摘要:中枢神经系统(central nervous system，CNS)感染是指由病毒、细菌或真菌等侵染中枢神经系统引起的急性或慢性炎症性(或非炎症性)疾病，致死率高，易引发严重后遗症。由于检测通量及灵敏度的限制，一半以上的中枢神经系统感染患者无法通过常规检测方法确定病原体。宏基因组测序是一种新兴的病原检测技术，能够极大地提升病原检出率。当前部分临床医生及相关从业人员对宏基因组测序的认识存在不足，限制了其在临床诊疗中的快速推广和应用。本文系统介绍了宏基因组测序整体流程，综述了该技术在中枢神经系统感染性疾病诊疗中的发展历程和最新研究进展，希望为中枢神经系统感染性疾病的诊断和治疗提供参考。

摘要:【目的】 构建同时表达双报告基因(荧光素酶Fluc和红色荧光蛋白mCherry)的重组痘苗病毒WR株。【方法】 采用CRISPR/Cas9技术构建针对WR株J2R区的gRNA CRISPR/Cas9质粒及表达Fluc和mCherry的质粒pJSE-Fluc/mCherry，插入至TK区构建重组痘苗病毒rWR-Fluc/mCherry。采用PCR与测序分析基因插入位置与序列的准确性；通过mCherry、Fluc活性、空斑形态鉴定重组病毒；重组病毒连续盲传12代，检测双报告基因及E3L表达分析重组病毒的遗传稳定性；检测重组病毒(rWR)与野生型病毒(WR)感染Vero和HeLa细胞后的细胞病变、TCID50、报告基因表达，分析病毒的复制动力学。采用空斑法、qPCR法、双报告基因活性检测，评价ST-246作为阳性药物的体外抗病毒药效。【结果】 体外鉴定结果显示，Fluc和mCherry准确插入WR株的TK区域，感染Vero细胞后可检测到mCherry荧光及Fluc酶活性，空斑形态与野生型病毒一致，连续盲传12代病毒滴度保持稳定，并且双报告基因活性及E3L表达均可稳定检出，表明重组病毒rWR-Fluc/mCherry构建成功且遗传稳定；重组病毒感染Vero和HeLa细胞后的细胞病变、TCID50滴定、双报告基因活性检测均表明，感染后48−72 h达到复制高峰，与WR的复制动力学一致。采用重组病毒rWR-Fluc/mCherry测得ST-246的EC50与WR野生型病毒一致，多个检测方法(病毒蚀斑、DNA拷贝数、双报告基因活性) EC50结果(2−7 nmol/L之间)间均具有良好的一致性(相关系数r均大于0.500 0，P<0.05)。【结论】 成功构建了可同时表达Fluc与mCherry双报告基因且遗传稳定的重组痘苗病毒rWR-Fluc/mCherry，可应用于抗病毒药物体外快捷筛选及药效分析。