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微生物学报

  • 2022年第7期文章目次
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      2022, 62(7):0-0.

      摘要 (74) HTML (42) PDF 22.67 M (0) 评论 (0) 收藏

      摘要:

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      2022, 62(7):0-0.

      摘要 (44) HTML (27) PDF 655.29 K (0) 评论 (0) 收藏

      摘要:

    • >综述
    • 噬菌体特异性抗体对噬菌体治疗的影响

      2022, 62(7):2441-2454. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210623

      摘要 (219) HTML (183) PDF 615.61 K (184) 评论 (0) 收藏

      摘要:噬菌体治疗已成为当下防控泛耐药细菌感染的重要选择。噬菌体作为含有蛋白和核酸组分的病毒颗粒,经不同途径进入机体后,均能诱导机体产生特异性中和抗体。本文就噬菌体治疗过程中诱导机体产生的特异性中和抗体、抗体的产生规律、抗体是否影响噬菌体治疗疗效,以及可能克服抗体影响噬菌体治疗的方法等进行论述。噬菌体颗粒诱导特异性中和抗体的产生及血清抗噬菌体活性的水平与噬菌体的给予途径、类型和剂量、结构蛋白以及宿主的免疫状态、感染部位、治疗持续时间等均有关,且不同类型抗体产生时间和强度不同,均能中和噬菌体从而降低其杀菌效果。这提示在使用噬菌体治疗耐药细菌感染时,需要探索克服噬菌体中和抗体干扰的方法,或针对机体不同状态及感染类别制定相应的治疗策略,降低诱导机体产生噬菌体特异性中和抗体的风险,以获得最佳治疗效果。

    • 空肠弯曲菌CRISPR/Cas系统的研究进展

      2022, 62(7):2455-2465. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210660

      摘要 (103) HTML (141) PDF 599.35 K (105) 评论 (0) 收藏

      摘要:多数细菌都存在发挥免疫防御机制作用的CRISPR/Cas系统,在不同种属间呈现多态性。空肠弯曲菌是全球范围内重要的食源性病原菌,所致疾病也是典型的自限性疾病,其复杂的致病机制并未得到明确的解析,而空肠弯曲菌CRISPR/Cas系统的结构呈现多态性,研究两者关系仍存在诸多限制。本文从CRISPR/Cas系统在空肠弯曲菌中的结构、机制及技术应用等方面的研究进展进行综述,为探索空肠弯曲菌致病机制提供新思路。

    • 极端嗜热古菌核酸内切酶Ⅲ的研究进展

      2022, 62(7):2466-2477. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210663

      摘要 (112) HTML (122) PDF 837.57 K (117) 评论 (0) 收藏

      摘要:胸腺嘧啶乙二醇(thymine glycol,Tg)是常见的氧化性DNA损伤碱基之一。DNA中的Tg能够分别阻止DNA聚合酶和RNA聚合酶进行DNA复制和转录,导致相应的生物学过程终止,进而会引起细胞的死亡,因此DNA中的Tg需要被修复。核酸内切酶Ⅲ(endonuclease Ⅲ,EndoⅢ)是一种双功能DNA糖苷酶,能够切除DNA中的Tg,从而启动碱基切除修复途径进行修复DNA中的Tg。细菌、古菌和真核生物的基因组序列中均存在有EndoⅢ蛋白的编码基因。目前,源自于细菌和真核生物的EndoⅢ已有较多的研究,而古菌EndoⅢ的研究相对较少。基于目前已有的极端嗜热古菌EndoⅢ的研究报道,本文综述了极端嗜热古菌EndoⅢ的研究进展,并展望了今后的研究方向。

    • 人乳寡糖2′-岩藻糖基乳糖的功能及其全细胞生物合成

      2022, 62(7):2478-2497. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210700

      摘要 (54) HTML (83) PDF 3.27 M (69) 评论 (0) 收藏

      摘要:母乳是新生儿最理想的营养剂。其中,人乳寡糖作为母乳的第三大固体组分,对新生儿的生长、发育及健康状况有重要影响,被应用于婴幼儿配方食品中。2'-岩藻糖基乳糖(2'-fucosyllactose,2'-FL),是分泌型母乳中含量最高的人乳寡糖,约占人乳寡糖总量的30%,具有重要的营养和医学价值。2'-FL能够促进婴幼儿生长发育、提高其认知能力、增强免疫力、抗过敏、抗病毒,以及调节肠道菌群,是极具潜力的新型营养强化剂。但是,2'-FL来源于母乳,依靠分离、提取获得大量2'-FL并不现实,因此亟需进行人工合成。人工合成2'-FL的方法有3种,包括:化学合成法、酶催化合成法和全细胞生物合成法。全细胞生物合成法因其成本相对低廉,且易于规模化扩大,而引起了国内外的广泛关注和研究。目前,国外很多跨国公司均开始布局2'-FL的工业化生产和应用,而我国在该领域尚处于研发阶段,因此,了解和掌握2'-FL的合成方法对我国开展2'-FL规模化生产具有重要的意义。本文旨在介绍2'-FL的功能特性,系统阐述其全细胞生物合成的关键技术和最新进展,讨论了针对限速步骤进一步提高产量的策略,旨在为2'-FL的合成和商业化生产提供生物学依据,为今后开发接近母乳的婴幼儿配方奶粉奠定基础。

    • 环状细菌素研究进展

      2022, 62(7):2498-2508. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210714

      摘要 (95) HTML (127) PDF 615.95 K (81) 评论 (0) 收藏

      摘要:细菌素是一类由细菌核糖体合成的抗菌肽,是产生菌获得生存优势的重要手段。与大多数线性细菌素不同,环状细菌素具有N端和C端共价连接的特殊结构。这种环状结构赋予环状细菌素良好的耐热性、广泛的pH适应性和抗蛋白酶降解能力,在食品防腐和对治耐药性细菌领域表现出巨大的应用潜能。通过对已发现的环状细菌素结构分析发现,相对于一级结构,其三级结构的相似性更高,可以作为环状细菌素归类的依据。环状细菌素的生物合成机制尚不清楚,但其环化机制是最具价值的研究热点,可为其他一些肽类物质的合成提供支架,从而提高应用潜能。环状细菌素抑菌机制主要是在目标菌株的细胞膜上穿孔,使胞内物质外流,进而导致目标细菌死亡。其有类似于抗生素的抑菌活性和有别于抗生素的抑菌机制,为治疗日益严重的耐药性病原菌提供了可靠备选资源。本文综述了环状细菌素的构效关系、生物合成和抑菌机制方面的研究进展,希望能够对环状细菌素的深入研究和应用提供有价值的参考。

    • >研究报告
    • 油茶果生炭疽菌小分子GTP酶Rab7的功能研究

      2022, 62(7):2509-2520. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210532

      摘要 (84) HTML (61) PDF 832.69 K (77) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】炭疽病是油茶的一种重要病害,果生炭疽菌是油茶炭疽病的主要致病菌。本文对果生炭疽菌小分子GTP酶Rab7进行研究,为油茶炭疽病的防控治理提供依据。【方法】构建CfRAB7基因敲除载体,通过PEG介导的原生质体转化、抗性筛选和PCR电泳验证获得果生炭疽菌突变体菌株∆Cfrab7和互补菌株∆Cfrab7/CfRAB7。进一步分析CfRAB7基因敲除突变体∆Cfrab7的生长、产孢、附着孢的形成、胁迫应答、液泡融合和致病力等生物学表型。【结果】在PDA和MM培养基上,突变体∆Cfrab7的菌落直径显著减小,产孢量和附着孢形成率显著降低,且不能穿透玻璃纸;在10 mmol/L H2O2条件下,∆Cfrab7生长受到明显抑制;进一步研究发现突变体∆Cfrab7液泡无法正常融合,在油茶有伤和无伤的幼叶上均不发病。【结论】CfRAB7基因参与调控果生炭疽菌生长产孢、附着孢形成、H2O2胁迫应答、液泡融合和致病力。

    • 和厚朴酚对大肠埃希氏菌生物被膜形成的抑制机制

      2022, 62(7):2521-2529. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210589

      摘要 (86) HTML (64) PDF 585.94 K (86) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】研究不同浓度的和厚朴酚(honokiol)抑制大肠埃希菌(Escherichia coli)的供试菌株10389生物被膜(biofilm,BF)形成的作用机制。【方法】用氯化三苯基四氮唑比色法(TTC)和四唑盐减低法(XTT)测定honokiol抑制E.coli10389生物被膜形成的药物最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)及其抑制作用与时间的关系;通过qRT-PCR法检测不同浓度的honokiol对E.coli10389生物被膜形成基因和群体感应系统相关基因表达量的影响;通过生物发光法和qRT-PCR法检测亚-MIC honokiol对E.coli10389呋喃糖基硼酸二酯(AI-2)及其调控的与生物被膜形成相关的下游基因表达量的影响。【结果】Honokiol能抑制E.coli10389生物被膜的形成,但不同浓度的honokiol抑制E.coli10389 BF形成的作用机制不同。其中,与对照组相比,MIC的honokiol能使E.coli10389 BF形成相关基因编码毒素(hha)和细菌酸性调节因子(ariR) mRNA的表达量显著提高,抗毒素(ybaJ)的mRNA表达量显著降低。亚-MIC的honokiol则能抑制E.coli10389分泌AI-2的量,降低由其调控的与BF形成相关的下游基因的mRNA表达量。与对照组相比,16 mg/mL的honokiol可使荚膜异多糖酸基因mqsR、类黏蛋白基因mcbR和鞭毛形成基因csrA、flhD、flhC和flic的mRNA表达量分别降低65.21%、55.01%、73.16%、62.01%、60.30%和59.71%。【结论】Honokiol能抑制E.coli10389 BF的形成,但不同浓度的honokiol其抑制E.coli10389 BF形成的作用机制不同。其中,MIC的honokiol主要是通过影响BF形成的相关基因表达量来抑制E.coliBF的形成;而亚-MIC的honokiol则主要是通过抑制Luxs/AI-2系统的AI-2合成酶luxs基因的表达量,降低AI-2的分泌量,进而影响荚膜多糖、类黏蛋白和鞭毛等合成抑制E.coli BF的形成。

    • 组氨酸氨解酶HutH对副溶血弧菌生物学特性及致病性的影响

      2022, 62(7):2530-2542. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210593

      摘要 (62) HTML (34) PDF 843.14 K (56) 评论 (0) 收藏

      摘要:组氨酸氨解酶(HutH)作为组氨酸代谢通路上的第一个代谢酶,控制细菌内部组氨酸的代谢。HutH在多数细菌中高度保守,参与细菌的能量代谢平衡。【目的】选取HutH作为研究对象,探究其对副溶血弧菌生物学特性以及致病性的影响。【方法】利用同源重组的方法构建缺失株ΔhutH和回补株CΔhutH。研究HutH对副溶血弧菌生长特性、组氨酸利用能力、组氨酸代谢相关基因表达水平、运动性、生物被膜、环境耐受、细胞毒性以及对小鼠毒力的影响。【结果】与野生型菌株相比,hutH基因缺失不影响副溶血弧菌的生长特性、耐酸耐碱能力、耐盐能力和群集运动。但ΔhutH在组氨酸作为唯一碳源的M9极限培养基中生长受到显著抑制。另外,我们证实,hutH基因缺失使组氨酸代谢操纵子内的相关基因转录水平显著下降,基因VP0889的表达水平提高。hutH基因缺失导致副溶血弧菌生物被膜形成能力下降、泳动能力下降、对HeLa细胞的毒性降低、对ICR小鼠的致死率显著降低。【结论】本研究表明,hutH基因缺失影响副溶血弧菌代谢组氨酸的能力,而且首次证实,HutH在副溶血弧菌的生物被膜形成、运动性和对小鼠毒力等方面具有重要作用,为从调控组氨酸代谢途径来进行细菌防控提供思路。

    • 单核细胞增多性李斯特菌OpuCA蛋白介导抗氧化应激和宿主感染研究

      2022, 62(7):2543-2554. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210605

      摘要 (67) HTML (42) PDF 895.98 K (65) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】本文旨在研究opuCA基因在单核细胞增多性李斯特菌(单增李斯特菌)生长过程及渗透胁迫下发挥的作用,探究opuCA基因参与细菌抗氧化应激和致病力的生物学功能,为阐明OpuCA蛋白介导细菌环境适应和宿主内感染的机制奠定基础。【方法】利用细菌同源重组方法获得opuCA缺失株及回补株后,通过分子生物学、感染生物学和激光共聚焦技术,研究野生株和突变株的生长能力、抗渗透应激能力、抗氧化应激能力、细胞粘附、侵袭以及胞内增殖能力。【结果】缺失opuCA基因后,李斯特菌体外生长能力并没有受到影响,但在渗透条件下生长能力减弱;opuCA缺失株在铜离子和镉离子中抗氧化应激能力降低,但在巯基特异性氧化剂肼应激中无明显变化;opuCA缺失株在细胞中的侵袭能力显著减弱,且缺失该基因导致细菌聚合actin能力下降,进而影响了细菌在胞间迁移。【结论】本研究首次证实了缺失opuCA基因能降低单增李斯特菌抗氧化应激能力和感染宿主能力,并且在渗透胁迫下细菌生长能力减弱,但具体的分子机制有待深入研究。本研究有助于深入理解单增李斯特菌OpuCA蛋白介导的细菌体外环境适应及宿主内感染的分子机制,为防控单增李斯特菌感染提供了新策略。

    • 嗜热古菌Thermofilum adornatum来源的高温热激活β-葡萄糖苷酶TaBgl3的原核表达及酶学性质研究

      2022, 62(7):2555-2567. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210624

      摘要 (63) HTML (51) PDF 1.07 M (65) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】β-葡萄糖苷酶,又称β-D-葡萄糖苷水解酶,属于纤维素酶类,是一种降解纤维素的关键限速酶。来源于嗜热古菌的β-葡萄糖苷酶已被广泛验证具有酸性高温等特性,已成为高温酶的研究热点之一。本文对尚未报道的来源于嗜热古菌中一种热丝菌(Thermofilum adornatum)的GH3家族的葡萄糖苷酶,进行了原核表达和酶学性质测定,以期找到更优的β-葡萄糖苷酶。【方法】从NCBI数据库中获得了嗜热古菌(T.adornatum)来源的GH3氨基酸序列,构建重组质粒pET-30a (+)-TaBgl3,并在大肠杆菌(Escherichiacoli) BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达重组蛋白;采用磁珠纯化,研究其酶学性质。【结果】重组蛋白TaBgl3的分子量为77.0 kDa;酶学性质结果表明,其最适反应条件为80℃和pH 5.0,在70℃保温处理1–4 h,对TaBgl3的酶活力有促进作用,在最适温度80℃处理2 h后,其激活作用更加明显,能提高40%以上的酶活;其在pH 5.0–8.0下37℃保温1 h,仍具有60%以上的活性;底物为对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)时酶的比活力为144.23 U/mg,米氏常数Km值和最大反应速率Vmax分别为1.81 mmol/L和268.10 μmol/(mg·min),催化效率为115.47/s;终浓度为5 mmol/L的Cu2+、Li+和EDTA对TaBgl3的酶活有较大的促进作用,可提升39%以上的酶活,而5 mmol/L Fe3+和5%β-巯基乙醇对酶活有抑制作用,SDS、乙醇和葡萄糖对酶具有很强的抑制作用。【结论】本研究中,TaBgl3是酸性高温酶,且具有较好的热稳定性和热激活特性,这些特征在以后的理论研究及在工业生产中具有一定的科学价值。

    • 帕米尔高原可培养需氧冷适应细菌及古菌多样性

      2022, 62(7):2568-2581. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210625

      摘要 (87) HTML (59) PDF 942.96 K (160) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】帕米尔高原是贫营养、高辐射、干燥的冷环境,可能蕴藏丰富的冷适应微生物资源。本研究基于分离培养技术,探究帕米尔高原不同海拔梯度及不同培养条件下的冷适应微生物多样性。【方法】针对采集自帕米尔高原1 000-2 000 m、2 000-3 000 m、3 000-4 000 m和4 000-5 000 m四个海拔梯度的土壤样品,选用TSA和R2A两种培养基于4℃进行冷适应细菌的分离培养,NOM和F6两种培养基于4℃和15℃进行冷适应古菌的分离培养。根据16S rRNA基因序列同源性对分离菌株进行鉴定,分析不同海拔梯度和不同培养条件的物种多样性及之间的差异性。【结果】本研究从帕米尔高原共分离得到419株需氧原核微生物,16S rRNA基因测序鉴定结果表明,分离菌株隶属于2个域、5个门、8个纲、18个目、28个科、49个属及118个种,为115种冷适应细菌及3种古菌。冷适应细菌中,γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)为第一优势纲,放线菌纲(Actinobacteria)中物种多样性最为丰富。高海拔地区的冷适应细菌物种多样性存在差异,海拔1 000-4 000 m的优势菌群均为γ-变形菌纲,而4 000-5 000 m高海拔地区放线菌纲占比最高。古菌域微生物隶属于钠线菌属(Natrinema)和盐陆生菌属(Haloterrigena),且仅在1 000–2 000 m低海拔地区,培养温度为15℃时分离得到。4种培养基分离菌株中,γ-变形菌纲在TSA和R2A培养基分离的冷适应细菌中占优越地位,而NOM和F6培养基仅分离得到盐杆菌纲(Halobacteria)的古菌。此外,本研究获得23株潜在新物种,隶属于放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和广古菌门(Euryarchaeota)5个门。【结论】本研究从帕米尔高原分离获得了大量冷适应细菌以及古菌资源,揭示了帕米尔高原不同海拔的冷适应细菌及古菌分布多样性,以及不同培养条件下的分离效果,为冷适应细菌及古菌资源的开发与利用及其生态学功能研究提供了菌株材料和科学理论支持。

    • 兰州唐古特白刺根际微生物分离鉴定

      2022, 62(7):2582-2593. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210627

      摘要 (124) HTML (66) PDF 1.12 M (99) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】从兰州唐古特白刺根际分离得到对植物有潜在促生效果的功能微生物,为研发相关菌种制剂的研究奠定基础。【方法】通过平板划线法从其根际分离纯化出6株细菌,并对菌株进行形态特征观察、革兰氏染色等一系列生理生化试验。用藜麦检测各菌株的促生功能,并对具有优良促生作用的1个菌株16S rRNA基因进行分子鉴定及基因草图绘制。【结果】根据生化鉴定结果,6株细菌分别属于不动杆菌属(Acinetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和假单胞菌属(Pseudomonas)。其中,16S rRNA基因鉴定BC4属于肠杆菌属(Enterobacter),具有较好的促生效果。【结论】BC4具有较好的促生效果,为兰州唐古特白刺菌种资源的开发和利用提供了一定的理论依据。

    • 石磺来源海洋链霉菌Streptomyces ardesiacus SCSIO LO23中germicidin类化合物的分离鉴定及其生物合成分析

      2022, 62(7):2594-2609. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210635

      摘要 (63) HTML (62) PDF 991.03 K (71) 评论 (0) 收藏

      摘要:海洋共附生放线菌具有生产结构特殊和活性显著化合物的潜力。【目的】以海洋软体动物石磺Onchidium sp.来源共附生海洋链霉菌Streptomyces ardesiacus SCSIO LO23为研究对象,分离并鉴定其次级代谢产物结构,分析化合物的生物合成基因簇及其生物合成途径。【方法】采用多种培养基对该菌株进行发酵优化并放大发酵,利用多种柱色谱方法分离得到germicidin类化合物,并利用波谱学手段和X-Ray单晶衍射技术完成化合物的结构鉴定;利用Illumina HiSeq对目标菌株进行全基因组测序,结合antiSMASH和BLAST在线分析软件实现菌株中germicidin类化合物生物合成基因功能注释和生物合成途径分析,并通过异源表达进一步确定其生物合成基因。【结果】

      从AM3培养基发酵产物中分离鉴定了6个吡喃酮类化合物germicidin A (1)、germicidin B (2)、germicidin D (3)、germicidin H (4)、isogermicidin A (5)和isogermicidin B (6),其中化合物26对斑马鱼神经行为有显著兴奋作用。通过对Illumina HiSeq测序结果生物信息学分析,结合异源表达,验证了化合物生物合成的相关基因,并结合文献对化合物1–6的生物合成途径进行了推导。【结论】本研究阐明了菌株S.ardesiacus SCSIO LO23来源germicidin类化合物的结构、生物活性和其生物合成基因,夯实了该类化合物的研究基础。

    • 产气荚膜梭菌前噬菌体的分布特点及遗传进化分析

      2022, 62(7):2610-2623. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210637

      摘要 (49) HTML (49) PDF 1.19 M (64) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】分析和研究产气荚膜梭菌中前噬菌体的分布情况、基因组特点及遗传进化关系。【方法】利用PHASTER (phage search tool enhanced release)软件预测产气荚膜梭菌携带的前噬菌体,基于ANI (average nucleotide identity)值对前噬菌体进行分群,利用CARD (comprehensive antibiotic research database)、ResFinder 4.1、VFDB (virulence factors database)和BacMet (antibacterial biocide&metal resistance genes database)分析前噬菌体携带的耐药基因、毒力基因、抗菌剂/金属离子抗性基因,利用CRISPRCasFinder分析产气荚膜梭菌的CRISPR-Cas系统,利用MEGA 7.0进行前噬菌体的遗传进化关系分析。【结果】产气荚膜梭菌平均携带前噬菌体2.67条,其长度呈双峰分布,平均占基因组2.23%;前噬菌体不携带耐药基因,但携带了α毒素、唾液酶和溶血素等毒力基因以及重金属代谢基因;前噬菌体聚为3个类群,Group 1前噬菌体多为完整的前噬菌体且仅存在于A型产气荚膜梭菌;含完整的CRISPR-Cas系统的产气荚膜梭菌携带的前噬菌体相对较少,但CRISPR-Cas系统与前噬菌体的数量呈弱负相关;前噬菌体与产气荚膜梭菌噬菌体的遗传进化距离较远,仅有结构蛋白和部分酶类基因的同源性较高。【结论】产气荚膜梭菌普遍携带前噬菌体,但其CRISPR-Cas系统对前噬菌体的数量影响较小,前噬菌体携带的毒力基因和重金属代谢基因增强了产气荚膜梭菌致病性和对环境的适应性,但其功能和对产气荚膜梭菌遗传进化的影响仍需深入研究。

    • 疮痂链霉菌拮抗菌定向筛选及其功能评价

      2022, 62(7):2624-2641. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210649

      摘要 (52) HTML (53) PDF 1.26 M (100) 评论 (0) 收藏

      摘要:近年来由多种致病链霉菌引起的马铃薯疮痂病在我国普遍流行,且危害程度逐年加重,严重影响块茎的品质和商品价值。病原菌土传和种传,难以防控。利用拮抗微生物抑制病菌生长是目前防控疮痂病的重要措施。【目的】从病薯田土样中定向筛选对马铃薯疮痂病具有显著防效的菌种,研究其拮抗机制,评价其环境适应性,为开发可产业化应用的高效复合功能菌剂提供理论依据。【方法】通过平板对峙及盆栽试验研究目标菌株对主要病原菌疮痂链霉菌Streptomyces scabies的抑制效果;采用形态学、生理生化实验及分子生物学方法,确定其分类地位;结合高效液相色谱质谱联用方法分析相关抑菌活性物质。【结果】获得3株对致病链霉菌S.scabies具有显著拮抗功能的菌株HZ11-4、HS-12、HZ13-1,抑菌圈直径分别为34、29、30 mm,对马铃薯微型薯疮痂病的防效分别为68.57%、57.15%和65.96%。菌体革兰氏染色呈阳性,经鉴定均为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amylolique-faciens;3株菌皆可扩增出surfactin、iturin和fengycin等脂肽类物质合成酶相关基因片段,检测到上述脂肽类抗生素的存在,其中,仅surfactin对S.scabies有一定抑制效果,但非主要活性物质。3株菌对茄链格孢菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、大丽轮枝菌等多种植物病原菌均具有明显的抑制效果;可耐受pH 5–9、NaCl含量1%–7%的盐碱环境和100℃高温;对氟菌·霜霉威、氟硅唑、吡唑醚菌酯、春雷霉素、中生菌素和甲基硫菌灵等生产上常用的杀菌剂不敏感;具有显著促生长特性。【结论】HZ11-4、HS-12和HZ13-1具有良好的环境适应性和广谱抗病性,均可作为防控马铃薯土传病害功能菌剂的候选菌株。文章首次验证了脂肽类抗生素surfactin、iturin A和fengycin均非抑制S.scabies的主要活性物质。

    • 毕赤酵母截短PGK1启动子与不同终止子组合调控外源基因表达

      2022, 62(7):2642-2657. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210653

      摘要 (45) HTML (63) PDF 876.51 K (61) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】调控多基因表达对于优化代谢途径和合成生物学应用至关重要,构建不同的启动子和终止子组合,可作为毕赤酵母代谢途径改造和优化外源基因表达的有力分子调控工具。【方法】首先,将毕赤酵母组成型磷酸甘油酸激酶基因的启动子PPGK1进行截短,构建截短启动子分别调控报告基因(绿色荧光蛋白基因egfp和β-半乳糖苷酶基因lacZ)表达的毕赤酵母重组菌。检测重组菌的报告基团转录水平、荧光强度和β-半乳糖苷酶产量。然后,构建了不同强度启动子和终止子组合(共27种组合)调控egfp表达的重组菌。最后,选取能调控基因高、中、低表达的6个启动子-终止子组合,调控β-呋喃果糖苷酶基因表达,构建β-呋喃果糖苷酶分泌表达的重组菌。【结果】构建的截短启动子(PPPPPEPPGPPD)的强度是野生型启动子PPGK1的70%–190%,最强的启动子为PPD。分别与9个终止子组合时,PPGPPEPPD启动子驱动egfp基因表达的强度最高的和最低的相比分别达到4倍、7倍和10倍。6个启动子-终止子组合调控β-呋喃果糖苷酶分泌表达的重组菌胞外酶产量最高的和最低的相比可达6倍。【结论】构建了不同的启动子-终止子组合,调控基因表达水平最高的和最低的相比达到10倍,可为优化毕赤酵母代谢工程和合成生物学应用中控制不同外源基因的表达量提供有力的分子工具。

    • 一株红树林曲霉菌Aspergillus sp.WHUF0343的次级代谢产物研究

      2022, 62(7):2658-2670. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210655

      摘要 (84) HTML (125) PDF 662.83 K (76) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】研究分离自三亚亚龙湾红树林根系土壤的真菌Aspergillus sp.WHUF0343的次级代谢产物及其生物活性。【方法】利用硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析和半制备高效液相色谱等技术对该菌的发酵产物进行分离纯化;综合利用核磁共振波谱(NMR)和质谱(MS)等现代波谱技术以及与文献数据对照确定化合物的结构;分别采用肉汤微量稀释检测法和MTS法对化合物进行抗菌和肿瘤细胞毒活性测试。【结果】从真菌Aspergillus sp.WHUF0343的发酵产物共分离并鉴定了10个化合物,分别为isoechinulin A (1)、neoechinulin A (2)、neoechinulin E (3)、preechinulin (4)、neoechinulin D (5)、variecolorin J (6)、dehydroechinulin (7)、questinol (8)、emodin (9)和catenarin (10)。活性评价显示化合物2910对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及其耐药菌株具有较强的抑制活性;化合物1对3株肿瘤细胞B16、HepG2和MCF-7均具有细胞毒活性。【结论】Aspergillus sp.WHUF0343具有开发为微生物药物的潜在研究价值。

    • 利用基因组学和MALDI-TOF MS技术鉴定放线菌纲细菌的核糖体蛋白质标志物

      2022, 62(7):2671-2685. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210664

      摘要 (98) HTML (99) PDF 1.08 M (74) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)法基于微生物的特征蛋白指纹图谱鉴定菌种,本研究利用基因组学和MALDI-TOF MS技术鉴定放线菌纲细菌的核糖体蛋白质标志物。【方法】从MALDI-TOF MS图谱数据库选取放线菌纲代表菌种,在基因组数据库检索目标菌种,获取目标菌株或其参比菌株的核糖体蛋白质序列,计算获得分子质量理论值,用于注释目标菌株MALDI-TOF MS指纹图谱中的核糖体蛋白质信号。【结果】从8目,24科,53属,114种,142株放线菌的MALDI-TOF MS图谱中总共注释出31种核糖体蛋白质。各菌株的指纹图谱中核糖体蛋白质信号数量差异显著。各种核糖体蛋白质信号的注释次数差异显著。总共15种核糖体蛋白质在超过半数图谱中得到注释,注释次数最高的是核糖体大亚基蛋白质L36。【结论】本研究找到了放线菌纲细菌MALDI-TOF MS图谱中常见的15种核糖体蛋白质信号,可为通过识别核糖体蛋白质的质谱特征峰鉴定放线菌的方法建立提供依据。

    • 不同黏膜佐剂对猪丁型冠状病毒诱导小鼠免疫应答的影响

      2022, 62(7):2686-2701. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210682

      摘要 (41) HTML (36) PDF 1.40 M (44) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】旨在为猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)灭活疫苗黏膜免疫筛选理想佐剂,降低疫苗副作用。利用小鼠模型评价不同佐剂制备的PDCoV灭活疫苗对体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫应答的影响。【方法】将甘露聚糖肽(PA)、CpG ODN2395、单磷酰脂质A (MPLA)佐剂分别与IMS 1313、GEL02佐剂联合制备PDCoV灭活疫苗,经鼻腔免疫BALB/c小鼠;将ISA201佐剂制备的PDCoV灭活疫苗经皮下免疫BALB/c小鼠,将PDCoV灭活抗原经鼻腔免疫BALB/c小鼠作为对照,间隔14 d加强免疫一次。用ELISA方法检测小鼠血清、支气管肺泡灌洗液(BALF)中的IgG、IgG1、IgG2a、IL-4、IFN-γ及粪便和BALF中sIgA表达水平;用MTT方法检测疫苗免疫后对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响;观察并记录小鼠免疫后的临床表现,HE染色方法观察免疫小鼠主要器官组织的病理学变化,评价疫苗的安全性。【结果】ISA201组小鼠BALF和血清中的抗体(IgG、IgG1)及IL-4表达水平相对较高,但IgG2a、IFN-γ和粪便中sIgA表达水平较低;相较于IMS 1313组、IMS1313+2395组、IMS1313+PA组、IMS1313+MPLA组,GEL02组、GEL02+2395组、GEL02+PA组、GEL02+MPLA组小鼠BALF和血清中的抗体(IgG、IgG1、IgG2a)、IL-4、IFN-γ及粪便中sIgA表达水平均较高;其中GEL02+2395组小鼠BALF和血清中IgG2a抗体、IFN-γ及BALF和粪便中sIgA表达水平显著高于其他组;GEL02+2395疫苗、IMS1313+2395疫苗可促进T淋巴细胞增殖;小鼠主要器官组织未见明显病理变化,GEL02疫苗、GEL02+2395疫苗免疫小鼠的副反应最轻微。【结论】GEL02与CpG ODN2395佐剂联合制备PDCoV灭活疫苗经鼻腔免疫小鼠,不仅可增强小鼠体液免疫水平,也可有效提高细胞免疫和黏膜免疫水平,为黏膜疫苗的研发提供数据支持。

    • 基于转录组分析大肠杆菌响应亚碲酸盐的机制

      2022, 62(7):2702-2718. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210689

      摘要 (45) HTML (55) PDF 721.52 K (427) 评论 (0) 收藏

      摘要:亚碲酸盐对绝大多数微生物有高毒性,可用作抗菌剂;但其具体毒性机制仍不清楚。【目的】理解亚碲酸盐的毒性机制,揭示亚碲酸盐处理导致的代谢变化。【方法】本研究通过比较转录组分析与挖掘差异转录基因,探讨了大肠杆菌响应亚碲酸盐胁迫的机制。【结果】Escherichia coli MG1655在10µg/mL亚碲酸盐处理1 h后,比较和分析了亚碲酸盐处理组与对照组的转录水平差异,发现细胞呈现一种明显的适应性变化,许多参与重要代谢途径的基因转录水平改变。其中,与核糖体代谢和鞭毛组装相关基因的转录水平发生显著变化,表明这两条途径很可能是亚碲酸盐作用的主要途径。与细胞能动性、金属离子代谢、细胞膜功能相关的基因的转录水平也发生了明显变化,可能是由于其参与了抵抗亚碲酸盐毒性的细胞代谢调节和损伤修复。【结论】本项工作有助于推动亚碲酸盐毒性机理的研究,促进亚碲酸盐的临床应用。

    • 罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)养殖池塘沉积物中细菌、硫酸盐还原菌和硫氧化菌的垂直分布特征

      2022, 62(7):2719-2734. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210690

      摘要 (44) HTML (65) PDF 958.93 K (85) 评论 (0) 收藏

      摘要:沉积物中微生物介导的硫循环在有机物分解和养分循环中发挥重要作用,但目前我们对水产养殖生态系统中的参与硫酸盐还原和硫氧化过程的微生物多样性及其调控机制仍知之甚少。【目的】探究硫酸盐还原菌(sulfate-reducing bacteria,SRB)和硫氧化菌(sulfur-oxidizing bacteria,SOB)的垂直分布特征及其主要的环境驱动因素。【方法】本研究利用高通量测序和荧光定量PCR (qPCR)分析了罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)养殖池塘沉积物表层(0–1 cm)、中层(10–11 cm)和底层(20–21 cm)中的细菌、SRB和SOB的丰度、多样性和群落组成。【结果】细菌(16S rRNA)、硫酸盐还原菌(dsrB)和硫氧化菌(soxB)的基因拷贝数呈现着从表层到中层急剧骤降的趋势(ANOVA,P<0.05),但中层和底层样品之间的差异却并不显著(P>0.05),以及α多样性分析显示3个群体的物种丰富度和均匀度都随深度而逐步降低,这都说明硫循环过程主要发生于沉积物的表层。γ-、δ-和β-变形菌分别是细菌、SRB和SOB的优势类群;其中SRB以Desulfobacca属和脱硫八叠球菌属(Desulfosarcina)为主,前者在表层有着最低的比重,而后者却与之相反;硫杆菌(Thiobacillus)作为细菌和SOB的优势属,更广泛地分布于中层沉积物中。RDA分析和Mantel检验揭示了影响细菌群落的主要环境因子是NO3、SO42–、TOC和TON,而SRB的群落变异主要是由As、TON、NO3和Pb所驱动,以及SOB的群落变化则主要响应了TC、NO2、NH4+和TON浓度。【结论】养殖池塘底栖的细菌、SRB和SOB的丰度、多样性和群落结构的垂直分布特征可能受到多种环境因素共同的影响。

    • 辣椒镰孢根腐病防病促生细菌的筛选及其效应

      2022, 62(7):2735-2750. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210693

      摘要 (67) HTML (174) PDF 727.88 K (138) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】筛选辣椒(Capsicum annuumL.)根腐病防病促生细菌并明确其防病促生效应。【方法】采集健康辣椒根围土壤样品,以辣椒根腐病病原真菌茄镰孢(Fusarium solani)和尖镰孢(Fusarium oxysporum)为指示菌,采用平板对峙法筛选生防细菌,采用选择性培养基筛选溶无机磷、溶有机磷、固氮菌和解钾菌等促生菌,钼锑抗比色法测定溶磷量,凯氏定氮法测定固氮量,火焰原子吸收光谱法测定解钾量。对特性良好组合的菌株进行16S rDNA序列分析鉴定并制作菌剂,最后采用盆栽法测定菌剂防病促生效果。【结果】共筛选得到323株特性良好的功能菌株,拮抗菌78株,溶有机磷菌87株,溶无机磷菌107株,固氮菌128株,解钾菌123株,部分菌株同时具有多个功能特性。互作组合得到6个特性良好的菌株组合,包括8株功能菌株,鉴定发现XP271和XP181为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis),XP125为特基拉芽胞杆菌(Bacillus tequilensis),XP236为耐盐芽胞杆菌(Bacillus halotolerans),XP79为巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium),XP171为环状芽胞杆菌(Bacillus circulans),XP248为芬氏纤维微菌(Cellulosimicrobium funkei),XP167为产黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha)。选择2种优良组合制作菌剂,测定其防病促生效果发现,对辣椒镰孢根腐病的防效达88.52%,并使辣椒株高增加10 cm左右、分枝数平均增加2个、生物量增加5–21 g;辣椒根围土壤中碱解氮、速效磷、速效钾等土壤养分含量增加,脲酶、蔗糖酶、碱性磷酸酶等土壤酶活性增加,土壤过氧化氢酶含量降低;土壤微生物生物量碳、固氮基因、固氮微生物的含量均显著增加。【结论】辣椒根围土壤中含有功能良好防病促生菌株,制成菌剂对辣椒镰孢根腐病有良好的防效且对辣椒促生性能明显。

    • 鳖源铜绿假单胞菌的分离鉴定及多位点序列与全基因组分析

      2022, 62(7):2751-2767. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210694

      摘要 (84) HTML (72) PDF 1.10 M (60) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】查明引起湖北仙桃某中华鳖养殖场中华鳖发病死亡的病原及其特征。【方法】本研究分离患病中华鳖的病原,并结合形态特征、生理生化试验、16S rRNA基因鉴定,鉴定分离菌株;通过人工回归感染试验、药敏试验、全基因组测序与分析对分离菌株的致病性和耐药性进行研究;通过多位点序列分型(multilocus sequence type,MLST)分析,对分离菌株的流行情况进行探究。【结果】从患病中华鳖肝脏等部分分离到3株优势菌株HX8、FG10和GC20,16S rRNA基因同源性和生化特征分析鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。回归感染试验证实该菌株是引起本次中华鳖患病的病原菌。3株分离株的药敏实验结果基本一致,均对诺氟沙星、恩诺沙星等8种抗生素敏感,对氟苯尼考、多西环素、磺胺异恶唑等6种抗生素耐药。MLST鉴定表明, 3株分离株均属于序列型(sequence type,ST)252型,eBURST分析进一步显示ST252型与一些ST共同构成了克隆复合体(clonal complexes,CC) CC252,且ST252是CC252的原始序列型(founder ST)。全基因组测序结果显示,FG10的全基因组大小为5.65 Mb,GC含量为65.3%,共预测到5 956个编码序列(CDS),GenBank登录号为JAJGXC000000000。通过与毒力因子数据库(the virulence factor database,VFDB)比对,预测到873个毒力相关因子,主要与黏附、分泌系统以及毒素等相关。通过与耐药基因数据库(the comprehensive antibiotic resistance database,CARD)比对,结果显示FG10中含有喹诺酮类、碳青霉烯类、肽类等抗生素的耐药相关基因。【结论】本研究分离获得了中华鳖的病原细菌铜绿假单胞菌,MLST分析推测了其流行情况,基因组数据揭示了其毒力及耐药基因,为防控水产养殖中铜绿假单胞菌感染提供了一定的参考依据。

    • 母乳源乳双歧杆菌Probio-M8的遗传特征及基因组差异比较分析

      2022, 62(7):2768-2781. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210695

      摘要 (39) HTML (30) PDF 796.78 K (58) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】母乳源乳双歧杆菌(Bifidobacterium animalis subsp.lactis) Probio-M8具有优良的益生特性,本文拟从全基因组水平解析Probio-M8的遗传特征,并与已有益生功效的乳双歧杆菌的基因组进行比较分析。【方法】本研究基于NCBI已公开的21株乳双歧杆菌和1株模式菌株DSM10140T的基因组数据,构建了核心基因集与泛基因集,解析该群体的系统发育关系,比较分析Probio-M8的遗传特征及功能基因组。【结果】22株乳双歧杆菌的泛基因集包含1 618个基因,其中核心基因1 514个,占泛基因集的93.57%,表明乳双歧杆菌核心基因集高度保守。以1 514个核心基因构建系统发育树,发现22株乳双歧杆菌分为两个分支,AD011单独为一个分支,Probio-M8和其他菌株与模式菌株DSM10140T聚在同一分支,且Probio-M8与V9、BB-12、Bi-07、HN019的遗传距离极为接近。进一步分析耐药基因和毒力基因,在Probio-M8与V9、BB-12、Bi-07、HN019基因组上均检测到DfrA43、tetW及rpoB 3种拷贝数完全一致的固有耐药基因,且均不含毒力基因。碳水化合物代谢活性酶注释结果发现,Probio-M8与V9、Bi-07、BB-12和HN019均编码47个碳水化合物代谢相关基因的家族,其中,Bi-07缺少GH49基因,且少一个GH13基因的拷贝,而Probio-M8多一个GH49基因的拷贝,显示Probio-M8与V9、BB-12、Bi-07和HN019具有相似的碳水化合物代谢相关基因。【结论】本研究从全基因组水平完成了对22株乳双歧杆菌的比较分析,发现乳双歧杆菌的核心基因集高度保守,Probio-M8与V9、BB-12、Bi-07和HN019四株益生菌的遗传特征高度相似,基因组差异较小,为Probio-M8的后续研究提供数据支持。

    • 原料乳冷藏过程中微生物细胞的宏蛋白组学分析

      2022, 62(7):2782-2795. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210704

      摘要 (54) HTML (33) PDF 842.18 K (71) 评论 (0) 收藏

      摘要:原料乳在投入生产前通常需4℃冷藏,在这个过程中微生物的污染将造成冷藏原料乳的变质。【目的】本文旨在分子水平上探究原料乳冷藏过程中微生物表达的差异蛋白质的动态变化,为原料乳的冷藏提供理论支撑。【方法】利用Label-free技术研究原料乳4℃冷藏6 d期间微生物菌体蛋白质的物种来源、功能及参与通路,筛选差异蛋白质并对主要差异蛋白质参与的通路进行富集,探究其变化规律。【结果】冷藏过程中共鉴定出341个微生物菌体蛋白质,其中冷藏3 d后产生的蛋白质占所有检出蛋白质的60.12%。COG及KEGG分析表明,蛋白质所体现的功能及参与的通路随时间而变化。冷藏4 d,参与糖酵解/糖异生、ABC转运蛋白、氨基糖和核苷酸糖代谢等通路的蛋白数量显著增加。随冷藏时间延长,相邻时间点差异蛋白质数目逐渐增多,且富集在不同的通路中。【结论】冷藏过程中原料乳中的微生物所产生的蛋白质参与的通路及其所体现的功能复杂,4 d时的变化最为明显,或可作为原料乳质量控制的关键节点。

    • 不同分子量γ-聚谷氨酸的生物合成

      2022, 62(7):2796-2807. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210706

      摘要 (42) HTML (75) PDF 961.91 K (83) 评论 (0) 收藏

      摘要:【背景】不同分子量的γ-聚谷氨酸在农业、化妆品和医药领域具有重要的应用价值,开发不同分子量γ-聚谷氨酸的生物合成工艺已成为研究热点。【目的】在γ-聚谷氨酸生产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) KH2中实现不同分子量γ-聚谷氨酸的合成。【方法】分别克隆表达不同来源的水解酶,包括B.subtilis来源的γ-聚谷氨酸水解酶PgdS和YwtE,以及地衣芽孢杆菌来源的SGH。研究不同来源水解酶对B.subtilisKH2产γ-聚谷氨酸分子量的影响。通过改变水解酶处理条件获得不同分子量γ-聚谷氨酸的生物合成工艺。【结果】PgdS、YwtE和SGH均可降低γ-聚谷氨酸的分子量,其中PgdS水解效果最好,可以将γ-聚谷氨酸分子量由原来的1 600 kDa降低为180 kDa。通过优化PgdS的添加量与添加时间,在B.subtilisKH2中获得了分子量为210–600 kDa的γ-聚谷氨酸。【结论】利用水解酶处理,可以在B.subtilisKH2中实现不同分子量γ-聚谷氨酸的生物合成。该方法反应条件温和、分子量可控区间宽,具有良好的应用前景。

    • AI-2通过调节c-di-GMP代谢酶DosC影响类志贺邻单胞菌生物膜形成及运动性

      2022, 62(7):2808-2823. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210726

      摘要 (32) HTML (37) PDF 968.13 K (65) 评论 (0) 收藏

      摘要:细菌中广泛分布的群体感应信号分子autoinducer-2(AI-2)会影响细菌的生物膜形成及运动性等生理过程,然而该信号对类志贺邻单胞菌相关表型的调控作用及其分子机制尚未有所报道。【目的】揭示AI-2通过影响胞内环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)水平调控类志贺邻单胞菌生物膜形成及运动性的内在机制,为类志贺邻单胞菌感染的防治提供新思路。【方法】首先利用同源重组方法构建luxS基因敲除菌株(ΔluxS),通过软琼脂平板法和结晶紫染色法分别检测其与野生型泳动能力和生物膜形成水平的差异;之后通过序列比对找到AI-2的潜在受体蛋白DosC (SAMEA2665130_2180),利用哈维氏弧菌生物发光实验及等温滴定量热实验(ITC)研究DosC的配体结合结构域(ligand-binding domain,LBD)与AI-2的结合能力;通过体外酶活实验、胞内c-di-GMP定量分析研究AI-2对DosC受体活性的影响;最后参照前述方法构建受体DosC编码基因敲除菌株(ΔdosC)并检测其与野生型相比泳动能力和生物膜形成水平的变化。【结果】AI-2与DosC-LBD显示出高亲和作用力;通过高效液相色谱分析发现AI-2会增强受体蛋白DosC的磷酸二酯酶活性,促进c-di-GMP的降解。与野生型相比,ΔluxS和ΔdosC菌株胞内c-di-GMP水平显著升高,泳动与生物膜形成能力均显著降低。【结论】受体蛋白DosC通过响应群体感应信号分子AI-2,增强自身磷酸二酯酶活性,促进c-di-GMP的降解,影响胞内c-di-GMP的含量,进而调控细菌的生物膜形成和泳动能力等表型。

    • 鸡Toll样受体21单克隆抗体的研制及其初步应用

      2022, 62(7):2824-2834. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210736

      摘要 (42) HTML (37) PDF 821.40 K (58) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】研制鸡Toll样受体21(chTLR21)单克隆抗体,考察禽致病性大肠杆菌(APEC)及高致病性禽流感病毒(HPAIV)感染鸡组织中的chTLR21蛋白的表达情况。【方法】以人工合成的多肽免疫原chTLR21(203–225 aa)与KLH偶联蛋白免疫6周龄BALB/c小鼠,以多肽免疫原chTLR21(203–225 aa)与BSA偶联蛋白作为检测抗原,通过间接ELISA技术筛选阳性杂交瘤细胞株,同时,采用间接免疫荧光技术(IFA)检测单克隆抗体的荧光反应性;上述单克隆抗体用于chTLR21在鸡巨噬细胞(HD11)中的定位;在APEC O1血清型E516菌株、HPAIV H5N6亚型毒株感染35日龄SPF鸡模型中,应用获得的单克隆抗体以免疫印迹(Western blotting)和免疫组化(IHC)方法检测感染鸡组织中chTLR21的表达情况。【结果】建立了间接ELISA检测方法,确定最适抗原包被浓度为2.5 μg/mL,最适血清稀释度为1:6 400。经ELISA、IFA筛选,获得4株阳性杂交瘤细胞株,分别命名为1G3、2C10、3B6和4F11。上述单克隆抗体亚类分别为IgG2b、IgG1、IgG2b和IgG2a型,其中3B6具有较强的荧光反应性;制备单克隆抗体3B6腹水,其ELISA效价为1:102 400;IFA结果表明,chTLR21存在于HD11细胞质内;APEC感染鸡组织中chTLR21 Western blotting和IHC检测结果表明,感染鸡肝、脾、肺、肾、法氏囊中chTLR21表达量显著上升,而胰腺中表达量显著下降;HPAIV H5N6感染鸡上述组织中chTLR21的表达量均未见明显变化。【结论】本研究成功研制出针对鸡chTLR21受体的单克隆抗体,单克隆抗体3B6可用于检测鸡体内chTLR21表达情况,为chTLR21在病原体感染及天然免疫应答中的机制、功能研究提供了重要生物材料。

    • 不同种苏铁珊瑚状根内生微生物多样性及适应性研究

      2022, 62(7):2835-2849. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20210763

      摘要 (85) HTML (57) PDF 1.19 M (83) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】苏铁(Cycassp.)是珍稀濒危树种,能在干热河谷中长期稳定生存的原因可能与珊瑚状根内生微生物有密切关系。不同种苏铁在同一生境下其珊瑚状根内生微生物种类和群落组成存在怎样的差异性是本研究的科学问题。【方法】采用宏基因测序技术对四川省攀枝花公园内5种同属不同种苏铁珊瑚状根进行了分子鉴定,分析了苏铁间微生物类型、功能基因和代谢通路过程的差异性。【结果】公园内不同苏铁的珊瑚状根内生微生物的优势类群在门水平上基本相同,但相对丰度有差异性。在真菌界水平上的优势类群为担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)和隐真菌门(Cryptomycota),在细菌界水平上的优势类群为蓝细菌门(Cyanobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、螺旋体门(Spirochaetes)和放线菌门(Actinobacteria)。不同种的苏铁在真菌界和细菌界的微生物群落相对丰度存在一定差异。蓝细菌门在篦齿苏铁、攀枝花苏铁、华南苏铁和贵州苏铁中的相对丰度远高于宽叶苏铁,而放线菌门和球囊菌门在宽叶苏铁的相对丰度远高于篦齿苏铁、攀枝花苏铁、华南苏铁和贵州苏铁。通过KEGG数据库比对分析发现不同种苏铁间微生物的差异表达基因功能主要与环境适应和能量代谢通路相关。结果表明碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)、氨基酸代谢(amino acid metabolism)、基因结构的折叠、排列和降解(folding、sorting、degradation)及信号转导(signal transduction)的功能基因较为丰富。【结论】种植于同一地点的不同苏铁的珊瑚状根内生微生物的优势类群在门水平上基本相同,但相对丰度有差异性。珊瑚状根内的蓝细菌和放线菌参与的氮素和碳水化合物合成和代谢过程可能是苏铁适应干热河谷贫瘠环境的重要因素之一。

    • 结核分枝杆菌sRNA Mpr5的功能验证

      2022, 62(7):2850-2858. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20220073

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      摘要:【目的】探究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)中sRNA Mpr5对分枝杆菌的抗逆性及宿主细胞生理的影响。【方法】构建结核分枝杆菌sRNA Mpr5过表达的重组耻垢分枝杆菌(Mycolicibacterium smegmatis,M.smeg) M3-Atc,以转入空载质粒(pSI)的野生型耻垢分枝杆菌T1-Atc作为对照,观察细菌体外生长能力和菌落形态变化。通过非生物胁迫处理(低氧、饥饿、0.02%十二烷基硫酸钠)探究重组菌株的抗逆能力。用重组耻垢分枝杆菌侵染人非小细胞肺癌上皮细胞系A549,活菌涂板计算细菌的胞内增殖能力,利用免疫荧光染色观察感染后细胞的生理结构变化。【结果】sRNA Mpr5过表达菌株的体外生长与菌落形态均与野生型相似。抗逆性实验表明Mpr5过表达菌株(M3-Atc)的抗表面活性剂能力在4 h时显著提高(P<0.05);在饥饿模型中M3-Atc早期(2–12 h)就表现出生长劣势(P<0.05);低氧模型中M3-Atc菌株0–3 d均处于生长优势状态,增长均高于对照组(P<0.05),3 d后增长幅度低于对照组。Mpr5过表达不影响菌株对上皮细胞侵染能力及细胞毒力,但降低了细菌早期胞内存活及增殖能力。【结论】sRNA Mpr5的过表达影响细菌对低氧、饥饿的环境应激,改变其对上皮细胞的感染能力,可能影响分枝杆菌的致病能力。

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