摘要:利用PCR技术从血清型1/2a的产单核细胞李斯特菌Lm4株中扩增出actA基因，经克隆筛选和测序鉴定后，构建成该基因的原核表达载体pGEX-6P-1actA及pET-actA，转入E coli后，IPTG诱导目的蛋白的表达。SDSPAGE结果表明，actA基因在两种载体中均获得表达，融合蛋白的大小分别约为120kDa和97kDa。以纯化蛋白为材料进行了ActA单抗的研制，获得4株抗ActA的单克隆抗体杂交瘤细胞株，腹水单抗ELISA效价为1∶5×104～1∶1×105。选取单抗1A5进行Western blot分析，结果表明单抗1A5能和表达产物进行特异[JP2]性反应，且与Lm4多抗血清的Western blot结果一致。actA基因的原核表达及单抗的研制为研究ActA蛋白的生物学活性及其致病作用奠定了基础。

摘要:根据GenBank中发表的新城疫病毒（NDV）融合蛋白（F）基因序列，设计一对引物，通过RTPCR扩增出鹅源新城疫病毒分离株JS5 F基因，测序确认后，将其克隆入真核表达载体pVAX1，获得重组真核表达质粒pVAX1F。将pVAX1F转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207，构建成携带DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207（pVAX1F）。重组菌以不同剂量口服免疫1日龄雏鸡，结果表明，细菌对雏鸡具有良好的安全性，且不影响鸡的增重。将SL7207（pVAX1F）分别以10.8CFU和109CFU的剂量3次口服免疫1日龄商品代伊莎褐蛋鸡，抗体检测结果显示，在三免后1周，SL7207（pVAX1F）10.9CFU剂量组的血清抗体效价与空载体组之间存在显著性差异（p<0.05）。重组菌两个剂量组在首免后2周开始出现粘膜抗体，并于二免后2周和3周达到较高水平。免疫保护试验结果显示，SL7207（pVAX1F）10.9 CFU剂量组的保护率为77.27%，与空载体组之间存在显著性差异（p<0.05）。

摘要:采用抑制差减杂交技术（Suppression subtractive hybridization，SSH）对禽致病性大肠杆菌E037株（血清型O78）与非致病菌株K_12 MG1655以及同一O2血清型高致病菌株E058与低致病菌株E526进行基因组差异片段克隆与分析。从E037株中共检出17个特异性差异片段，E058株中共检出32个特异性差异片段。经同源分析，这些序列可分为4类：质粒相关序列、噬菌体相关序列、已知功能序列、未知功能序列。这些差异片段包含许多重要的大肠杆菌毒力相关基因，如大肠杆菌素、气杆菌素受体、铁基因簇等。49个片段中，14个片段与其它微生物基因组同源性较高。结果表明，大肠杆菌高致病株与低致病菌株或非致病菌株基因组间存在较多差异基因，其中包括毒力、毒力相关基因、代谢以及噬菌体等基因成分。

摘要:鼠伤寒沙门氏菌SifA-基因突变株的特点是能进入真核细胞的胞液。利用P22噬菌体转导技术构建了鼠伤寒沙门氏菌疫苗株SL7207的SifA-突变株SL7207*，该突变株与SL7207有着相似的体外生长曲线和细胞侵袭力，SL7207*在MDCK上皮细胞中的增殖能力增强，但在RAW2647巨噬细胞中的生存能力减弱。小鼠毒力试验显示SL7207*在BALB/c小鼠体内毒力下降。仅SL7207*在体外可向RAW2647巨噬细胞递送真核表达质粒。SL7207*的构建为重组沙门氏菌疫苗载体的研制提供了一个新的选择。

摘要:李斯特菌溶血素(LLO)是产单核细胞李斯特菌的主要毒力因子，利用PCR技术从血清型4b的产单核细胞李斯特菌菌株中扩增出编码LLO的hly基因，经克隆筛选和测序鉴定后，构建成该基因的原核表达质粒pGEX6P1hly，SDSPAGE结果表明：LLO与谷胱甘肽在大肠杆菌中已融合表达，融合蛋白的分子量为82kD；溶血实验证明融合蛋白具有较强的裂解真核细胞膜的作用，表明表达产物LLO具有生物活性，其溶血效价达2.26×101.4 HU/mg，这为进一步研究其致病与免疫机理、单抗研制和疫苗设计提供了条件。

摘要:根据GenBank中已发表的H5亚型禽流感病毒HA基因序列，设计一对引物，通过RTPCR扩增鹅源H5亚型高致病力禽流感病毒HA基因，测序确认后，将其克隆入真核表达载体pVAX1和asdpVAX1得到重组表达载体pVAX1HA和asdpVAX1HA。将重组质粒转染P815细胞，经间接免疫荧光试验证实，HA基因在细胞内得到了瞬时表达。进一步将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550得到两种运送DNA疫苗的重组沙门氏菌X4550（pVAX1HA）和X4550（asdpVAX1HA），以1×109CFU/只的剂量两次口服免疫BALB/c小鼠，免疫小鼠不仅可以检测到HA特异性的血清抗体应答，而且还能抵抗稳定表达H5亚型禽流感病毒HA基因的P815肥大细胞瘤的攻击，说明该运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌系统在体内能够成功释放所携带的质粒，并且能够刺激机体产生保护性免疫应答。

摘要:从江苏、江西、安徽等7个省疑似黄、白痢直肠棉拭及病死猪的十二指肠和肠系膜淋巴结中分离鉴定出339株病原性大肠杆菌。经O血清型鉴定，除77株未能定型、41株自凝外，测定出221个分离株的O血清型，这些分离株覆盖了64个血清型，以O107、O101、O20、O93、O11和O149为主，共99株，占定型菌株的44.80%。这些血清型与已报道的常见血清型间存在一定差异。运用黏附素单抗对以上菌株进行F4、F5、F6、F18、F41　5种黏附素检测，共97个分离株表达黏附素(28061%)，而表达两种和3种黏附素的菌株分别有22株和8株，它们分别占表达黏附素菌株的22.68%和8.25%，其中单独表达F4、F6、F5+F41黏附素菌株分别有18、30、15株，分别占表达黏附素菌株的18.56%、30.93%和15.46%；同时运用多重PCR对其中145个分离株进行毒素基因(Sta、STb、LT、SLT2e)的检测，拥有Sta和STb毒素基因的菌株分别占检测菌株的51.72%和3724%。F6、F4、F5+F41和Sta、STb为该地区致初生仔猪腹泻大肠杆菌常见的毒力因子。

摘要:采用聚合酶链式反应(PCR)，从大肠杆菌O.138基因组DNA中分别扩增出志贺菌样毒素II型变体B的结构序列和包括信号肽的全序列两段基因，定向克隆进表达载体质粒pYA3334(asd++)的EcoRI,BamHI位点之间，构建成重组表达质粒。在大肠杆菌X6212(Δasd)筛选出重组质粒pB-0和pB-1后，经中间宿主X3730转化过渡，再导入ΔasdΔcyaΔcrp减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550，构建成宿主和载体之间具有平衡致死结构的SLTIIvB重组菌。SDSPAGE和Westernblot分析重组菌X4550(pB-0)在76kD左右处有一条特异性蛋白条带。动物免疫试验表明该重组菌能刺激机体产生针对SLTIIvB和沙门氏菌的特异性抗体。这为进一步研制相应的抗猪水肿病及相应沙门氏菌病的双价活疫苗奠定了重要基础。

摘要:以提纯的鼠伤寒沙门氏菌8705染色体DNA为材料,经EcoR Ⅰ消化,过SepharcylS-400柱,得到大于400bp的酶切片段;然后随机克隆到质粒pGEM-3Zf(—)中,转化大肠杆菌LC2a(hag~-,recA~-);在氨苄青霉素平板上共得到6013个转化子,从中筛选出1个有动力的克隆,小量制备质粒DNA,经酶切电泳鉴定,该克隆的外源片段大小为15.3kb,将其命名为pGI4015。动力、动力抑制试验和Southern blot分子杂交试验证明pGI4015中载有鼠伤寒沙门氏菌Ⅰ相鞭毛蛋白基因fliC~I;利用其BamH Ⅰ和Sal Ⅰ位点删除与鞭毛蛋白表达无关的序列,构建亚克隆质粒pGI4015BS,使得fliC~I定位于更小的区域——3.8kb的BamH Ⅰ/Sal Ⅰ插入片段上。

摘要:目的: 分析减毒鼠伤寒沙门菌口服感染后在小鼠体内定位的情况。方法: 将构建的红色荧光蛋白(RFP)原核质粒pYA33-DsRed, 以电穿孔法转化减毒鼠伤寒沙门菌X4550, 重组菌命名为X4550(33-DsRed)。重组菌分别感染巨噬细胞RAW264.7和骨髓源树突状细胞(BMDC), 并用流式细胞术检测红色荧光细胞荧光强度。此外, 以不同剂量重组菌口服免疫BALB/c小鼠, 并于免疫后1d、2d、3d、5d、7d取小鼠脾、肝、肠系膜淋巴结(MLN)、派伊尔氏结(PP)、腹股沟淋巴结(ILN)细胞, 检测各组织器官中的红色荧光阳性细胞百分率。结果: 重组菌对RAW264.7细胞和BMDC均具有良好的侵袭力。口服小鼠后, 第1d, 仅在MLN及PP中检测到RFP阳性细胞, 其中PP中阳性细胞达到1.4%; 第2 d, 在ILN中达到0.4%; 第3 d, 各个组织器官中RFP阳性细胞均有上升趋势, 此时在脾、肝中也检测到RFP阳性细胞。第5 d, RFP阳性细胞均减少, 第7 d则未检测到任何RFP阳性细胞。减毒鼠伤寒沙门菌具有良好的侵袭力, 其黏膜移行方式以及对免疫组织器官靶向定位性, 在优化黏膜疫苗以及提高疫苗免疫效力等方面都具有重要作用。