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微生物学报

  • 2024年第4期文章目次
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      2024, 64(4):0-0.

      摘要 (117) HTML (117) PDF 444.51 K (281) 评论 (0) 收藏

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      2024, 64(4):0-0.

      摘要 (97) HTML (112) PDF 10.47 M (232) 评论 (0) 收藏

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    • >综述
    • 酵母2-苯乙醇耐受性的研究进展

      2024, 64(4):981-998. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230599

      摘要 (265) HTML (226) PDF 670.28 K (421) 评论 (0) 收藏

      摘要:2-苯乙醇(2-phenylethanol, 2-PE)是一种可食用且有玫瑰香味的高级芳香醇,常用于食品、化妆品和药品行业。由于物理和化学法制备2-PE得率低,不适用于工业生产。而作为单细胞真核微生物的酵母具有高效合成“天然” 2-PE的潜力,因此酵母作为底盘微生物合成2-PE的策略深受研究者青睐。然而,在酵母进行2-PE发酵过程中不免会受到2-PE毒害作用影响。因此,亟须研究酵母耐受2-PE的机制为生产实际提供理论基础,这也有助于选育具有较高2-PE耐受性的酵母菌株。本文综述了酵母2-PE耐受性的研究进展,从酵母2-PE合成途径、2-PE耐受性机理等方面进行阐述,主要说明提升酵母2-PE耐受性的方法。掌握酵母2-PE耐受机制,最终提升酵母2-PE产量及转化效率是今后研究的重中之重。

    • 吡咯喹啉醌合成及生产工艺研究进展

      2024, 64(4):999-1018. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230660

      摘要 (338) HTML (620) PDF 1.15 M (788) 评论 (0) 收藏

      摘要:吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone, PQQ)是继烟酰胺和核黄素之后发现的第三类氧化还原酶辅因子,普遍存在于生物体中参与呼吸链电子传递,具有促进线粒体产生、清除自由基、增强细胞代谢和预防心肌损伤等生理功能,在医药、食品和农业领域具有广泛的应用前景。微生物发酵法是PQQ生产的主要方式,解析PQQ生物合成途径及其调控机制,通过代谢工程选育短周期、高产量的生产菌是PQQ工业化的研究方向之一。本文综述了PQQ的合成途径、高产菌株选育以及微生物发酵生产与分离纯化的研发工作,为深入阐释PQQ的生物合成机制和工业化生产菌株的选育提供参考。

    • 靶向宿主致病菌sRNA的发现及其靶标确定的实验技术进展

      2024, 64(4):1019-1030. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230670

      摘要 (144) HTML (177) PDF 609.27 K (295) 评论 (0) 收藏

      摘要:人类时常暴露于充满各种致病菌的环境中,这些致病菌与人体细胞或组织之间存在多种相互作用。在相互作用的过程中,细菌通过调节自身毒性、侵袭性等致病性,以适应宿主环境并生存下来,同样,宿主细胞也会通过调动自身的免疫系统来抵抗致病菌的入侵。然而,大多数研究者主要聚焦于致病菌sRNA (small RNA, sRNA)自身生理功能的研究,致病菌与宿主相互作用的认识仍然处于起步阶段。因此,如何使用高灵敏性、高分辨率的方法研究致病菌与宿主之间的相互作用成为当前研究面临的一大难题。本文综合国内外相关研究,概述了目前研究致病菌与宿主相互作用常用的技术方法及实验流程,提高对其机制原理的理解,为致病菌sRNA-宿主靶标的相关研究提供技术参考。

    • 细菌中RNase HI介导RNA降解的研究进展

      2024, 64(4):1031-1043. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230725

      摘要 (164) HTML (180) PDF 725.07 K (301) 评论 (0) 收藏

      摘要:在细菌细胞中,为了维持基因组稳定和正常的生命活动,RNase HI通常以降解RNA/DNA杂合链中RNA的方式来防止复制中引物的积累以及转录中R环的形成。RNase HI对底物的识别主要依赖于DNA与RNA结合槽,对底物的催化主要依赖于DEDD基序和位于活性位点附近柔性环中的一个组氨酸。以Mg2+为代表的金属离子在催化过程中发挥了至关重要的作用。杂交双链中ssDNA突出部分的类型决定了RNase HI的作用模式:在没有突出或在ssDNA的5′端存在突出部分的情况下,RNase HI作为一种非序列特异性核酸内切酶随机地降解RNA;当ssDNA的3′端存在突出部分时,RNase HI依靠5′核酸外切酶活性对RNA进行连续切割。RNase HI、Rep、DinG和UvrD通过与单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA-binding protein, SSB)的C端尾部的6个残基相互作用被招募到复制叉附近,并可能以协作的方式解决复制-转录冲突。RNase HI的缺失或活性降低将引起DNA结构不稳定、基因突变、转录装置回溯和复制不协调等一系列有害后果。RNase HI在反义技术、R环检测和联合抗生素的靶向治疗等方面展现出巨大的应用价值。关于RNase HI与其他酶降解引物的合作机制也是未来值得研究的一个内容。

    • >研究报告
    • 烟草化感自毒物质降解复合菌剂的优化及应用效果评价

      2024, 64(4):1044-1063. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230477

      摘要 (166) HTML (141) PDF 1.06 M (276) 评论 (0) 收藏

      摘要:烟草(Nicotiana tabacum)长期连作导致土壤中烟草自身分泌的化感自毒物质的积累,加剧了烟草青枯病(tobacco bacterial wilt, TBW)的发生,严重威胁烟草的生产并造成了巨大的经济损失。【目的】获得对长期连作烟田青枯病具有显著防治效果的复合菌剂。【方法】利用筛选到的烟草化感自毒物质降解菌株构建复合菌剂,通过正交试验和单因素试验对菌种配比和助剂进行优化,对其在温室盆栽和连作烟田生产的应用效果进行评价。【结果】正交试验结果表明,复合菌剂中芽孢杆菌(Bacillus sp.) NO1、布鲁氏菌(Brucella sp.) NO8、芽孢杆菌(Bacillus sp.) NO9和NO10的最佳菌种配比为1:3:4:2;单因素试验结果表明最佳的载体为白炭黑;最佳润湿剂和分散剂分别为六偏磷酸钠和丁基萘磺酸钠,其最佳比例为1:1,最佳用量各为2%;稳定剂甘油的最佳浓度为1.0%。盆栽试验结果显示,复合菌剂对6种化感自毒物质的降解率和对青枯病的抑制率均达到78%以上。大田试验结果显示,100倍稀释的复合菌剂对连作15年烟田中的6种化感自毒物质具有显著的降解效果,并且能明显增加烟株的株高、茎围、腰叶长和腰叶宽,有效促进了烟草的生长发育;同时还调节了烟草根围微生物的丰度,显著抑制了狭义梭菌属1 (Clostridium_sensu_stricto_1)、劳尔氏菌属(Ralstonia)和纤维单胞属(Cellulomonas)等的相对丰度,大幅提高了戴沃斯菌属(Devosia)、黄杆菌属(Flavobacterium)和鞘氨醇单胞属(Sphingomonas)等的相对丰度。青枯病的发病率和病情指数也从处理前的92.22%和48.19%分别降低到18.15%和9.52%,防效超过了80.00%。【结论】本研究优化的复合菌剂显著降低了长期连作烟田青枯病的病情指数,可为长期连作烟田青枯病的防控提供解决方案。

    • 艾比湖湿地芦苇根际黏细菌群落多样性及其时空分布特征

      2024, 64(4):1064-1080. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230582

      摘要 (135) HTML (140) PDF 1.18 M (353) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】研究艾比湖湿地芦苇根际土壤未培养黏细菌多样性、群落结构及其时空分布特征,提高对盐碱湿地等极端环境黏细菌资源的认知,为今后开发利用极端环境黏细菌资源奠定基础,也为艾比湖湿地盐漠生态系统修复提供数据支撑。【方法】采集艾比湖湿地10个样地3个月份的芦苇根际土壤,针对16S rRNA基因的V4–V5区使用高通量测序技术研究黏细菌多样性、群落结构及其时空分布特征。【结果】艾比湖湿地黏细菌16S rRNA基因Tags数占细菌的0.22%–3.54%,7月份和样地4的多样性最高,说明属多样性与季节和样地相关。本研究共鉴定到黏球菌目的3个亚目、8个科、14个属,其中海无柄孢囊黏细菌属(Haliangium)为优势属,占10.83%–71.01%。网络共现图表明绝大多数细菌与黏细菌存在相互作用。Spearman分析表明,细菌的Shannon、Chao1和ACE指数影响着黏细菌的多样性和丰富度。冗余分析(redundancy analysis, RDA)表明,土壤无机氮(inorganic nitrogen, IN)、有机质(organic matter, OM)和水溶性镁离子(Mg2+)是影响黏细菌多样性、群落结构的主要非生物因子。【结论】艾比湖湿地黏细菌资源丰富,其多样性、群落结构受时空变化影响。生物因素(细菌)和非生物因素(土壤理化性质)共同影响着黏细菌多样性。

    • 不同pH值条件下硫酸盐还原菌组成及硫酸盐还原机制分析

      2024, 64(4):1081-1094. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230585

      摘要 (302) HTML (182) PDF 1.06 M (917) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】从海洋沉积物中富集获得硫酸盐还原菌群,改变pH值进行培养,分析pH值对硫酸盐还原性质的影响,明确菌群组成和进行硫酸盐还原功能基因预测,探究硫酸盐还原机制。【方法】分析硫酸盐还原菌群在不同pH值条件下的硫酸盐还原率,在此基础上,利用高通量测序技术和PICRUSt软件分析硫酸盐还原菌群优势菌组成及硫酸盐还原相关基因相对丰度。【结果】硫酸盐还原菌群在不同pH值培养条件下的生长和硫酸盐还原率出现显著变化(P<0.01),在pH 5.0时达到峰值,分别为0.34±0.01和96.52%±0.44%。高通量测序数据显示,pH 5.0时菌群丰富度和多样性最高,优势菌属为假单胞菌(Pseudomonas)和芽孢杆菌(Bacillus),相对丰度较高的基因为同化性硫酸盐还原相关基因。【结论】硫酸盐还原菌富集生长的最适pH 5.0,在此条件下的高硫酸盐还原率由同化性硫酸盐还原途径主导,为揭示硫酸盐还原机制提供了实验支持,并拓宽了硫酸盐还原菌实践应用方面的种质资源。

    • 植物乳杆菌后生元缓解小鼠沙门氏菌感染的作用效果及机理

      2024, 64(4):1095-1109. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230610

      摘要 (179) HTML (231) PDF 1.27 M (333) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】研究不同剂量的植物乳杆菌后生元缓解小鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica Typhimurium, ST)感染的作用效果及分子机制。【方法】选择60只5周龄的C57BL/6小鼠,分为5组:Control、ST、CFS-L+ST、CFS-M+ST和CFS-H+ST,后三组分别灌胃低、中、高剂量植物乳杆菌后生元,即50、100和200 μL的无细胞培养上清(cell-free culture supernatant, CFS)预处理21 d,然后在第22天灌胃3×108 CFU ST进行攻毒,3 d后采样。【结果】与对照组相比,饲喂低、中剂量CFS小鼠体重增长无明显变化,而高剂量组体重显著降低(P<0.05)。中、高剂量CFS预处理组可显著缓解沙门氏菌感染引起的小鼠体重损失(P<0.05);饲喂3种剂量的CFS均可显著降低ST在小鼠肝脏、脾脏、结肠和脑组织的细菌移位数量(P<0.05),并缓解结肠和脾脏病理损伤。ST攻毒显著降低盲肠乙酸和丁酸含量,而中剂量CFS预处理组具改善趋势,但差异不显著(P>0.05)。与ST组相比,预饲中剂量CFS可通过显著降低促炎因子白细胞介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)、白细胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)和肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)水平(P<0.05),以及显著升高抑炎因子白细胞介素-4 (interleukin-4, IL-4)和白细胞介素-10 (interleukin-10, IL-10)水平(P<0.05)缓解炎症反应。进一步研究发现,与ST组相比,CFS-M+ST组热蛋白结构域相关蛋白3 [nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor (NLR) family pyrin domain-containing protein 3, NLRP3]炎症小体关键基因NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein, ASC)、半胱氨酸蛋白酶(caspase-1)和细胞死亡调节蛋白(gasdermin D, GSDMD)的mRNA表达水平显著降低(P<0.05),其上游核因子-κB (nuclear factor kappa beta, NF-κB)通路中关键分子髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88, MyD88)、肿瘤坏死因子受体相关因子6 (tumor necrosis factor receptor-associated factor 6, TRAF6)、转化生长因子β激活激酶1 (transforming growth factor beta-activated kinase 1, TAK1)和NF-𝜅B的mRNA表达量显著降低(P<0.05)。【结论】植物乳杆菌后生元CFS可通过抑制NF-κB通路介导的NLRP3炎症小体缓解小鼠沙门氏菌感染和炎症反应,并且预饲中剂量CFS效果最佳。

    • 古井老枞茶树生态系统中细菌与真菌群落多样性特征分析

      2024, 64(4):1110-1126. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230617

      摘要 (143) HTML (146) PDF 1.68 M (367) 评论 (0) 收藏

      摘要:目的古井老枞经过漫长生长形成了独特“枞味”,而山场是茶叶品质形成的重要因素,微生物在山场生态系统的生物地球化学循环过程中可能起着关键作用,但老枞生态系统微生物群落组成特征还尚未明确。【方法】以生长于武夷山国家公园慧苑坑古井区域的老枞茶树为研究对象,采集茶树地上部叶片(叶际和叶内)和地下部土壤(根际、非根际和非茶园种植区空白),分别以细菌16S rRNA基因和真菌内部转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)基因为分子标记,采用高通量测序技术分析其细菌和真菌群落组成特征。【结果】老枞茶树地上部细菌和真菌群落丰富度和多样性皆显著低于地下部。共现性网络中,各生态位网络的模块化指数均超过0.4,且微生物物种之间的协同作用大于竞争。门水平,变形菌(Proteobacteria)、酸杆菌(Acidobacteriota)、放线菌(Actinobacteriota)、子囊菌(Ascomycota)和担子菌(Basidiomycota)皆为地上和地下共有优势菌门(相对丰度>1%),地上部变形菌、放线菌和子囊菌含量高于地下部,而酸杆菌和担子菌则相反(P<0.05);属水平,优势物种中甲基杆菌(Methylobacterium-Methylorubrum)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、假单胞菌(Pseudomonas)、氨杆菌(Amnibacterium)、芽胞杆菌(Bacillus)、枝胞菌(Cladosporium)和镰刀菌(Fusarium)是古井老枞各生态位主要的生物标记物。【结论】研究揭示了古井老枞茶树生态系统中不同生态位的细菌与真菌群落组成特征,可为今后深入研究老枞茶叶品质形成机理和茶树病害生物防治等相关功能菌种资源的应用提供科学参考。

    • Pseudomonas azotoformans F77和Pseudomonas paracarnis P1风化黑云母的效应及机制比较

      2024, 64(4):1127-1141. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230622

      摘要 (119) HTML (124) PDF 969.84 K (340) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】比较高效矿物风化固氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans) F77及其亲缘关系较近的假单胞菌(Pseudomonas paracarnis) P1风化黑云母的效应和机制。【方法】通过检测两株菌在不同时间点的发酵液中细胞数量、pH值、葡萄糖剩余量、葡萄糖酸浓度和可溶性Fe、Al释放量,比较它们对黑云母的风化效果与生理机制。采用RNA-seq技术研究这两株菌风化黑云母过程中出现差异的分子机制。【结果】在持续5 d的风化试验中,菌株F77发酵液中的细胞数量和pH值低于菌株P1,葡萄糖酸浓度是菌株P1的27.3-53.9倍,Fe和Al元素的释放量是菌株P1的3.3-23.3倍。比较转录组数据表明,菌株F77特有的基因数量(2 872)和差异基因数量(1 832)均多于菌株P1 (分别为1 903和1 258)。菌株F77在胞内物质跨膜转运与碳代谢、细胞运动、趋化与信号诱导等途径中基因数量也高于菌株P1。此外,菌株F77的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶基因差异表达倍数、葡萄糖酸合成基因数量和差异表达倍数也明显高于菌株P1。【结论】菌株F77风化黑云母以及合成葡萄糖酸的能力显著高于菌株P1。菌株F77通过产生葡萄糖酸来促进黑云母的风化。添加黑云母显著促进了菌株F77胞内与矿物风化相关基因的表达,如物质跨膜转运、细胞运动与趋化、信号诱导、碳代谢及能量代谢等途径基因。此外,葡萄糖酸合成途径基因、超氧化物歧化酶基因以及过氧化氢酶基因在矿物风化中可能发挥重要作用。

    • 青海不同区域农田作物土壤细菌多样性及群落结构分析

      2024, 64(4):1142-1161. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230638

      摘要 (135) HTML (151) PDF 1.84 M (282) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】探讨青海省农田土壤细菌多样性及群落结构组成。【方法】采用高通量测序技术分析都兰县、互助县、共和县和大通县种植小麦、油菜、青稞土壤细菌群落结构组成及多样性差异,并解析其与土壤理化特性的关系。【结果】4个地区的土壤pH、水分、有机质、Chao1指数、Shannon指数、线性判别分析效应大小(linear discriminant analysis effect size, LEfSe)组间差异这些指标中部分指标存在极显著差异性(P<0.01),而3种作物的这些指标无显著差异(P>0.05)。主成分分析(principal component analysis, PCA)显示,不同区域细菌群落组成差异性较大,3种作物农田土壤细菌群落、物种组成相似度较高。4个地区共有3 127个可操作性分类单元(operational taxonomic units, OTUs),3种作物农田土壤细菌共有OTUs为3 694个;细菌物种隶属于36门93纲192目276科450属423种;4个地区或3种作物土壤具有相似的优势门、属、种,但相对丰度不同。水分、pH、有机质与Chao1、Shannon存在显著相关性,pH、有机质与未分类种、unclassified RB41、unclassified Sphingomonas具有显著正相关或负相关。Chao1、Shannon与unclassified Sphingomonas显著负相关,与unclassified RB41、unclassified Vicinamibacteraceae显著正相关。【结论】区域差异对土壤的理化性质、细菌群落结构和多样性具有显著影响,相较于作物而言其影响更加明显。

    • 来源于马赛菌(Massilia sp.) UMI-21的ACSMU和PhaCMU体外表达及功能研究

      2024, 64(4):1162-1174. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230639

      摘要 (90) HTML (128) PDF 666.84 K (326) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】构建马赛菌(Massilia sp.) UMI-21来源乙酰辅酶A合成酶ACSMU和聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate, PHA)合酶PhaCMU的体外重组表达体系并过表达2种酶,利用体外合成体系确定2种酶在Massilia sp. UMI21聚3-羟基丁酸(polyhydroxybutyrate, PHB)合成途径中的主要功能。【方法】利用无缝克隆技术将来源于Massilia sp. UMI-21的乙酰辅酶A合成酶基因acsMU和PHA合酶基因phaCMU扩增后与pQE-80L质粒连接,转导大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)构建2个基因的重组表达体系;利用6×His标签纯化蛋白ACSMU和PhaCMU,并采用5,5′-二硫双(2-硝基苯甲酸) [5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid), DTNB]法测定其活性;使用体外单相合成系统(one-phase reaction system, OPRS),以(R)-3HB为底物,验证ACSMU和PhaCMU这2种酶在合成PHB途径中的功能。【结果】成功构建了ACSMU和PhaCMU蛋白重组表达菌株BL21-pQE-80L-acsMU和BL21-pQE-80L-phaCMU,提纯得到过表达蛋白ACSMU和PhaCMU产率分别为24.8 mg/L和25.6 mg/L;ACSMU酶比活力为(0.148±0.011) U/mg。PhaCMU酶对(R)-3HBCoA的比活力为(0.102±0.011) U/mg;核磁共振氢谱(nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy, 1H-NMR)分析结果表明,使用ACSPt-PCTCP-PhaCRe、ACSMU-PCTCP-PhaCRe和ACSMU-PCTCP-PhaCMU这3条OPRS途径均能合成PHB,产量分别为0.62、0.76和0.64 g/L。【结论】acsMUphaCMU基因可利用大肠杆菌表达体系过表达并可获得具有活性的可溶性蛋白;对比ACSPt-PCTCP-PhaCRe合成体系,ACSMU替代ACSPt合成PHB产量增加22.58%,在聚合酶相同的情况下,PHB的合成产量依赖乙酰辅酶A合成酶(acetyl-CoA synthase, ACS)合成乙酰辅酶A的稳定性。使用PhaCMU代替PhaCRe,对比ACSMU-PCTCP-PhaCRe组合,合成PHB产量减少了15.79%。在聚合前体浓度相同的情况下,PHB合成量依赖聚合酶的活性。

    • 深色有隔内生真菌不同培养时间对胞外聚合物合成的影响

      2024, 64(4):1175-1186. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230661

      摘要 (76) HTML (143) PDF 1.10 M (203) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】探索不同培养时间下深色有隔内生真菌(CGMCC 17463)合成胞外聚合物(extracellular polymeric substance, EPS)的产量及组成变化。【方法】通过摇瓶培养深色有隔内生真菌(dark septate endophytes, DSE),分析不同培养时间合成的EPS产量及应用的差异。【结果】摇瓶发酵试验表明,第4-12天,DSE生长趋于对数期和稳定期,EPS合成速率较快,在第12天产量达到1.41 g/L,之后EPS的合成速率逐渐降低。EPS组分分析结果表明,在相同质量的EPS中,第12天的胞外多糖含量较高,随着DSE生长进入稳定期至衰亡期,菌丝裂解,EPS中蛋白含量显著提高。官能团分析结果表明,不同培养时间的EPS中官能团种类并未发生变化,仅存在官能团含量上的改变。扫描电子显微镜和粒径分析结果表明,随着培养时间的增加,EPS的结构逐渐发生改变,EPS中分子粒径小于5 μm所占比例逐渐提高,分子粒径大于100 μm所占比例逐渐降低。另外,EPS的生物活性测定结果表明,不同培养时间合成的EPS均具有清除氧自由基和保水的能力,并且这种能力受EPS组分相对丰度变化的影响。【结论】第12天为提取胞外多糖含量相对较高的EPS最佳时机,第24天为提取蛋白含量相对较高的EPS最佳时机,这为EPS在环境复杂的矿山生态中应用奠定了基础。

    • 大肠杆菌CusS的生物信息学分析及对银离子胁迫的响应

      2024, 64(4):1187-1202. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230675

      摘要 (125) HTML (148) PDF 1.17 M (402) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】解析大肠杆菌(Escherichia coli) K-12菌株同型二聚体内膜传感器组氨酸激酶(sensor histidine kinase, CusS)蛋白在细菌应答金属银离子胁迫中的调控机制,为该菌的防治提供重要科学依据。【方法】利用ProtParam、ProtScale、Protein-Sol、TMHMM、SignalP、LocTree3、NetNGlyc-1.0、NetPhosBac-3.0、SOPMA、I-TASSERF、STRING和MEGA分别预测CusS的理化性质、亲水性、可溶性、跨膜域、信号肽、亚细胞定位、糖基化位点、磷酸化位点、二级结构、三级结构、蛋白互作的关系网络和蛋白在革兰阴性杆菌中的同源性。采用Red同源重组技术构建大肠杆菌ΔcusS,在不同培养基中连续监测ΔcusS的生长情况,观察该基因缺失后的细菌生长活性;通过最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)试验评价该缺失株对金属铜、银离子和临床常见抗生素的敏感性变化;运用RT-qPCR检测cusS缺失后其下游基因cusCFBAcusR转录水平。【结果】CusS蛋白由480个氨基酸组成,相对分子质量为53 738.05,原子总数为7 624,等电点为6.02,具有稳定性,是一种亲水性、不溶性蛋白;含有跨膜域;不存在信号肽,定位于细胞内膜中;存在2个糖基化位点、24个丝氨酸磷酸化位点、14个苏氨酸磷酸化位点和3个酪氨酸磷酸化位点;二级结构中α-螺旋占比55.42%,β-折叠占比11.67%,β-转角占比3.75%,无规则卷曲占比29.17%;cusS在埃希菌属和志贺菌属中的保守性高;菌落PCR和一代测序验证ΔcusS构建成功;连续检测生长曲线表明cusS缺失并不影响细菌的生长代谢,但CusS蛋白为大肠杆菌抵御金属银胁迫的关键基因。【结论】cusS作为一个关键基因,它的缺失并不影响大肠杆菌的生长活性,但会显著降低细菌抵御银离子胁迫的应答能力。缺失cusS将使下游基因cusCFBAcusR的mRNA表达水平显著下降。对CusS蛋白进行生物信息学分析及表型初探,为深入了解CusS在大肠杆菌应答银离子胁迫的调控机制奠定了基础。

    • 家蚕微粒子虫分泌蛋白己糖激酶NbHK对家蚕基因表达及相关通路的调控作用

      2024, 64(4):1203-1218. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230678

      摘要 (82) HTML (184) PDF 1.04 M (280) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】微孢子虫是一种营专性细胞内寄生的微生物,它可以感染几乎所有动物种类,包括人类和重要的经济动物。本研究对家蚕微粒子虫分泌蛋白己糖激酶(Nosema bombycis hexokinase, NbHK)在家蚕胚胎细胞中表达特征、亚细胞定位、调控作用和宿主互作蛋白质进行了系统分析,为阐明该蛋白在侵染中的作用与机理提供参考。【方法】利用原核表达蛋白免疫小鼠,制备NbHK的多克隆抗体,并利用Western blotting和间接免疫荧光法分析家蚕微粒子虫在感染的家蚕胚胎细胞(Bombyx mori embryo, BmE)中的表达和定位;通过过表达和RNA干扰实验,分析NbHK对病原增殖的作用;利用RNA-seq分析NbHK调控的家蚕基因表达和通路;利用生物素-链霉亲和素系统和质谱技术,从NbHK::APEX2转基因细胞中分离鉴定NbHK的互作蛋白。【结果】在感染家蚕微粒子虫的BmE中,NbHK持续上调表达,主要被定位于宿主细胞核内。过表达NbHK显著促进了病原增殖,而敲低NbHK则明显抑制了病原增殖,说明在NbHK感染过程中发挥关键作用。利用RNA-seq分析鉴定了94个差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs),其中58个基因上调,36个基因下调。DEGs的富集分析显示,细胞寿命和内质网蛋白加工通路受到显著激活,而线粒体自噬途径受到明显抑制。互作蛋白鉴定分析发现,NbHK可能与宿主细胞核内的核蛋白易位启动子区(nucleoprotein translocated promoter region, NTPR)等蛋白间存在相互作用。【结论】NbHK主要被定位至家蚕细胞核中,调控家蚕细胞寿命等多个重要通路的基因表达,以利于病原增殖。本研究为深入解析NbHK在感染过程中的功能及其调控机理提供了新的参考。

    • 单增李斯特菌毒力因子溶血素关键氨基酸位点在感染过程中的作用研究

      2024, 64(4):1219-1232. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230679

      摘要 (122) HTML (168) PDF 8.59 M (290) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】探究单增李斯特菌溶血素O (listeriolysin O, LLO)中D3区域β8折叠片上第253位氨基酸(谷氨酰胺,Q)和第254位氨基酸(异亮氨酸,I)对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)感染生物学功能的影响。【方法】构建LLOQ253A和LLOI254A突变蛋白的原核表达菌株,以及利用同源重组方法构建hlyQ253AhlyI254A突变株;通过表达纯化突变蛋白,测定溶血活性;比较LLO第253位Q和第254位I均突变成丙氨酸(A)后,对细菌体外生长能力、黏附侵袭、胞内迁移和增殖能力的影响。【结果】相应位点突变后,LLO蛋白均能够正常表达。在pH 6.5条件下,所有突变蛋白和突变株的溶血活性丧失。然而,在pH 5.5条件下,LLOI254AhlyI254A恢复了溶血活性。与野生株相比,突变株的体外生长、黏附能力和胞内增殖能力均无明显差异;突变株的侵袭能力和胞间迁移能力显著低于野生株。【结论】本研究证实第253位Q和第254位I均突变成A后,单增李斯特菌在pH 6.5条件下丧失溶血活性,并降低了感染宿主细胞的能力,但具体机制还有待进一步探索。本研究为深入探究LLO结构对单增李斯特菌生物学功能的影响奠定基础,对单增李斯特菌点突变株的构建具有一定参考意义。

    • 花生根际促生复合菌剂对连作花生生理生化指标和根际细菌群落的影响

      2024, 64(4):1233-1248. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230681

      摘要 (178) HTML (206) PDF 1.23 M (360) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】利用多功能根际促生菌剂促进花生生长,缓解连作障碍对花生的生长抑制。【方法】从10年连作花生根际土中筛选根际微生物,测定其促生及拮抗能力,并经16S rRNA基因测序确定菌株分类。选取3株功能互补且相互之间无生长抑制的根际促生菌制备微生物复合菌剂,利用发芽及盆栽试验验证微生物复合菌剂的促生效应。利用高通量测序技术对花生根际土壤细菌的16S rRNA基因的V3-V4区进行测序分析。【结果】从连作花生根际中共筛选获得37株具有促生及抑制植物病原菌生长能力的根际促生菌,选取3株制备微生物复合菌剂。与空白对照相比,复合菌剂显著提升花生发芽率13.22%;与单独使用根际促生菌相比,复合菌剂显著提升花生发芽率分别为6.99%、7.51%、8.87%。施用复合菌剂对花生根系形态、根瘤数量、叶绿素含量、植株光合参数和植株抗氧化酶活均有显著促进作用,花生根系总长、根尖数、主根直径、根系体积和根系活力分别增加了43.50%、49.31%、15.11%、16.92%和112.16%;花生苗期、花针期叶片叶绿素含量和光合作用均得到显著的提高;花生根瘤数量每株增加34个。施用复合菌剂后对花生的根际细菌多样性影响并不显著,在门水平上的优势菌门变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteriota)和拟杆菌门(Bacteroidota)占70%以上。在属水平上新鞘氨醇菌属(Novosphingobium)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)是优势菌属。【结论】本研究研制的花生根际促生复合菌剂可有效促进花生种子发芽、花生根系生长、提高叶片叶绿素含量以及促进植物光合作用,为缓解花生连作障碍及丰产增收提供有效的技术支持。

    • 江山乌猪肠道黏膜菌群组成及其功能的性别差异

      2024, 64(4):1249-1262. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230683

      摘要 (93) HTML (121) PDF 1.49 M (287) 评论 (0) 收藏

      摘要:肠道黏膜微生物在调控宿主生理功能方面发挥重要作用,其结构组成受到多种因素影响。性别被认为是塑造肠道微生物的因素之一。然而,性别对肠道黏膜菌群的差异影响还不清楚。目的以江山乌猪为研究对象,探究性别差异对其肠道黏膜微生物组成及功能的影响。方法选取性成熟的雌性和雄性江山乌猪各8头,利用16S rRNA基因高通量测序技术分析回肠和结肠黏膜菌群。结果在回肠黏膜中,雄性江山乌猪菌群的Chao1指数和Shannon指数显著高于雌性(P<0.05),在结肠黏膜中,不同性别江山乌猪菌群Chao1指数和Shannon指数无显著差异(P>0.05)。菌群差异分析显示,回肠黏膜中,沙雷氏菌属(Serratia)和埃希氏志贺菌属(Escherichia_Shigella)在雌性组中的相对丰度显著高于雄性组(P<0.05),雄性组中Oscillospiraceae UCG-005、拟普雷沃氏菌属(Alloprevotella)、布劳特氏菌属(Blautia)和Prevotellaceae_NK3B31_group相对丰度显著高于雌性组(P<0.05);结肠黏膜中,雌性组中unclassified_MuribaculaceaeRikenellaceae_RC9_gut_group和Prevotellaceae UCG-003相对丰度显著高于雄性组(P<0.05),Oscillospiraceae UCG-005、Lachnospiraceae_NK4A136_group和unclassified_Lachnospiraceae在雄性组中相对丰度更高(P<0.05)。功能预测发现,雄性乌猪回肠黏膜菌群显著富集了氨基酸代谢、碳水化合物代谢和能量代谢等功能途径(P<0.05);结肠黏膜菌群主要富集了膜转运相关的ABC转运蛋白和信号转导相关的双组分系统等功能途径(P<0.05)。结论不同性别江山乌猪肠黏膜菌群结构及功能具有明显差异。这些结果揭示了不同性别江山乌猪肠道黏膜菌群的差异特征,为了解和挖掘我国地方畜禽品种肠道微生物资源提供部分参考。

    • 鼠伤寒沙门菌小RNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpD的表达调控

      2024, 64(4):1263-1273. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230695

      摘要 (90) HTML (123) PDF 734.86 K (295) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】探究小RNA (small RNA, sRNA) RybB和伴侣蛋白Hfq对沙门氏菌孔蛋白OmpD表达的调控作用。【方法】以鼠伤寒沙门菌(Salmonella Typhimurium, STM)为研究对象,将含有编码β-半乳糖苷酶的lacZ报告基因的pCE40质粒转入ompD基因单缺失菌株中以获得lacZ报告菌株;在此基础上,利用P22噬菌体转导技术分在lacZ报告菌株中构建rybB全序列缺失、hfq全序列缺失、hfq点序列敲除和hfq序列截短以获得双突变实验菌株,以及rybB全序列缺失和hfq全序列缺失的三突变实验菌株。通过β-半乳糖苷酶活性试验和RT-qPCR探究sRNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpD表达的调控作用。【结果】成功在lacZ报告菌中构建rybB全序列缺失、hfq全序列缺失、hfq点序列敲除和hfq序列截短等双缺失实验菌株,以及rybB全序列缺失和hfq全序列缺失的三突变实验菌株。与野生型(wild type, WT)菌株相比,在lacZ报告菌株中,hfq基因截短为87个氨基酸序列的突变株中的OmpD蛋白活性下调了2.16%,其余实验株OmpD蛋白的β-半乳糖苷酶活性均呈上升趋势。与WT菌株相比,实验菌株ompD基因转录水平除了STM LT2∆ompD::lacZΔhfq65的上调不具有显著性外,其余实验菌株均显著(P<0.05)上调,其中lacZ报告菌株、rybB全序列缺失和hfq全序列缺失的三突变实验菌株ompD基因转录水平上调最明显,为1.83倍。【结论】ompD基因的转录及蛋白表达主要受hfq基因和sRNA RybB的负反馈调节;Hfq的远端面在对ompD基因的转录抑制中起关键作用。通过多个基因突变菌株的构建,阐述了sRNA伴侣蛋白Hfq与孔蛋白OmpD的相互作用关系,探索了Hfq对ompD的调控关键区域,丰富了sRNA的调控理论。

    • 一株嗜酸硫杆菌M4-422-6的分离及其全基因组测序和比较基因组学分析

      2024, 64(4):1274-1288. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230699

      摘要 (156) HTML (182) PDF 1.01 M (303) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】开展具有硫氧化能力的嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)的分离及其比较基因组学分析,不仅可以丰富硫氧化细菌菌种资源,而且有助于加深理解嗜酸硫杆菌的分子进化与生态适应机制。【方法】利用以硫代硫酸钠为唯一能源的培养基分离具有硫氧化能力的细菌;利用Illumina HiSeq X和Oxford Nanopore测序平台对一株嗜酸硫杆菌M4-422-6进行全基因组测序;利用相关生物信息学分析软件对原始数据进行组装和基因组注释,并与一株亲缘关系最近的菌株Igneacidithiobacillus copahuensis VAN18-1进行比较基因组学分析。【结果】分离获得一株具有硫氧化能力的嗜酸硫杆菌M4-422-6。基因组注释结果显示,菌株M4-422-6基因组由1个染色体和2个质粒组成,基因组大小为2 917 823 bp,G+C含量为58.54%,共编码2 925个蛋白。16S rRNA基因和基因组系统发育树显示,菌株M4-422-6代表嗜酸硫杆菌属的一个潜在新种。功能基因注释结果显示,菌株Acidithiobacillus sp. M4-422-6拥有与菌株特性相关的众多基因,包括硫氧化相关基因、CO2固定相关基因和耐酸相关基因。比较基因组学分析发现,虽然菌株M4-422-6与VAN18-1的亲缘关系最近,但两者仍拥有众多的差异基因,主要包括噬菌体抗性相关基因和移动元件编码基因。【结论】菌株M4-422-6代表嗜酸硫杆菌属的一个潜在新种,该菌株具有同种内菌株所不具有的特有基因,并据此推测嗜酸硫杆菌种内分化可归因于对特定生态位的适应。

    • 基因CfATG6CfATG14参与调控果生刺盘孢细胞自噬和致病力

      2024, 64(4):1289-1305. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230702

      摘要 (119) HTML (160) PDF 1.26 M (280) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】炭疽病是油茶的主要病害,由刺盘孢属的多种真菌引起,其中果生刺盘孢分布范围最广、分离率最高,是油茶炭疽病的主要致病菌。研究自噬相关蛋白CfAtg6和CfAtg14的生物学功能,为进一步揭示果生刺盘孢通过细胞自噬调控致病的分子机制,并为油茶炭疽病的防治提供理论基础。【方法】根据同源重组原理,通过聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)介导的方法,在果生刺盘孢中敲除基因CfATG6CfATG14,并进一步获得回补菌株ΔCfatg6-C和ΔCfatg14-C。【结果】酵母双杂交试验结果显示,果生刺盘孢蛋白CfAtg6和CfAtg14可能存在互作关系。生物学表型测定结果表明,相较于野生型和回补菌株,突变体ΔCfatg6和ΔCfatg14均表现出营养生长速率显著减慢,附着胞形成率分别只有野生型的5%和18%;突变体ΔCfatg6和ΔCfatg14致病力均极显著减弱,造成的油茶叶片病斑面积少于野生型和回补菌株的1/3;CfATG6CfATG14基因缺失突变体均丧失转运和降解CfAtg8蛋白的能力,并对细胞壁胁迫更敏感。突变体ΔCfatg6的分生孢子产量显著降低,仅为野生型的20%左右;氧化胁迫试验结果表明,相较于野生型和回补菌株,过氧化氢对突变体的生长抑制率升高10%左右。内质网压力胁迫试验表明,ΔCfatg14对二硫苏糖醇抑制率升高5%以上。【结论】自噬相关基因CfATG6CfATG14参与调控了果生刺盘孢生长发育、细胞自噬和致病力。

    • 层出镰刀菌乌头酸酶家族的功能研究

      2024, 64(4):1306-1321. DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20230729

      摘要 (118) HTML (141) PDF 1.22 M (245) 评论 (0) 收藏

      摘要:【目的】层出镰刀菌是引起苜蓿根腐病的主要病原菌之一,探究层出镰刀菌中乌头酸酶家族蛋白的功能特性,为深入认识层出镰刀菌基础生理代谢的分子机制提供依据。【方法】利用hmmsearch工具,对真菌中含有乌头酸酶结构域的蛋白进行检索,并进行系统进化分析;通过实时荧光定量PCR及SWISS MODEL建模技术分别分析FpACO基因的表达模式与蛋白结构;利用同源重组双交换方法构建层出镰刀菌乌头酸酶基因敲除突变体;分析ΔFpACO3、ΔFpACO4-1、ΔFpACO4-2敲除突变体的生长、产孢、孢子形态、环境胁迫响应及致病力等表型变化;进一步测定敲除突变体中线粒体代谢相关生理生化指标的变化情况。【结果】FpACO4-1与FpACO4-2在产孢及孢子形态发生中发挥作用;FpACO3、FpACO4-1、FpACO4-2参与调控层出镰刀菌对细胞壁胁迫及金属离子胁迫的敏感性;FpACO3、FpACO4-1、FpACO4-2影响线粒体代谢,包括总乌头酸酶活性、ATP含量、过氧化氢含量及三羧酸循环关键基因表达等。【结论】乌头酸酶家族参与调控层出镰刀菌产孢、孢子形态分化、细胞壁胁迫及金属离子胁迫响应和线粒体代谢等过程。

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