摘要:[目的] 本研究旨在明确蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis，简称球囊菌）菌丝和孢子中环状RNA（circular RNA，circRNA）的数量、种类和表达谱差异，并探讨共有circRNA、特有circRNA和差异表达circRNA（differentially expressed circRNA，DEcircRNA）在菌丝与孢子中的潜在作用。[方法] 基于前期获得的球囊菌菌丝（AaM）和孢子（AaS）的高质量RNA-seq数据，利用find_circ软件预测circRNA。通过Venn分析筛选AaM和AaS的共有circRNA和特有circRNA。根据P ≤ 0.05且|log2 fold change|≥ 1的标准筛选AaMvs.AaS比较组的DEcircRNA。通过比对GO和KEGG数据库对circRNA的来源基因进行功能和通路注释。利用TargetFinder软件预测circRNA靶向结合的miRNA及miRNA靶向结合的mRNA。采用Cytoscape软件对竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）调控网络进行可视化。通过RT-qPCR对DEcircRNA进行验证。[结果] AaM和AaS中分别含有13210156和19011000条短序列读段（anchors reads），其中分别有6124922和11392886条能够比对上球囊菌参考基因组。在AaM和AaS中分别鉴定到1868个和2225个circRNA，二者共有的circRNA为1098个，AaM的特有circRNA为770个，AaS的特有circRNA为1127个。AaM和AaS的circRNA长度主要介于1000-2000 nt，基因间区circRNA为主要环化类型。AaMvs.AaS比较组包含456个上调circRNA和97个下调circRNA。共有circRNA的来源基因可注释到29个功能条目和14类通路；AaM的特有circRNA的来源基因可注释到31个功能和17类通路；AaS的特有circRNA的来源基因可注释到34个功能条目和16类通路；DEcircRNA的来源基因可注释到29个功能条目和40条通路。调控网络分析结果显示，36个共有circRNA靶向4个miRNA进而调控6个与内吞作用通路相关的靶mRNA；4（255）个AaM（AaS）的特有circRNA靶向2（2）个miRNA进而调控8（2）个次级代谢产物生物合成通路相关的靶mRNA；9个DEcircRNA靶向2个DEmiRNA进而调控3个MAPK信号通路相关的DEmRNA。RT-qPCR结果显示10个DEcircRNA的表达趋势与测序数据一致，证实了测序数据的可靠性。[结论] 球囊菌菌丝和孢子的共有circRNA、特有circRNA和DEcircRNA可能通过调控来源基因表达和充当ceRNA的方式调节球囊菌的物质和能量代谢、内吞作用、次级代谢产物生物合成和MAPK信号通路，进而影响球囊菌菌丝生长、孢子萌发和致病性。

摘要:【目的】蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)是一种专性侵染蜜蜂幼虫的致死性真菌病原。本研究旨在利用PacBio单分子实时(single molecule real-time，SMRT)测序技术对蜜蜂球囊菌孢子(AaS)中基因的可变剪切(alternative splicing，AS)和可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation，APA)以及长链非编码RNA (long non-coding RNA，lncRNA)进行鉴定和分析，进而揭示蜜蜂球囊菌孢子中转录组的复杂性。【方法】采用Suppa软件对蜜蜂球囊菌孢子中基因的AS事件进行鉴定。通过RT-PCR对不同类型的AS事件进行验证。采用TAPIS pipeline对蜜蜂球囊菌孢子基因的APA位点进行鉴定。利用MEME软件分析孢子全长转录本的poly (A)剪接位点上游50 bp的序列特征并鉴定motif。联用CPC和CNCI软件和比对Swiss-prot数据库的方法预测lncRNA，取三者的交集作为高可信度的lncRNA集合。进一步比较lncRNA和mRNA的转录本长度，外显子数量与长度，内含子长度，GC含量，AS事件数量。【结果】在蜜蜂球囊菌孢子中共鉴定到2 609次AS事件，包括1 227次(47.03%)内含子保留(retained intron，RI)，842次(32.27%)可变3ʹ剪切(alternative 3ʹsplice sites，A3)，415次(15.91%)可变5ʹ剪切(alternative 5ʹsplice sites，A5)，85次(3.26%)可变起始外显子(alternative first exons，AF)，35次(1.34%)外显子跳跃(skipping exon，SE)，4次(0.15%)可变末端外显子(alternative last exons，AL)和1次(0.04%)互斥外显子(mutually exclusive exons，MX)。通过RT-PCR证实了不同类型AS事件(RI、A5、SE和A3)的可靠性。共鉴定出5 552个基因含APA位点，其中含有>5个APA位点的基因数量最多，达到2 197个，其次为含有1个APA位点的基因，数量为1 149个；此外，含有2、3、4和5个APA位点的基因数量分别为782、596、477和351个。蜜蜂球囊菌孢子中全长转录本的上下游序列具有明显的碱基倾向性，U和A分别在转录本的下游和上游富集。共鉴定到953条lncRNA。与mRNA相比，上述lncRNA的外显子数量更少且长度更短，内含子长度更短，转录本长度更短，GC含量更低，AS事件数量更少。【结论】本研究全面解析了AaS中的AS、APA和lncRNA，研究结果丰富了蜜蜂球囊菌的基础生物学信息，深入揭示了蜜蜂球囊菌孢子中转录组的复杂性，并为进一步探究不同剪接异构体在病原孢子和病原侵染中的分子功能打下了基础。