问题有直接的联系，因而具有重要的研究价值。随着高通量测序技术的发展，人们对口腔中未培养微生物多样性的认识不断加深，这进一步催生对微生物分离培养技术需求的增加。为此，本文将围绕口腔未培养微生物及其分离培养策略的研究进展，首先介绍口腔中未培养微生物的研究现状；其次分析口腔微生物分离培养中可能的限制因素；最后综述微生物分离培养技术发展及其在口腔未培养微生物研究中的应用。全文旨在为口腔未培养微生物的分离培养提供思路和技术参考。

摘要:[目的] 以固氮菌为例，厘清“99%难培养”的概念，定量评价土壤中可培养固氮菌的比例。[方法] 直接提取土壤中所有微生物DNA，同时，利用传统微生物富集技术获得固体和液体培养基第一代和第二代菌体及其DNA，高通量测序nifH和16S rRNA基因，通过系统发育分类方法，明确固氮菌富集物的物种组成及可培养比例。[结果] 文献分析表明，“99%难培养”并未有严格的定量实验证据，是“平板计数异常”的同义词，即采用显微计数法的微生物数量远高于平板计数法。针对典型旱作潮土中的固氮菌，微生物属水平的nifH基因分析发现，可培养固氮菌占比为（22.4±4.5）%-（28.4±6.3）%，而16S rRNA的结果为（31.6±3.4）%-（41.4±13）%。nifH基因分析发现土壤中固氮菌共67属，其中39属可在固体和液体培养形成菌落，但仅有4属得到显著富集，固体培养基富集了Proteobacteria门Azotobacter属，相对丰度高达（98.2±0.94）%；而液体培养基极显著富集了Firmicutes门的Paenibacillus和Clostridium属，相对丰度高达（76.7±3.9）%和（21.7±4.0）%。16S rRNA基因分析发现，土壤中所有固氮菌共计14门、255属，其中248属可在固体和液体培养基形成菌落被培养，但高达6门、226属尚未获得纯菌株或固氮生理报道，并且固体培养基仅显著富集了Proteobacteria门6个属；液体培养基则富集了Firmicutes门5个属。[结论] “99%难培养”是“平板计数异常”的同义词。nifH基因发现土壤中58.2%固氮菌属可培养；而16S rRNA基因则发现高达97.3%固氮菌属可在培养基上形成菌落，但其中91.1%的固氮菌尚未获得纯菌株或固氮生理报道。同时，绝大部分固氮菌为数量占弱势的稀有属，69.5%的nifH基因属丰度<0.1%；而78.5%的16S rRNA基因属丰度<0.1%，导致传统富集培养传代过程中，定向富集了常见的Proteobacteria和Firmicutes门的固氮菌，遗漏了绝大部分已形成菌落但尚未被分离纯化的固氮菌属。“不可培养”微生物的表述并不合理，未来亟需创新培养策略，定向分离传统培养基上被遗漏的微生物，获得更多“难培养”或“尚未培养”微生物。

摘要:[目的] 基于模拟原位环境策略、可培养粘细菌的营养策略及细菌互作网络，改良分离培养基，以提高分离粘细菌的多样性。[方法] 通过添加土壤浸提液、使用不同种类的诱导菌和改变诱导菌的接种方式设置分离方法，同时以传统的分离方法作对照。[结果] 改良的分离方法比对照组诱导出了更多粘细菌子实体种类，采自4个地区的9份样品共分离纯化出40株粘细菌，按形态学和分子生物学，将其归类于原囊菌属（Archangium）、珊瑚菌属（Corallococcus）、软骨霉状菌属（Chondromyces）、粘球菌属（Myxococcus）、侏囊菌属（Nannocystis）、多囊菌属（Polyangium）、匣状球菌属（Pyxidicoccus）。[结论] 与传统分离方法相比，添加土壤浸提液，诱导菌点接法能大大提高诱导出的粘细菌子实体种类的数目，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌作为诱导菌对子实体种类影响较小，但是也发现革兰氏阳性菌特异性诱导出的子实体。虽然本研究通过对分离培养基的改良大大增加了子实体种类，但是纯化出的粘细菌种类远少于观察到的子实体种类，说明除改良分离方法外，还需进一步研究粘细菌的纯化方法，提高分离所得粘细菌的多样性，获取更多粘细菌新资源。

摘要:[目的] 揭示脱落酸（ABA）对丛枝菌根（AM）真菌侵染和产孢的影响，建立利用外源ABA促进孢子产量的高效菌剂扩繁方法。[方法] 利用番茄毛状根和AM真菌Rhizophagus irregularis DAOM 197198建立双重培养体系，通过外源施用ABA、赤霉素（GA）或者使用ABA、GA的缺陷突变体，染色观察菌根侵染，荧光定量PCR测定丛枝发育和脂质合成运输相关基因的表达，统计丛枝和孢子的数量，从而揭示ABA对AM真菌侵染和产孢的影响。[结果] ABA缺陷突变体not中的F%（侵染频率）、a%（丛枝丰度）、丛枝数量，以及丛枝发育特异性相关基因EXO70A1-like（LOC101253481）、脂质合成运输相关基因RAM2和STR2的表达均显著低于其野生型MT；外源施用ABA显著促进了F%、M%（侵染强度）、丛枝数量、孢子产量，以及脂质合成运输相关基因RAM2和STR2的表达，外源添加ABA处理的孢子产量约为不添加处理的4.5倍；外源GA处理极显著抑制了菌根侵染的所有指标和孢子产量；GA缺陷突变体gib3与其野生型MM的AM真菌侵染之间没有显著差异，但gib3的孢子产量显著高于MM。[结论] ABA通过促进脂质的合成和运输，提高AM真菌的侵染和丛枝形成，进而增加AM真菌的孢子产量。

摘要:厌氧菌是地球上数量最多、物种最丰富的微生物，也是分类上报道最少的微生物。它们对氧气敏感、生长条件苛刻，不容易培养分离。本文简要总结了厌氧微生物的研究历史，分析了限制厌氧微生物培养分离的主要因素，讨论了厌氧微生物培养分离的策略和方法，回顾了国内外厌氧微生物的系统分类学现状，并展望了厌氧微生物培养分离的发展趋势。

摘要:厌氧氨氧化是指微生物在无氧条件下，以NO₂^-为电子受体，将NH₄⁺氧化成N₂的过程，该过程主要由浮霉菌门下的厌氧氨氧化细菌参与。厌氧氨氧化细菌广泛存在于海洋生态系统、淡水生态系统、陆地生态系统及其他一些特殊生境中，其在废水生物脱氮和地球氮循环中扮演着重要角色。本文从厌氧氨氧化细菌的发现历程、种类、特性、代谢途径、分布、检测方法及应用上进行了较为全面的总结；最后对厌氧氨氧化细菌研究前沿问题和未来发展方向进行了探讨与展望。

摘要:[目的] 红树林沉积物中有机物丰富，通过研究认识参与难降解天然有机多聚物的微生物降解过程及其环境作用，并获得新颖的难培养厌氧微生物。[方法] 对漳州九龙江河口红树林沉积物中降解纤维素、几丁质和木质素的厌氧细菌定向富集和平板分离纯化，并对其多样性进行分析。[结果] 共筛选分离获得202株厌氧细菌（82株专性厌氧细菌，120株兼性厌氧细菌），包括4个疑似新属（Lachnotalea sp.MCCC 1A16036、Varunaivibrio sp.MCCC 1A15903、Clostridium sp.MCCC 1A15884、Caminicella sp.MCCC 1A17445）和4个疑似新种（Sunxiuqinia sp.MCCC 1A15904、Pseudodesulfovibrio sp.MCCC 1A16040、Pseudodesulfovibrio sp.MCCC 1A16038、Mangrovibacterium lignilyticum MCCC 1A15882）。不同天然有机多聚物富集菌群分离到的优势可培养细菌主要属于变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门，但种群略有差异。在纤维素和几丁质富集菌群中，变形菌门和拟杆菌门菌株是纤维素和几丁质富集菌群的优势菌群，拟杆菌门的Prolixibacter bellariivorans、Mangrovibacterium lignilyticum和变形菌门的Desulfovibrio salexigenes、Vibrio alginolyticus分别在纤维素和几丁质富集菌群可培养细菌中占绝对优势。但降解实验表明，放线菌门细菌Demequina salsinemoris MCCC 1A15890和Brevibacterium celere MCCC 1A17451对纤维素降解活性最高。梭杆菌门细菌Propionigenium maris MCCC 1A15874和Ilyobacter polytropus MCCC 1A15889对几丁质降解活性最高。在木质素富集菌群中，拟杆菌门的Mangrovibacterium lignilyticum和厚壁菌门的Clostridium amygdalinum都具有较高的相对丰度。变形菌门细菌Desulfomicrobium apsheronum MCCC 1A15932和拟杆菌门细菌Mangrovibacterium lignilyticum MCCC 1A15882对木质素降解效果显著。[结论] 红树林沉积物中存在丰富多样且新颖的厌氧难培养细菌，且多数具有纤维素、几丁质或木质素厌氧降解能力。该研究结果为探究红树林沉积物原位环境天然有机多聚物碳的生物地球化学循环机制提供了相关理论基础和纯培养微生物资源。

摘要:[目的] 分离并鉴定能够降解除草剂丁草胺的厌氧微生物菌株，研究其厌氧降解丁草胺的特性和代谢途径，为深入研究丁草胺厌氧降解机制提供依据。[方法] 以丁草胺为碳源作为选择压力从水稻田土壤中富集驯化丁草胺降解菌，利用16S rRNA基因系统发育分析结合菌株培养特征对降解菌株进行初步鉴定，利用液相色谱-时间飞行质谱（LC-TOF-MS）检测菌株降解丁草胺的代谢产物。[结果] 筛选到一株降解丁草胺的厌氧细菌，命名为BAD-20，初步鉴定为嗜蛋白质菌属（Proteiniphilum），菌株BAD-20降解丁草胺的最适条件为温度30-35℃、pH 7.5-8.0和0-0.5% NaCl，在有氧条件下该菌不能降解丁草胺。最适条件下，菌株BAD-20在10 d降解90%的20 mg/L丁草胺。菌株BAD-20还能降解甲草胺、乙草胺、丙草胺，降解效率从高到低依次为甲草胺 >乙草胺 > 丙草胺 > 丁草胺，对这些氯乙酰胺除草剂的降解动力学符合一级动力学方程。鉴定到2个丁草胺降解代谢产物，分别是N-（2，6-二乙基苯基）-N-（丁氧甲基）乙酰胺（DEPBMA）和N-（2，6-二乙基苯基）乙酰胺（DEPA），表明菌株BAD-20降解丁草胺的起始步骤为脱氯，随后脱去N-丁氧甲基。[结论] 本研究富集分离到一株降解丁草胺的厌氧细菌嗜蛋白质菌属（Proteiniphilum） BAD-20，为深入研究丁草胺厌氧降解机制及研发含丁草胺废水厌氧生物处理技术提供依据。

摘要:[目的] 分离鉴定新型有机卤呼吸细菌，拓展有机氯污染物降解菌种资源。[方法] 在限制性培养基中，基于特定脱卤微生物的能量代谢特点以及对抗生素的抗性特征，应用绝迹稀释法从脱氯富集培养物中分离纯化新型有机卤呼吸细菌。通过添加酵母提取物和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性等方法鉴定菌株纯度。通过考察细胞形态、16S rRNA系统发育树以及对有机氯化物的利用能力来描述此新型菌株的基本特征。[结果] 菌株GP是一株来自脱卤单胞菌属（Dehalogenimonas）的新型有机卤呼吸细菌，可耐受1.0 g/L的氨苄青霉素和0.1 g/L的万古霉素，其细胞平面形态为直径0.4-0.8 μm的不规则圆形。在乙酸作碳源、氢气作电子供体的条件下，菌株GP可利用1，1-二氯乙烯和一氯乙烯作为电子受体进行有机卤呼吸，脱氯终产物为无毒害的乙烯。16S rRNA系统发育分析表明，菌株GP与Dehalogenimonas formicexedens菌株NSZ-14有高达99.5%的同源性，但两菌株对有机氯化物底物的利用范围不同。[结论] 从脱氯富集培养物中分离纯化出一株新型有机卤呼吸细菌，为深入研究脱卤单胞菌这一重要脱卤微生物的遗传学信息和生理生化性质提供了新材料。