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摘要:规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein,CRISPR/Cas)自发现以来,其应用范围在不断拓宽。除在基因编辑方面出色的应用能力外,近年来Cas12、Cas13等蛋白反式切割活性的发现,使其在病原微生物快速检测方面也显现出巨大的应用潜力。基于CRISPR/Cas系统建立的病原微生物检测技术具有灵敏度高、特异性强、操作简单等特点,通过设计不同靶向的引导RNA能够对不同的目标进行快速检测,是一种极具应用潜力的检测技术。本文对基于CRISPR/Cas开发的部分代表性病原微生物检测技术类型进行总结。由于引导RNA在CRISPR/Cas系统中具有重要作用,但目前鲜见相关总结文章,本文对部分Cas蛋白引导RNA特点以及特异性靶标的获取也进行了重点阐述,以期为开发基于CRISPR/Cas系统新型病原微生物检测技术提供参考和依据。

摘要:羊毛硫肽(lanthipeptide)是一类由核糖体合成并经翻译后修饰的含羊毛硫氨酸或β-甲基羊毛硫氨酸的多肽。近年来,放线菌来源的羊毛硫肽因其突出的抗菌活性和罕见的生物活性而备受关注。本文重点对放线菌来源的不同类型的羊毛硫肽的结构特征及其特性进行了综述,讨论了生物或化学方法修饰天然羊毛硫肽和基因组挖掘发现结构新颖的羊毛硫肽在开发符合实际应用需求的放线菌来源的羊毛硫肽中的应用,并对放线菌来源的羊毛硫肽的应用潜力进行了总结和展望。

摘要:高盐废水因具有硬度高、可生化性差、水质成分复杂等特点,是较难处理的工业废水之一。现有物化处理技术存在运行成本高、处理效率低、二次污染重等诸多瓶颈。耐盐/嗜盐微生物可在高盐环境下进行正常生理代谢,因此,开发经济、高效、可靠的高盐废水生物处理技术有望成为高盐废水处理的主流方向之一。本文系统综述了耐盐/嗜盐微生物盐溶、胞内小分子相容溶质积累、蛋白质稳定和细胞表面稳定等高渗透压适应策略。由于嗜盐微生物存在生长条件苛刻、功能微生物种类稀缺等问题,因此,耐盐微生物在高盐废水处理的未来应用空间更大。最新研究发现强化调控技术(电、光、磁)可提升微生物的高渗透压适应能力,其中电调控技术或是未来高盐废水生物处理的重点研究方向。

摘要:植物根系代谢物是植物-微生物互作的桥梁纽带,作为信号物质和微生物营养源调控着微生物的群落结构和多样性,而根区微生物区系的改变则反作用于植物的生长、发育和抗性。本文聚焦植物根系代谢物介导的植物-微生物互作,梳理了植物-微生物互作研究中次级代谢物的种类、作用及其检测手段;探讨了植物通过调节自身代谢物以适应品种进化及繁衍后代过程中发挥的功能作用;阐述了逆境胁迫下植物利用根系代谢物招募特异微生物(解磷、溶磷)或者有益微生物促进自身生长以缓解胁迫压力的机制;分析了根系代谢物作为信号物质诱导植物抗病的方式"求救假说",为可持续农业发展提供思路和理论依据。

摘要:植物病原细菌通过复杂和精细的全局性调控网络来协调多个层面的毒性决定因子。在不同的植物病原细菌中,这些全局性的毒性调控网络控制着细菌的侵染策略、存活以及在面临寄主植物防卫系统的互作环境中实现成功侵染的病程。本文详细分析了植物病原细菌4个重要属(假单胞菌属、果胶杆菌属、黄单胞菌属和雷尔氏菌属)的模式病原菌主要的毒性调控系统,包括群体感应系统、双组分调控系统、转录激活调控子以及转录后、翻译后的调控机制。在此基础上,重点评价了一些模式菌株全局性毒性调控机制的异同点,总结了一些最新的研究进展,并绘制了精细的网络调控图。这些分析表明,虽然一些相同的调控系统控制着病原菌的毒性,但是在不同种以及种下的亚种或者致病变种中这些调控机制功能各异,对于病原菌全毒性的贡献也存在着明显的差异。

摘要:病毒性疾病对人类和动物健康造成了重大威胁。由于现有的免疫接种和抗病毒疗法的局限性,开发安全、广谱、廉价的新型抗病毒制剂极为迫切。益生菌是摄入后能对机体产生多种有益作用的活性微生物,其抗病毒作用及潜在机制是当前的研究热点。本文介绍了益生菌通过促进肠道细胞的紧密连接和产生有利物质来维护机体黏膜屏障;与病毒竞争结合靶点或直接捕获并抑杀病毒;刺激机体免疫系统,调节固有免疫反应和适应性免疫反应;分泌具有抗病毒作用的代谢产物来发挥抗病毒作用及其作用机制,以期为益生菌的抗病毒相关研究提供参考。

摘要:[目的]本研究旨在构建单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)硫氧还蛋白Lmo1609的基因缺失株,分析Lmo1609的氧化还原酶学活性,及其在细菌生长、运动过程中发挥的作用,并探究了Lmo1609参与细菌抗氧化应激和致病的生物学基础。为阐明其抗应激生物学作用以及完善李斯特菌的感染机制奠定分子基础。[方法]利用同源重组原理构建lmo1609基因缺失株及回补株。通过分子生物学、应激生物学和感染生物学等手段,对Lmo1609的生物学功能进行探索。以胰岛素为底物分析其氧化还原酶学活性;通过构建lmo1609缺失株和回补株,比较野生株和突变株在运动性、生长能力、抗氧化应激、细胞黏附、侵袭和增殖能力等方面的差异,进而鉴定Lmo1609的生物学功能。[结果]缺失lmo1609后,单增李斯特菌在生长能力上无明显变化,而运动能力明显减弱;对H₂O₂的敏感性增强;对细胞的黏附侵袭能力没有差异;对小鼠的致病力没有显著影响。[结论]本研究首次证实了单增李斯特菌硫氧还蛋白Lmo1609具有还原酶学活性,参与调控细菌的运动和对H₂O₂的氧化应激耐受,不介导单增李斯特菌的致病性。

摘要:[目的]筛选窖泥中尚未被纯培养的高丰度拟杆菌纲微生物,并在纯培养菌株层面和共培养层面探究其生理代谢特征及生态学功能。[方法]采用传代培养提高窖泥拟杆菌纲微生物的相对丰度,在此基础上进行筛菌实验,并通过发酵实验解析主体拟杆菌的代谢特征及其与主体己酸菌的相互作用关系。[结果]成功筛选到Petrimonas sulfuriphila LBM11005,该菌的主要代谢产物为乙酸和丙酸,且葡萄糖能促进该菌的生长。无论是否存在底物竞争效应,P. sulfuriphila LBM11005均能与窖泥主体己酸菌Caproicibacterium sp. LBM19010在代谢物水平上发生相互作用,表现为后者可以利用前者的代谢产物丙酸进行碳链延伸,产生新的奇数碳脂肪酸——戊酸和庚酸。[结论]探明了窖泥主体拟杆菌纲微生物P. sulfuriphila LBM11005的基本生理代谢特征,且该菌与主体己酸菌相互作用,贡献于更长碳链奇数碳脂肪酸的合成。

摘要:伪结核棒状杆菌是一种可以感染多种动物和人的兼性胞内寄生病原,主要引起被感染动物慢性化脓性炎症反应。[目的]为进一步评价磷脂酶D基因(pld)在伪结核棒状杆菌感染致病中的作用。[方法]本研究采用同源重组技术,在不引入外源基因情况下,构建伪结核棒状杆菌pld无痕缺失株。通过比较pld缺失株和野生株的菌落形态及生长曲线、体外对巨噬细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放及其在胞内的繁殖情况以及体内感染小鼠致死率及促炎细胞因子分泌水平,研究pld与该病原感染致病之间的关系。[结果]无痕缺失pld对伪结核棒状杆菌的菌落形态及生长无明显影响。与野生株ATCC 19410和XH02相比,ATCC 19410Δpld和XH02Δpld失去了与马红球菌ATCC 6939的协同溶血功能,所感染巨噬细胞的LDH释放水平显著下降,胞内细菌数量显著降低;体内试验发现ATCC 19410Δpld对小鼠的致死率、肝脏和脾脏载菌量以及腹水及脏器促炎细胞因子水平均低于ATCC 19410。[结论]成功构建了伪结核棒状杆菌pld无痕缺失株。证实pld在该病原体外感染引发巨噬细胞死亡以及体内感染小鼠致病中具有重要作用。

摘要:[目的]解析斑节对虾(Penaeus monodon)(非洲群体) (俗称"金刚虾",以下同)携带耐药菌及耐药基因现状。[方法]本研究从山东滨州北海新区采集了金刚虾,对其肠道细菌常用抗生素的耐药菌性质及数量、占比及种类进行检测,通过荧光定量PCR技术分析肠道内容物样品中的4类抗生素的4种耐药性基因分布特征。[结果]肠道中可培养细菌总数约1.45×10⁵- 2.13×10⁶CFU/g,有四环素、萘啶酸、氟苯尼考、庆大霉素4种抗生素耐药菌的检出,其中喹诺酮类萘啶酸耐药菌占比最高,达到35.00%,氨基糖苷类庆大霉素占比最少。10种抗生素药敏性质分析表明,肠道可培养细菌对庆大霉素、氟苯尼考等6种抗生素高度敏感,对四环素、卡那霉素中度敏感,对萘啶酸、青霉素、阿莫西林耐药。从分离的耐药菌鉴定结果可以得出,可培养的抗生素耐药菌主要集中在弧菌属,基于属水平的不同抗生素耐药菌统计显示,不同抗生素耐药菌种类存在明显差异,且同一菌属有耐多种抗生素的情况。荧光定量PCR检测分析,4种耐药基因的丰度不同,tetA基因相对拷贝数和四环素耐药菌比例、floR基因和氟苯尼考耐药菌比例之间存在显著相关性(P<0.01);qnrA基因相对拷贝数和萘啶酮酸耐药菌比例、aadA基因相对拷贝数和庆大霉素耐药菌比例之间均不存在显著相关性(P>0.01)。[结论]本研究说明,金刚虾肠道微生物中存在一定的耐药菌和耐药基因,具有携带风险。

摘要:[目的]探究OmpR在副溶血弧菌生物学特性和致病性中发挥的作用。[方法]利用同源重组技术构建了副溶血弧菌ompR基因缺失株(ΔompR)和互补株(CΔompR),分析各菌株的生长特性、运动性和生物被膜形成能力的差异;比较各菌株对细胞黏附、细胞毒性和小鼠致病性的影响。[结果]ompR基因缺失对副溶血弧菌的生长特性、运动性以及细胞毒性无显著影响。但与野生株相比,ΔompR的生物被膜的形成能力显著降低;感染ΔompR的小鼠存活率升高了25%,病变程度更低;ΔompR在小鼠心脏、肝脏和肾脏中的载菌量显著低于野生株,互补株毒力基本恢复至野生株水平。[结论]OmpR参与副溶血弧菌生物被膜形成和致病过程,是副溶血弧菌潜在的毒力因子。

摘要:[目的]对实验室分离到的菌株ZH-356进行鉴定并评价其对植物病原真菌的生物防治效果,为研发针对植物真菌病害的生防菌剂提供理论指导。[方法]通过平板对峙法确定菌株ZH-356抗菌谱,并通过16S rRNA基因序列分析确定其种属,利用离体枝条的苹果树腐烂病菌感染预防试验和患腐烂病苹果树的防治试验评价其生防效果。[结果]菌株ZH-356鉴定为链霉菌属,与直丝紫链霉菌(Streptomyces rectiviolaceus)相似性最高,为99.71%。抗菌谱试验表明,菌株ZH-356对苹果树腐烂病菌、小麦赤霉病菌、小麦根腐病菌和番茄早疫病菌等多种植物病原真菌均具有较强的抑制作用,这种抑制作用可导致苹果树腐烂病菌菌丝变粗、交叉扭曲、分支变少且容易断裂。此外,ZH-356产生的抑菌活性物质对温度和酸碱度具有高度稳定性,并且该活性物质只存在于其胞内,只有当ZH-356遇到植物病原真菌时才会被分泌出来以抑制它们的生长。在离体枝条的苹果树腐烂病菌感染预防试验中,ZH-356对苹果树腐烂病防效可达94%以上,而在患腐烂病苹果树的防治试验中,ZH-356菌制剂对苹果树腐烂病的防效高达100%。[结论]链霉菌ZH-356抑菌谱广,对多种植物病原真菌均具有良好的拮抗活性,可作为防治植物真菌病害的生防菌株,为基于ZH-356菌株的生防菌剂的开发和防治苹果树腐烂病等植物真菌病害奠定了基础。

摘要:[目的]土壤中的多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)可被蔬菜根系吸收并在可食部分积累进而通过食物链威胁人群健康。接种功能内生细菌能有效减低蔬菜中PAHs的积累,而关于其对蔬菜亚细胞组分中PAHs积累的影响却鲜有报道。[方法]采用体外实验,研究了接种具有菲降解功能的菌株Diaphorobacter sp. Phe15对空心菜茎叶亚细胞组分中菲积累的影响及PAHs代谢相关酶活性的响应。[结果]接种Phe15可以可加速空心菜茎叶亚细胞中菲的降解,显著削减空心菜亚细胞组分中菲的含量,接菌后空心菜亚细胞组分中菲降解率达90%以上。此外,接种功能菌Phe15可以影响空心菜亚细胞组分中PAHs代谢相关酶系的活性,空心菜亚细胞水平POD、PPO、C230活性整体得到提高,且酶系活性与空心菜体内菲积累呈负相关关系。[结论]接种具有菲降解功能的菌株Phe15增加了空心菜亚细胞水平PAHs代谢相关酶系活性,进而降低空心菜体内菲的积累,研究结果为利用功能内生细菌削减蔬菜中多环芳烃污染提供了一定的参考和理论依据。

摘要:[目的]利用融合自组装双亲短肽策略对源自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的过氧化氢酶KatA进行改性,以强化重组过氧化氢酶在工业中的应用适应性。[方法]将自组装双亲短肽S1vw通过连接肽PT-linker融合在KatA的N端,构建重组质粒pHT254-S1vw-PT-katA,将其与携带天然酶基因的pHT254-katA分别转入枯草芽孢杆菌WB800N中进行分泌表达,之后将分离纯化得到的纯酶进行酶学性质研究。[结果]成功构建出工程菌并将胞外粗酶液通过乙醇沉淀、DEAE阴离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤层析4步纯化,最终获得电泳纯的重组酶蛋白。酶学性质研究结果显示,融合酶S1vw-PT-KatA和天然酶KatA的最适反应温度均为30℃,最适反应pH值均为11.0。然而,融合酶在pH 12.0下孵育30 min的相对酶活为77.3%,是相同处理条件下天然酶相对酶活的14.9倍,在65℃和70℃下孵育30 min的相对酶活分别为19.8%和17.5%,是相同处理条件下天然酶相对酶活的1.8倍和1.7倍。此外,融合酶在4℃储存14 d后相对酶活为88.6%,而天然酶仅具有44.3%的相对酶活。同时,融合酶的k_cat/K_m提高到天然酶的2.3倍。[结论]融合自组装双亲短肽S1vw提高了重组过氧化氢酶KatA的pH稳定性、温度稳定性、储存稳定性和催化效率,不仅获得了催化效率和应用适应性改良的重组酶蛋白,为针对过氧化氢酶的进一步分子改造提供了策略参考和实验依据,而且促进了其在工业上的规模化制备和应用。

摘要:[目的]研究连作条件下番茄青枯病不同发病时期的非根际土壤微生物群落差异,明确土壤微生物对青枯病发病时期的响应机制。[方法]本研究对16S rRNA V4‒V5区进行实时荧光定量PCR和高通量测序,综合分析了连续种植第1、3、5和7季的发病高峰期和发病末期的番茄非根际土壤的病原菌数量、细菌群落多样性、群落组成、标志细菌类群和群落构建机制。[结果]发病高峰期的青枯菌数量(1.28×10⁷ copies/g)要高于发病末期(1.77×10⁶ copies/g)。随着连作时间的增加,发病时期对细菌群落多样性的影响逐渐增加。第3季和第5季不同发病时期之间的细菌群落alpha和beta多样性存在显著差异。LEfSe分析发现,番茄青枯病发病高峰期和发病末期的非根际土壤样品有其各自不同的标志细菌类群。此外,随连作时间的延长协助青枯菌致病的细菌逐渐累积。发病高峰期是微杆菌属(Microbacterium)和亚硝化螺菌属(Nitrosospira)协助青枯菌致病,而在发病末期,则由鞘脂菌属(Sphingobium)、norank f norank o SBR1031和norank f Rhodothermaceae协助青枯菌致病。群落构建过程分析发现不同发病时期细菌群落均以随机过程的扩散限制为主,但细菌群落在发病高峰期比发病末期的同质化作用更强。[结论]本研究发现青枯病发病高峰期和发病末期的番茄非根际土壤的细菌群落多样性、组成和结构在第3季和第5季时存在显著差异。此外,细菌群落会随着连作时间发生动态变化,而这些变化可能与细菌群落构建机制相关联。研究结果加深了对连作条件下的番茄青枯病发展过程的认识,可为防治青枯病提供参考依据。

摘要:[目的]家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)是生产上危害最严重的病原之一。BmNPV感染BmN-SWU1细胞将细胞周期阻滞于G2/M期。CyclinB是调控细胞周期G2期向M期转换的重要细胞周期蛋白。因此,研究BmNPV感染后CyclinB变化对解析病毒调控细胞周期的机制具有重要意义,同时探究这个过程中与CyclinB互作的病毒蛋白,可为构建家蚕转基因品系提供分子靶标。[方法]qRT-PCR检测BmNPV感染后BmCyclinB的表达变化;免疫荧光观察病毒感染前后BmCyclinB的定位变化,通过细胞质细胞核蛋白分离实验验证。免疫共沉淀钓取与BmCyclinB互作的病毒蛋白。BmNPV感染期间敲除BmNPV IAP1观察BmCyclinB的入核比例。[结果]BmNPV感染后BmCyclinB转录水平下调。BmNPV感染前BmCyclinB主要定位于细胞质,而感染后主要定位于细胞核。BmNPV感染BmN-SWU1细胞后促进BmCyclinB在核内积累。共钓取了7个与BmCyclinB互作的病毒蛋白,免疫共沉淀和细胞共定位证明BmNPV IAP1与BmCyclinB之间存在相互作用。敲除BmNPV IAP1后BmCyclinB进入细胞核的数量显著减少。[结论]BmNPV IAP1可通过与BmCyclinB互作,促进BmCyclinB在核内积累。

摘要:[目的]本研究拟通过可培养获得驼源细菌,分析菌种分布规律,获得产酸、产酶特性的菌株资源,为驼源益生细菌的开发和利用提供资源和技术支撑。[方法]采用稀释法筛选新疆吉木乃地区冬季养殖双峰泌乳骆驼驼乳、唾液及直肠粪便中的细菌,通过16S rRNA基因序列分析对菌株进行鉴定;透明圈法对产酸和产酶的菌株进行初筛,并对菌株产有机酸能力及产淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶活力进行复筛。[结果]共培养出63株细菌菌株,经分子鉴定得知,从驼粪中分离的35株菌以嗜冷杆菌属和不动杆菌属为主;驼乳中分离出的21株菌以假单胞菌属和明串珠菌属为优势菌属;唾液中分离纯化出7株,主要为芽孢杆菌属;平板初筛得到产酸菌共有11株,1株粪源肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) 2F11M乳酸产量最高,达到3.93 mg/mL;1株奶源乳酸明串珠菌(Leuconostoc lactis) 2N5M乙酸产量最高,达到12.73 mg/mL;1株粪源蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii) 2F17M丙酸产量最高,达到10.36 mg/mL;根据初筛产透明圈,产酶菌株主要分离自驼粪和驼奶,其中产淀粉酶的菌株17株,产纤维素酶的菌株10株,产蛋白酶的菌株15株;1株奶源的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) Nai1的淀粉酶活性最高,为509.07 μg/(min·mL),1株粪源鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii) 2F5N的纤维素酶活性最高,为156.87 μg/(min·mL),1株奶源枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 2N2N产蛋白酶活性最高,为3.59 μmol/(min·mL)。[结论]从新疆泌乳双峰骆驼中筛选出了多种产酸、产酶菌株,且活力都较好,具有制备微生态制剂的潜力。

摘要:[目的]分离喜马拉雅旱獭肠内容物样本中的噬菌体,并研究其生物学特性和基因组特征。[方法]以大肠杆菌为宿主菌,利用双层琼脂平板法从喜马拉雅旱獭肠内容物样本中分离噬菌体;用透射电镜观察形态特征;测定其最佳感染复数、一步生长曲线、酸碱耐受度及宿主裂解谱等生物学特性,并进行全基因组测序。[结果]从喜马拉雅旱獭肠内容物样本中分离得到一株裂解性大肠杆菌噬菌体,命名为vB_EcoM_TH18,其噬菌斑呈无晕环的透亮圆形,透射电镜观察发现该噬菌体头部直径为(90±5) nm,尾部长度为(115±5) nm;最佳感染复数为1;一步生长曲线显示其潜伏期为10 min,110 min后进入平台期,平均裂解量为15 PFU/mL;在pH 4.5-9.5的范围内具有稳定活性;可裂解多种致病型和血清型大肠杆菌和宋内志贺氏菌,无法裂解沙门氏菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌及鲍曼不动杆菌;基因组测序结果表明,其基因组长度为133 882 bp,GC含量为39.95%。基因组共注释到210个编码序列(CDS)和13个tRNAs,不含毒力基因及耐药基因。BLASTn比对结果表明该基因组与Avunavirus属噬菌体Av-05同源性为95.17%。基于噬菌体全基因组、主要衣壳蛋白和终止酶大亚基分别构建系统进化树,结果表明vB_EcoM_TH18是一株肌尾噬菌体科(Myoviridae) Avunavirus属的新型噬菌体。[结论]从喜马拉雅旱獭肠内容物中成功分离并鉴定了一株新型宽谱大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_TH18,可裂解多种致病型和血清型的大肠杆菌及宋内志贺菌。

摘要:[目的]为了解决高温的煤化工废水生物脱氮效率不高的技术难题。[方法]本研究从上海某能化集团有限公司的煤化工废水处理系统的活性污泥中筛选得到一株耐热氨氧化细菌A1和一株耐热反硝化细菌D1。[结果]通过形态学观察、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析,菌株A1初步鉴定为Aquamicrobium ahrensii,菌株D1初步鉴定为Pseudomonas stutzeri。采用单因子优化实验研究发现,菌株A1和D1的最适生长温度分别高达42℃和40℃。在模拟实际废水处理的初始NH₄⁺-N浓度100 mg/L和42℃的条件下,构建了由菌株A1和D1 (W/W,20%/10%)组成的共培养物,探究该共培养物在不同pH和C/N对短程硝化反硝化脱氮及N₂O的释放效应。结果表明,该共培养物在42℃、pH 9.0–10.0和初始C/N为2:1时,处理模拟废水的氮素去除率达>99.0%,最大N₂O得率高达51.3%。[结论]本研究的结果可为高温煤化工废水的生物处理提供技术支撑及菌种储备,同时也为高温污水处理过程中N₂O的释放规律提供理论参考。

摘要:[目的]细菌机械敏感性离子通道MscS能够在细菌周围环境渗透压急剧降低时,打开并释放胞内内容物,平衡内外渗透压差,使细菌存活。鉴于其广泛分布在各种细菌中,而在哺乳动物中未发现其同源体,MscS被认为是一种新型抗生素靶点。MscS一个独特的开放特征是具有失活特性,即在持续的机械刺激条件下,MscS从开放状态进入一种非离子通透的失活状态,从而避免因通道持续开放引起大量内容物流失导致细菌死亡。该研究的目的是鉴定影响MscS失活的关键氨基酸,为靶向MscS的药物设计提供思路。[方法]采用分子克隆方法制备MscS Cyto-helix(P166−I170)半胱氨酸突变体,利用巯基化合物MTSET⁺结合半胱氨酸从而对其侧链基团进行修饰,并通过低渗刺激实验,检测表达MscS半胱氨酸突变体的大肠杆菌分别在无或有MTSET⁺处理下,低渗刺激诱发通道开放后的存活率筛选显著影响通道功能的突变体。利用电生理膜片钳方法检测突变体在MTSET⁺处理前后通道失活特性的变化,结合定点突变手段进一步探讨失活机制。[结果]MTSET⁺处理导致表达半胱氨酸突变体G168C-MscS的大肠杆菌在低渗刺激后存活率极大降低;G168C- MscS在结合MTSET⁺后失去失活特性,保持持续开放,是导致细菌胞内内容物大量流失并死亡的重要原因;酪氨酸突变G168Y-MscS、亮氨酸突变G168L-MscS和赖氨酸突变G168K-MscS的失活特性与野生型WT-MscS一致,而天冬氨酸突变G168D、缬氨酸突变G168V和异亮氨酸突变G168I的失活速率显著降低,尤其是G168I-MscS失去失活特性,表明MscS 168位点是影响通道失活的关键位点,并且通道失活特性与该位点氨基酸侧链基团的大小及电荷性质相关。[结论]G168位点甘氨酸是影响MscS通道失活的关键氨基酸。

摘要:[目的]谷氨酸棒杆菌是重要的氨基酸生产菌株,本研究针对SigE与ZAS家族蛋白CseE相互作用机制进行探索研究,重点分析CseE突变体影响与SigE结合能力的机制。[方法]本研究选择谷氨酸棒杆菌ATCC 13032来源的SigE和CseE蛋白为研究目标,利用遗传学方法获得过表达的重组谷氨酸棒杆菌,通过RT-qPCR研究SigE调控sigE和cseE的转录情况。同时,利用ITC和His pull-down实验验证ZAS家族的CseE蛋白与Zn²⁺及SigE的结合情况。之后对CseE蛋白进行功能域分析、多序列比对,研究功能域关键氨基酸位点对SigE结合能力的影响。其次对SigE和CseE蛋白进行分子对接和动力学模拟,分析关键氨基酸影响其结合的机制。[结果]谷氨酸棒杆菌SigE调控基因sigE和cseE的转录并且其活性受CseE蛋白控制。CseE蛋白为ZAS家族蛋白,具有Zn²⁺结合能力。CseE_His83A、CseE_cys87A和CseE_cys90A突变体不会影响与SigE的结合能力,而CseE_C87A-C90A和CseE_{His83A-C87A-C90A}突变体与SigE的结合能力略有下降。分子动力学模拟发现SigE-CseE_C87A-C90A和SigE-CseE_{His83A-C87A-C90A}之间的结合能量为-17.23 kcal/mol和-14.06 kcal/mol,分别比未突变体系结合能量降低22.8%及36.9%。[结论]谷氨酸棒杆菌SigE通过聚集RNA聚合酶来调控基因sigE和cseE的表达。CseE蛋白属于ZAS家族,具有Zn²⁺结合能力同时通过与SigE蛋白互作来抑制SigE活性。CseE_C87A-C90A及CseE_{His83A-C87A-C90A}突变体能影响与SigE结合的能力,减弱对SigE活性的控制。本研究产生的三维结构和确定的氨基酸关键位点为后续探索谷氨酸棒杆菌SigE和CseE响应环境压力机制提供了理论基础。

摘要:[目的]除根瘤菌外,豆科植物根瘤中还存在着大量的非根瘤菌,它们存在的意义及其潜在的生态学功能还不清楚,尤其是它们与根瘤菌间的互作机制更需揭示。[方法]以从陕北旱区野生白刺花根瘤中分离得到的根瘤菌和非根瘤菌为研究对象,采用共培养、二分隔平板实验和单独培养的方法,于正常培养条件下从白刺花根瘤中筛选出有互作效应的菌株,测定其对pH和NaCl的耐受性以及对各种氮源的利用情况,并通过根瘤菌的菌落直径、生长曲线和多糖产量来表征其互作效应,进一步探明互作菌株在盐碱和营养胁迫条件下互作效应转变的机制。[结果]在盐碱胁迫下,非根瘤菌Pseudomonas oryzihabitans BT-147和Priestia aryabhattai BT-59对Rhizobium azibense BT-170互作效果由正常培养条件下的抑制转变为促生,与对照组相比试验组R. azibense BT-170菌落直径分别增加了0.803 mm和1.034 mm。Bacillus siamensis BT-9-1在正常培养条件下抑制Mesorhizobium metallidurans YC-39的生长,而在盐碱胁迫下表现为促生作用,与对照组相比试验组M. metallidurans YC-39菌落直径增加了1.019 mm,多糖产量由1.088 µg/mL增加到2.555 µg/mL。在以谷氨酸作为唯一氮源时,Pseudomonas oryzihabitans BT-147和Priestia aryabhattai BT-59对R. azibense BT-170的互作效果转变为促生作用,R. azibense BT-170试验组与对照组菌落直径差分别达到1.348 mm和2.196 mm,其多糖产量从对照组的0.559 µg/mL分别增加到0.821 µg/mL和3.341 µg/mL。[结论]在盐碱和氮源的胁迫下,非根瘤菌Pseudomonas oryzihabitans BT-147和Priestia aryabhattai BT-59对R. azibense BT-170互作效果由正常培养条件下的抑制转变为促生,并显著提高了R. azibense BT-170多糖的产量(P<0.05),不同培养条件下根瘤菌与非根瘤菌互作模式的转变,提高了根瘤菌的抗逆性,扩大了根瘤菌可利用氮源的范围,揭示了非根瘤菌在根瘤微生态中所发挥的作用,并从体外简化了根瘤微生态中复杂的相互作用。

摘要:[目的]研究新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV) HBUN/LSRC/F3株(以下简称NDV F3)诱导宫颈癌细胞(HeLa)发生核糖体应激后对eIF2α介导的翻译起始复合体eIF4F的调控作用。[方法]流式细胞术及CCK-8检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测c-Myc基因表达;流式细胞术分析细胞周期;Western blotting技术检测c-Myc、RPS7、Bcl-2、NP、eIF4E及eIF2α蛋白的表达;Western blotting和免疫荧光染色技术检测NP、eIF4E蛋白定位。[结果]与阴性对照组相比,NDV F3抑制HeLa细胞增殖并诱导细胞凋亡。细胞周期中G₀/G₁期出现停滞,c-Myc表达呈时间依赖性抑制,c-Myc与Bcl-2蛋白表达量在0-48 h内逐渐下降,NP蛋白在24 h时生成并逐渐增加,RPS7、eIF4E和eIF2α蛋白含量在0-48 h内呈先增加后降低趋势。Western blotting定位分析及激光共聚焦显微镜结果显示NP蛋白主要存在细胞质中,NP与eIF4E存在共定位现象。[结论]NDV F3诱导HeLa细胞凋亡并引发核糖体应激反应,NP与eIF4E相互作用而抑制eIF2α介导的翻译起始复合体eIF4F形成,阻断其与宿主mRNA之间的联系,同时促进NDV F3 mRNA的翻译,最终造成宿主蛋白翻译抑制。

摘要:[目的]鉴定苏云金芽孢杆菌野生型菌株Bt S2480-1的杀虫活性并挖掘该菌株含有的杀虫基因资源。[方法]采用Illumina Hiseq2000测序平台对Bt S2480-1菌株进行全基因组测序,通过生物信息学方法获得该菌株的基因组信息、基因预测以及毒蛋白基因预测识别;随后,利用LTQ-Obitrap nano-LC-MS/MS系统对该菌株的总蛋白进行了质谱分析;最后以致倦库蚊幼虫和甜菜夜蛾幼虫为靶标昆虫对该菌株进行了生物活性测定。[结果]Bt S2480-1基因组大小为6.2 Mb,GC含量为35.11%,拼接得到1个拟核和3个大质粒的可视化草图,预测编码基因6 297个,其中含有12个预测毒蛋白基因。Bt S2480-1菌株总蛋白在LTQ-Orbitrap MS/MS质谱分析中共有 1500个蛋白质获得鉴定,鉴定获得11个毒蛋白。Bt S2480-1菌株总蛋白对致倦库蚊幼虫表现出非常高的杀蚊活性,而对甜菜夜蛾幼虫杀虫活性相对偏弱,其LC₅₀分别为27.636 μg/mL (95% FL:12.559‒61.707μg/mL)和496.833 μg/mg (95% FL:320.134-776.964μg/mg)。[结论]Bt S2480-1菌株基因组分析显示共含有12个预测毒蛋白基因,LTQ-Orbitrap MS/MS鉴定获得11个毒蛋白,Bt S2480-1菌株总蛋白对致倦库蚊和甜菜夜蛾幼虫都具有杀虫活性。

摘要:[目的]研究(S)-雌马酚对人体肠道菌群的体外调控作用和人体肠道菌群对(S)-雌马酚的代谢衍生作用。[方法]采用人体肠道菌群体外批量发酵、细菌16S rRNA基因高通量测序、气相色谱、液相色谱和质谱等检测(S)-雌马酚与人体肠道菌群体外相互作用。[结果]体外添加(S)-雌马酚对总体人肠道菌群结构和短链脂肪酸产量影响不明显。添加0.45 mmol/L (S)-雌马酚组与对照组相比,未检测到相对丰度发生显著变化的细菌;添加0.90 mmol/L (S)-雌马酚组与对照组相比,显著增加了肠杆菌科(Enterobacteriaceae)等条件致病菌的相对丰度,减少了潜在益生菌粪球菌属(Coprococcus)的比例。代谢分析发现,发酵培养液中(S)-雌马酚的浓度降低了约15%−30%,推测可能被微生物进一步降解或衍生修饰。[结论]从体外调控肠道菌群的角度判断,0.45 mmol/L (S)-雌马酚相对较安全,而0.90 mmol/L (S)-雌马酚可能会破坏肠道菌群平衡。(S)-雌马酚可以被人体肠道菌群进一步代谢,其特定代谢产物的结构与功能及其体内生物安全性有待进一步研究。

摘要:[目的]对陕西某大鲵养殖场患病的中国大鲵腹水中分离培养得到的一株蜡样芽孢杆菌群细菌疑似菌株进行鉴定,明确该菌生长特性和种类。[方法]无菌解剖患病大鲵,取肠道、腹水、皮肤等各部位的样品均质稀释并分离纯化,从腹水中获得疑似蜡样芽孢杆菌群细菌的纯菌株,命名为SHOU-BC01。对该菌株进行形态与染色特性、培养与生化特性、生物膜形成能力、芽孢形成、药敏检测、全基因组测序等试验鉴定,并根据测序结果进行平均核苷酸相似度(average nucleotide identity,ANI)、数字DNA-DNA杂交(digital DNA-DNA hybridization,dDDH)、多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)、全基因组SNP聚类和毒力因子分析。[结果]菌株SHOU-BC01为革兰氏阳性杆菌,表面粗糙;具有蛋白酶、卵磷脂酶和溶血酶活性;能够发酵L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖等多种糖类,能利用色氨酸、丙酮酸盐等;有较强生物膜形成能力;120 h的芽孢形成率达到70.60%;该菌株对青霉素G、头孢噻吩、万古霉素等15种抗生素耐药,对哌拉西林、头孢唑啉、庆大霉素等25种抗生素敏感;根据生物学特性结合ANI、dDDH及全基因组SNP聚类分析,鉴定菌株SHOU-BC01为副炭疽芽孢杆菌(Bacillus paranthracis),经MLST分型,该菌株属于ST205序列型;该菌株含有鞘磷脂酶、CytK和NheC毒素、多糖荚膜、PlcR-PapR群感效应系统及Ⅶ型分泌系统等毒力因子。[结论]成功从中国大鲵腹水中分离出副炭疽芽孢杆菌,丰富了大鲵副炭疽芽孢杆菌数据。

摘要:[目的]基于生态安全评估,探索溶藻细菌及其分泌物的抑藻效果与机制。[方法]分离获得溶藻细菌2-4 (Pseudomonassp.),通过正交试验和动力学模型研究了菌株2-4及其分泌物的抑藻特性,并通过急性毒性试验对菌株2-4及其分泌物进行生态风险评估。[结果]菌株2-4在最优条件下接种体积比(V/V)为15%时对铜绿微囊藻的4 d抑制率达92.81%,抑藻反应符合一级动力学模型(t_1/2=126 h)。菌株2-4具有抑藻多样性,首次报道了假单胞菌对斜生四链藻、蛋白核小球藻和丝藻的抑藻效果。菌株2-4分泌的抑藻活性物质分子量小于500 Da,不耐高温和强酸强碱。急性毒性试验结果显示,高于1.5%的菌液对大型溞有毒,高于2%的菌株分泌物对大型溞和稀有鮈鲫有毒,但对明亮发光杆菌无毒。较安全的使用范围内,菌株2-4 (V/V=1.5%)及其分泌物(V/V=10%)对藻华湖泊水样的叶绿素a去除率为4.83%–42.94%和30.62%–68.69%。[结论]本研究客观分析了假单胞菌2-4及其分泌物在生态安全使用范围内的实际抑藻效果,明晰了溶藻细菌生态毒性与抑藻效率的关系,为生物控藻实践提供理论参考。

摘要:pepT基因编码一种金属依赖性肽酶T (peptidase T,PepT),能特异性催化三肽N端氨基酸,因此也称为氨肽酶T。研究发现大多数氨肽酶参与细菌蛋白质新陈代谢和调节三肽活性,但关于PepT在细菌毒力及致病性方面的报道较少。[目的]本文选取PepT为研究对象,研究其对副溶血弧菌生物学特性及致病性的影响。[方法]通过构建缺失株ΔpepT和回补株CΔpepT,比较菌株在运动性、生物被膜、环境耐受、细胞毒性等方面的差异。[结果]与野生株相比,ΔpepT缺失株的极性鞭毛转录水平极显著下降,浮游运动能力降低;同时生物被膜形成能力减弱,而细菌群集运动及环境耐受能力无显著差异。此外,缺失pepT基因会导致副溶血弧菌的细胞毒性和小鼠毒力作用显著下降。[结论]pepT基因与副溶血弧菌浮游运动和生物被膜形成能力相关,并且影响其致病性。

摘要:[目的]观察一对紫绀型先天性心脏病双胞胎新生儿在接受手术及抗生素治疗前后的肠道菌群的动态变化,探究患儿肠道内阴沟肠杆菌在治疗期间耐药性如何发生改变。[方法]通过采集患儿在不同治疗阶段的粪便样本,进行培养组学和16S rRNA基因测序分析。同时,从双胞胎哥哥不同治疗阶段的粪便样本中分离得到10株阴沟肠杆菌进行体外药敏试验。[结果]培养组学结果显示使用抗生素导致术前粪便样本丰富度降低,仅可分离获得肠球菌属、不动杆菌属和肠杆菌属;长期医院环境暴露后,能分离出多种条件致病菌属,包括肠杆菌属、克雷伯菌属、不动杆菌属和假单胞菌属;母乳喂养4个月后,粪便菌群丰富度增加、构成发生改变,可分离获得乳杆菌属和双歧杆菌属等有益细菌。16S rRNA基因测序结果显示,在多种因素影响下不同治疗时间点α多样性指数和相对丰度最高的菌属不同。细菌耐药实验结果显示,治疗期间阴沟肠杆菌对哌拉西林逐渐产生耐药性。[结论]接受抗生素治疗、院内环境暴露和母乳喂养共同影响患儿治疗和康复期间的肠道菌群组成;在不同治疗阶段仅使用一种抗生素,也会导致阴沟肠杆菌对不同药物的耐药性发生改变。

摘要: